本發(fā)明為一種高危人乳頭瘤病毒分型檢測方法與試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

人乳頭瘤病毒（humanpapillomavirus,hpv）屬于乳頭瘤病毒科，是一種小分子的、無被膜包被的、環(huán)狀雙鏈dna病毒，基因組長約8000堿基對（bp），分為3個功能區(qū)，即早期轉(zhuǎn)錄區(qū)（e區(qū)）、晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)（l區(qū)）和非轉(zhuǎn)錄區(qū)（長控制區(qū)，lcr）。hpv通過直接或間接接觸污染物品或性傳播感染人類。該病毒不但具有宿主特異性，而且具有組織特異性，只能感染人的皮膚和粘膜上皮細(xì)胞，能引起人體皮膚黏膜的鱗狀上皮增殖，目前已分離出130多種引起人類皮膚的多種乳頭瘤或疣及生殖道上皮增生性損傷。不同的型別引起不同的臨床表現(xiàn)，根據(jù)侵犯的組織部位不同可分為：（1）皮膚低危型：包括hpv1、2、3、4、7、10、12、15等型與尋常疣、扁平疣、跖疣等相關(guān)；（2）皮膚高危型：包括hpv5、8、14、17、20、36、38型與疣狀表皮發(fā)育不良有關(guān)，其它還與可能hpv感染有關(guān)的惡性腫瘤有關(guān)，包括：外陰癌、陰莖癌、肛門癌、前列腺癌、膀胱癌；（3）黏膜低危型如hpv6、11、13、32、34、40、42、43、44、53、54等與感染生殖器、肛門、口咽部、食道黏膜相關(guān)；（4）黏膜高危型hpv16、18、30、31、33、35、39與宮頸癌、直腸癌、口腔癌、扁桃體癌等相關(guān)。

對于感染生殖道和肛門的hpv，根據(jù)各基因型別致病力大小或致癌危險性大小可分為低危型和高危型兩大類。在有性生活史的女性中生殖道hpv感染具有普遍性，據(jù)統(tǒng)計70%～80%的女性在其一生中會有至少一次的hpv感染，但大多數(shù)感染為自限性，超過90％的感染的女性會出現(xiàn)一種有效的免疫應(yīng)答，在沒有任何長期的健康干預(yù)時在6到24個月之間可以清除感染。而持續(xù)性的高危型hpv感染則是導(dǎo)致宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的主要原因。全球范圍的研究結(jié)果顯示，在99.7%的宮頸癌患者體內(nèi)檢測到高危型hpvdna的存在，其中hpv16型、18型、45型和31型感染占80%。低危型hpv一般與尖銳濕疣或低度鱗狀上皮內(nèi)病變相關(guān)，極少引起浸潤癌。依據(jù)who國際癌癥研究機構(gòu)（iarc）及其他國際組織的研究成果，國家食品藥品監(jiān)督管理局相關(guān)hpv檢測產(chǎn)品注冊指導(dǎo)原則建議將hpv16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68這13種基因型列為高危型別，26、53、66、73、82等5種基因型列為中等風(fēng)險型別。

高危hpv感染是宮頸癌的主要致病因素，99.7%宮頸癌患者存在高危型hpv感染。哈拉爾德?楚爾?豪森于1976年發(fā)現(xiàn)hpv是導(dǎo)致女性第二常見癌癥——宮頸癌的罪魁禍?zhǔn)住?995年，國際癌癥研究機構(gòu)討論確認(rèn)hpv感染是宮頸癌的主要原因，2005年，iarc/who推薦hpv檢測可以用于宮頸癌篩查。研究表明，hpv感染陽性者有15%～28%在2年內(nèi)進展為宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變，尤其是hpv16和18型感染危險性更高。由子宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變發(fā)展到浸潤癌大約需要10～20年的時間，現(xiàn)在所需年限正逐漸縮短。hpv感染率高低主要取決于年齡和性行為習(xí)慣，年輕性活躍的婦女感染率最高，可達40%。大部分婦女都是短暫性的hpv感染，通常在6-12個月消失，只有少數(shù)婦女會持續(xù)感染乃至最終發(fā)展成宮頸癌。多年來，國際上通用的宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的診斷主要遵循“三階梯式”診斷程序，即宮頸細(xì)胞學(xué)、陰道鏡及組織病理學(xué)檢查。宮頸細(xì)胞學(xué)檢查是普遍應(yīng)用的宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的篩查方法，可發(fā)現(xiàn)早期病變，但宮頸細(xì)胞學(xué)檢查存在其固有的局限性，并且對原位癌的檢出率較低。高危型hpv感染的檢測對于預(yù)防和早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌有非常重要的意義。

基于taqman探針技術(shù)的熒光定量pcr是融匯了pcr高敏感性、dna雜交技術(shù)高特異性和光譜技術(shù)高精確定量三大技術(shù)的一種新的檢測方法。taqman探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5’-末端，淬滅基團在探針3’-末端。當(dāng)探針完整及其與靶序列配對時，熒光基團發(fā)射的熒光因與3’-端的淬滅基團接近而被淬滅，無熒光信號產(chǎn)生。在進行pcr反應(yīng)延伸過程時，taqdna聚合酶的5'→3'外切核酸酶活性將探針降解，使得熒光基團與淬滅基團分離，即產(chǎn)生熒光信號。每經(jīng)歷一個pcr反應(yīng)循環(huán)，就有一分子的擴增產(chǎn)物生成，并伴隨著一分子的熒光信號的產(chǎn)生。隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加，釋放出來的熒光基團信號不斷積累，為一個指數(shù)同步增長的過程，熒光信號的強度就代表了擴增產(chǎn)物的拷貝數(shù)。該技術(shù)具有特異性強、自動化程度高等特點、有效解決了pcr污染等問題。單重探針實時定量pcr，因每條探針都是針對特異的靶位點設(shè)計，具有較高的特異性，每條探針只能檢測一種靶序列，如需檢測多種靶序列，需要加入多條探針，由于探針熒光標(biāo)記吸收波長因素的限制，基因序列檢測種類受到制約限制。

本發(fā)明提供一種高危人乳頭瘤病毒分型檢測方法與試劑盒，該方法采用多條同源上游引物、多條同源下游引物以及多條探針的方法，即在上下游引物設(shè)計位點，設(shè)計多條同源引物覆蓋擴增更多的同源序列，多條探針標(biāo)記可標(biāo)記相同的熒光發(fā)光基團，在熒光擴增后結(jié)合熔解曲線進行多型別hpv分型。根據(jù)taqman引物探針設(shè)計原則，選擇在人乳頭瘤病毒基因組的l1段序列作為靶位點設(shè)計通用擴增引物和人乳頭瘤病毒特異性的taqman探針，根據(jù)taqman探針序列設(shè)計與其不完全互補的雜交探針——pco（partiallycomplementaryoligonucleotide，部分互補序列），雜交探針目的用于擴增后產(chǎn)物熔解曲線分析，雜交探針的3’端可根據(jù)目的進行熒光淬滅基團標(biāo)記（即blackholequencher，縮寫bhq，包括bhq1、bhq2、bhq3等）或者磷酸化基團（phosphate，pho）標(biāo)記，雜交探針標(biāo)記后3’端不能再延伸。同時提供一種人乳頭瘤病毒核酸分型檢測試劑盒，通過熒光pcr擴增結(jié)合單波長熔解曲線分析鑒別hpv16、18、31、52、59型。本發(fā)明還引入內(nèi)源性的內(nèi)參照系統(tǒng)，用于監(jiān)測樣本取樣質(zhì)量以避免檢測結(jié)果的假陰性。和現(xiàn)有人乳頭瘤病毒核酸分型檢測公開技術(shù)比較，本發(fā)明的檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠，試劑盒使用方便，檢測靈敏度高，單個波長進行熒光pcr反應(yīng)即可鑒別更多的hpv基因亞型。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種高危人乳頭瘤病毒分型檢測方法，另一目的是提供一種hpv16、18、31、52、59型分型檢測試劑盒。

本發(fā)明在markusschmitt等人（jclinmicrobiol,2008,46(3):1050–1059）設(shè)計的通用引物bsgp5+/6+(bs)基礎(chǔ)上，綜合考慮試劑盒所覆蓋檢測的高危hpv型別以及熒光pcr擴增退火溫度較高的特點，設(shè)計適合本試劑盒的通用引物序列seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9。

本發(fā)明中hpv16、18、31、52、59型檢測基于l1基因，優(yōu)選的靶序列分別為：seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14，并根據(jù)靶序列設(shè)計hpv16、18、31、52、59型特異性探針序列分別為：seqidno.15、seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18、seqidno.19，taqman探針5’端均標(biāo)記相同的熒光基團標(biāo)記（fam、vic/joe/hex、rox或者cy5），3’端均標(biāo)記相同的bhq2淬滅基團。

在本發(fā)明中，根據(jù)taqman探針的互補序列進行pco雜交探針設(shè)計，pco雜交探針設(shè)計原則為：(1)序列與相應(yīng)的taqman探針序列不完全互補（一般有3-6個堿基的錯配）；(2)不同的taqman探針可以與同一條pco探針雜交進行熔解曲線分析；(3)pco探針3’端必須進行標(biāo)記封閉，防止pco探針3’端延伸，3’端標(biāo)記的淬滅基團可以為bhq1、bhq2、bhq3、pho等；(4)pco探針設(shè)計完成后需對其進行熔解曲線模擬分析tm值。根據(jù)hpv特異性探針序列設(shè)計出三條pco探針，pco探針序列分別為：seqidno.20、seqidno.21、seqidno.22，其中序列seqidno.203’端以pho標(biāo)記修飾封閉，seqidno.21、seqidno.223’端以bhq2淬滅基團修飾封閉。

本發(fā)明還提供一種人內(nèi)源性內(nèi)參照系統(tǒng)，內(nèi)參引物為seqidno.23、seqidno.24，內(nèi)參探針為seqidno.25，內(nèi)參探針5’端均標(biāo)記與hpv目的檢測探針不同的熒光基團標(biāo)記（fam、vic/joe/hex、rox或者cy5），3’端標(biāo)記bhq2淬滅基團。

本發(fā)明提供一種hpv16、18、31、52、59型分型檢測試劑盒，采用熒光pcr結(jié)合熔解曲線技術(shù)對高危人乳頭瘤病毒16、18、31、52、59型進行核酸定性檢測。在使用上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司生產(chǎn)的磁珠法純化試劑（核酸提取及純化試劑（產(chǎn)品型號：拭子dna））對宮頸脫落細(xì)胞樣本進行全自動核酸提取后，直接配制反應(yīng)體系進行擴增，并通過熔解曲線進行結(jié)果分型分析，反應(yīng)體系配制方便，pcr產(chǎn)物無需開蓋分析，通過單波長的熔解曲線分析即可區(qū)分5種高危型別，并且體系中引入了dutp-ung酶系統(tǒng)防止pcr產(chǎn)物污染。

本發(fā)明提供了一種通過熒光pcr擴增并結(jié)合單波長熔解曲線分析檢測多種高危hpv亞型的方法，同時提供了一種高危人乳頭瘤病毒16、18、31、52、59型分型檢測試劑盒。

1.實時熒光pcr引物的設(shè)計

通過對文獻檢索確定：在markusschmitt等人設(shè)計的通用引物bsgp5+/6+(bs)基礎(chǔ)上進行引物優(yōu)化設(shè)計。熒光pcr擴增檢測技術(shù)中引物設(shè)計的規(guī)則為：(1)避免引物自身或引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)；(2)典型的引物18-24個核苷酸長，引物需足夠長，保證序列獨特性,并降低非特異性；(3)tm值在55-65℃，gc含量在40%-60%；(4)引物之間的tm值避免相差2℃；(5)引物的3’端避免使用堿基a，引物3’端避免出現(xiàn)3個或者3個以上連續(xù)相同的堿基；(6)taqman探針技術(shù)要求片段長度在50-250bp之間；(7)引物末端(最后5個核苷酸)不能有超過2個的g和c。

按照taqman熒光pcr設(shè)計的原則，基于bsgp5+/6+(bs)通用引物組的基礎(chǔ)設(shè)計出本發(fā)明hpv擴增通用引物：seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4、seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7、seqidno.8、seqidno.9，具體序列如下：

上游引物為：

5’-caactatttgttactgttgttgatactac-3’如seqidno.1所示；

5’-caattatttgttactgtggtagataccac-3’如seqidno.2所示；

5’-cagttgtttgtcacagttgtggataccac-3’如seqidno.3所示；

5’-caattgtttttaacagttgtagatcctac-3’，如seqidno.4所示；

下游引物為：

5’-gaaatataaactgcaaatcaaattcctc-3’，如seqidno.5所示；

5’-gaaaaataaattgtaaatcaaattcctc-3’，如seqidno.6所示；

5’-gaaatataaattgtaaatcaaattcctc-3’，如seqidno.7所示；

5’-gaaaaataaactgcaaatcatattcctc-3’，如seqidno.8所示；

5’-gaaaaataaactgtaaatcatattcctc-3’，如seqidno.9所示。

2.hpv分型探針的設(shè)計

taqman探針設(shè)計原則為：(1)探針長度應(yīng)在15bp-45bp(最好20-30bp)，保證結(jié)合特異性；(2)探針的dna折疊和二級結(jié)構(gòu)盡量避開；(3)tm值在65-70℃,通常比引物tm值高5-10℃(至少5℃)，以確保在退火過程中探針先于引物與目的片段結(jié)合，gc含量在40%-60%；(4)探針的5’端盡量避免使用g鳥嘌呤；(5)整條探針中堿基c的含量要明顯高于g含量。hpv16、18、31、52、59型特異性探針分別以基因組l1片段序列設(shè)計，l1片段分別為：seqidno.10、seqidno.11、seqidno.12、seqidno.13、seqidno.14，根據(jù)l1片段設(shè)計的taqman探針序列分別為：seqidno.15、seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18、seqidno.19。

hpv16型探針序列為：

5’-tgctgccatatctacttcagaaactacatataa-3’，5’端標(biāo)記fam(6-羧基熒光素)，3’端標(biāo)記bhq2，如seqidno.15所示。

hpv18型探針序列為：

5’-tgcttctacacagtctcctgtacctggg-3’，5’端標(biāo)記fam，3’端標(biāo)記bhq2，如seqidno.16所示。

hpv31型探針序列為：

5’-tgctgcaattgcaaacagtgatactacatttaa-3’，5’端標(biāo)記fam，3’端標(biāo)記bhq2，如seqidno.17所示。

hpv52型探針序列為：

5’-tgctgaggttaaaaaggaaagcacatataa-3’，5’端標(biāo)記fam，3’端標(biāo)記bhq2，如seqidno.18所示。

hpv59型探針序列為：

5’-tgcttctactacttcttctattcctaatgtac-3’，5’端標(biāo)記fam，3’端標(biāo)記bhq2，如seqidno.19所示。

3.hpvpco探針的設(shè)計及驗證

本發(fā)明的提供一種pco探針序列設(shè)計方法，pco探針是一種與靶序列不完全匹配的探針，設(shè)計目的是為了在熔解曲線分析中區(qū)分不同的靶核酸序列，且一條pco探針可以區(qū)分多條靶核酸序列。根據(jù)seqidno.15、seqidno.16、seqidno.17、seqidno.18、seqidno.19探針的互補序列設(shè)計pco探針，以taqman探針seqidno.18為例設(shè)計其pco探針：

seqidno.18序列：5’-tgctgccatatctacttcagaaactacatataa-3’

其互補序列為：5’-ttatatgtagtttctgaagtagatatggcagca-3’

在其互補序列基礎(chǔ)上設(shè)計5個堿基錯配，經(jīng)過設(shè)計錯配的互補序列為：5’-ttatatgtagtttcagatgtaaatatgcgagca-3’，3’端標(biāo)記bhq2淬滅基團，如seqidno.21所示。

seqidno.18序列（5’--->3’方向）與seqidno.21序列（3’--->5’方向）互補情況如下：

seqidno.21探針序列設(shè)計完成之后進行模擬探針雜交熔解曲線分析，模擬分析結(jié)果見附圖1，再通過實驗室或者第三方引物探針合成服務(wù)公司合成引物探針，進行實驗驗證，驗證結(jié)果見附圖2。以同樣的方法設(shè)計pco探針seqidno.20和seqidno.22，序列如下：

5’-ttatatgtagtatcactgttagctatcgcagca-3’，3’端標(biāo)記pho，如seqidno.20所示；

5’-gtatatatttggtacaggagactctgtagagg-3’，3’端標(biāo)記bhq2，如seqidno.22所示；

seqidno.20探針分別與seqidno.15探針和seqidno.17探針雜交互補，seqidno.22探針分別與seqidno.16探針和seqidno.19探針互補。

hpv16、18、31、52、59型的taqman探針分別與各自的pco探針熔解曲線分析，結(jié)果分別見圖3、4、5、2、6，之后混合到一管中進行熒光pcr擴增結(jié)合單波長熔解曲線分析驗證，結(jié)果見圖7～圖11。

4.內(nèi)參照系統(tǒng)設(shè)計

本發(fā)明中按taqman探針熒光pcr原則設(shè)計了內(nèi)源性內(nèi)參照系統(tǒng)，用于監(jiān)測樣本的取樣、提取和擴增，避免檢測結(jié)果假陰性，內(nèi)參照系統(tǒng)包括內(nèi)參引物和探針，根據(jù)taqman熒光pcr設(shè)計原則，設(shè)計的引物和探針序列如下：

5’-ctaagcagaactcttccccat-3’，如seqidno.23所示；

5’-ctcagccagtcctccacat-3’，如seqidno.24所示；

5’-tctgcctatggcttgaccaggcag-3’，5’端標(biāo)記cy5熒光基團，3’端標(biāo)記bhq2，如seqidno.25所示。

5.試劑盒制備

含有上述引物和探針的人乳頭瘤病毒16、18、31、52、59型核酸分型檢測試劑盒(熒光pcr法)(32人份)，其主要組分如下：

(1)pcr緩沖液，288μl

配制方法：在14.2ml超純水中依次加入10*pcrbuffer（含100mmph8.3的tris-hcl、500mmkcl）30.0ml，5mmdntps（包括datp、dgtp、dctp、dutp）各12ml，0.05mol/lmgcl233ml，10mg/mlbsa0.8ml，振蕩混勻，終體積為90.0ml，以288μl/管分裝后即為試劑盒中pcr緩沖液。

(2)引物探針，256μl

配制方法：在76.31ml滅菌超純水中分別加入156μl200pmol/μl引物seqidno.1，156μl200pmol/μl引物seqidno.2，156μl200pmol/μl引物seqidno.3，156μl200pmol/μl引物seqidno.4，156μl200pmol/μl引物seqidno.5，156μl200pmol/μl引物seqidno.6，156μl200pmol/μl引物seqidno.7，156μl200pmol/μl引物seqidno.8，156μl200pmol/μl引物seqidno.9，112.5μl200pmol/μl引物seqidno.15，139.5μl200pmol/μl引物seqidno.16，84μl200pmol/μl引物seqidno.17，97.5μl200pmol/μl引物seqidno.18，84μl200pmol/μl引物seqidno.19，555μl200pmol/μl引物seqidno.20，284.8μl200pmol/μl引物seqidno.21，474μl200pmol/μl引物seqidno.22，60μl200pmol/μl引物seqidno.23，90μl200pmol/μl引物seqidno.24，300μl200pmol/μl引物seqidno.25，震蕩混勻后以256μl/管分裝，即為試劑盒中引物探針。

(3)dna聚合酶，96μl

配制方法：在24.8ml酶稀釋液（從上海宏誼生物技術(shù)有限公司外購）中加入taq-dna聚合酶（5u/μl）1.5ml和ung酶（1u/μl）3.7ml，顛倒多次混勻，終體積為30.0ml，以96μl/管分裝即為試劑盒dna聚合酶。

(4)陰性對照，400μl

用含有0.9%nacl，1mmol/ledta，10mmol/ltris-hcl和0.1%tritonx-100的緩沖液稀釋正常人類基因組dna至10ng/ml，以400μl/管分裝即為陰性對照。

(5)陽性對照和臨界陽性對照，各400μl

用含有0.9%nacl，1mmol/ledta，10mmol/ltris-hcl、0.1%tritonx-100和10ng/ml正常人類基因組dna的緩沖液分別稀釋hpv陽性質(zhì)粒至10⁴copies/μl、10²copies/μl，旋渦震蕩混勻10分鐘，以400μl/管分裝后即為陽性對照和臨界陽性對照。

將上述組分(1)～(5)分別進行抽檢，檢驗合格后進行包裝。

上述組裝的試劑盒在-20℃保存，凍融次數(shù)應(yīng)小于3次。

由(1)～(3)及模板配制的30μl反應(yīng)體系，每個反應(yīng)中加入pcr緩沖液9μl、引物探針8μl以及dna聚合酶3μl，或者按比例配制公共體系后以20μl/反應(yīng)進行分裝，分裝后每管中加入10μl提取的核酸樣本。

3.試劑盒使用方法

本發(fā)明試劑盒在樣本檢測過程中使用方法之一如下：

(1)樣本提取

取臨床采集的宮頸脫落細(xì)胞樣本，吸取含有宮頸脫落細(xì)胞的細(xì)胞保存液200μl置于上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司生產(chǎn)的磁珠法純化試劑（核酸提取及純化試劑（產(chǎn)品型號：拭子dna））96孔核酸提取板的a1-h1、a7-h7孔中，按照提取試劑盒說明書的要求設(shè)置自動提取程序進行核酸提取，提取板的a5-h5、a11-h11孔為提取的核酸用于熒光pcr擴增檢測。試劑盒陰性、臨界陽性對照和陽性對照處理方法和樣品液相同。

(2)擴增檢測

按照發(fā)明內(nèi)容中的方法，啟封試劑盒，將各組分凍融振蕩混勻后配制反應(yīng)預(yù)混液，其配制方法如下：

a按反應(yīng)樣本數(shù)（反應(yīng)樣本數(shù)＝待檢樣品數(shù)＋對照品3個＋1）n配制反應(yīng)液：取pcr反應(yīng)液n×9μl、引物探針n×8μl、dna聚合酶n×3μl于一離心管中混勻；低速離心數(shù)秒，按20μl/管分裝到反應(yīng)管中，再分別加入10μl提取待檢測的核酸。

b取樣本提取物、對照品提取物各10μl分別加入反應(yīng)管中，低速離心數(shù)秒，取出置全自動熒光pcr儀上。

c熒光pcr反應(yīng)程序如下：

[1]50℃2min

[2]95℃3min

[3]95℃6s

[4]66℃45s

[5]goto[3]，9cycles

[6]95℃3s

[7]60℃33s

[8]63℃15s

[9]goto[6]，42cycles

在第[7]步采集fam和cy5通道熒光信號

[10]95℃15s

[11]25℃1min

[12]25℃——75℃熔解曲線分析

[13]75℃15s

[14]end。

注：rochelightcycler480熒光pcr儀上反應(yīng)程序具體參數(shù)設(shè)置要求如下：

1)檢測模式選擇“multicolorhydrolysisprobe”，且同時選擇fam及cy5通道；

2)擴增及熒光采集步驟，選擇在60℃采集熒光；

3)熔解曲線步驟，熔解溫度范圍25～75℃，其中參數(shù)“raperate（℃/s）”選擇0.03，“acquisitions(per℃)”選擇5，并且連續(xù)采集fam及cy5通道的熒光。

d儀器pcr程序運行完成后按儀器及軟件要求進行結(jié)果保存和數(shù)據(jù)分析。對照圖7-11進行熔解曲線分型分析。

cy5通道檢測結(jié)果應(yīng)符合下表要求：32<ctcy5

4.有益效果

本發(fā)明根據(jù)在markusschmitt等人設(shè)計的通用引物bsgp5+/6+(bs)基礎(chǔ)上進行引物優(yōu)化設(shè)計，設(shè)計適合本試劑盒的引物組合，在人乳頭瘤病毒特異的taqman探針的互補序列基礎(chǔ)上設(shè)計pco探針，通過模擬驗證和實驗驗證，最后組研制出人乳頭瘤病毒16、18、31、52、59型核酸分型檢測試劑盒(熒光pcr法)，其主要特點如下：

(1)采用人乳頭瘤病毒保守l1片段序列，根據(jù)文獻報道優(yōu)化設(shè)計引物。

(2)根據(jù)taqman探針的互補序列設(shè)計pco探針，根據(jù)pco探針和taqman探針進行熔解曲線分析進行分型檢測hpv16、18、31、52、59型核酸，以相同熒光標(biāo)記的taqman探針單管單波長定性檢測不同hpv型別，試劑盒檢測靈敏度高，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

(2)引入內(nèi)源性內(nèi)參照系統(tǒng)，可以監(jiān)測提取和擴增整個過程，可以盡可能的避免假陽性和假陰性結(jié)果。

(3)擴增體系中的dutp-ung酶系統(tǒng)更進一步避免了因擴增產(chǎn)物污染導(dǎo)致的結(jié)果假陽性。

本發(fā)明方法原理是基于taqman水解探針熒光pcr原理，結(jié)合探針雜交熔解曲線分析技術(shù)，以人乳頭瘤病毒l1段基因序列為靶序列，采用相同熒光標(biāo)記的hpv16、18、31、52、59型特異的探針，經(jīng)熒光pcr擴增結(jié)合熔解曲線分析，可快速、準(zhǔn)確的判斷hpv16、18、31、52、59型核酸有無并進行分型鑒別。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進行說明。

圖1seqidno.18探針與seqidno.21探針在終濃度分別為0.1mm、0.2mm，na⁺濃度0.1m，mg²⁺濃度為4.5mm條件下模擬熔解曲線結(jié)果。模擬結(jié)果為：tm(conc)61.8°c，δg12.9kcal/mol，δh123.5kcal/mol，δs374.6cal/mol/k，tm(cp)61.8°c，tm(ext1)60.1°c，tm(ext2)58.4°c。

圖2seqidno.18探針與seqidno.21探針進行復(fù)孔熔解曲線試驗分析。

圖3seqidno.15探針與seqidno.20探針進行復(fù)孔熔解曲線試驗分析。

圖4seqidno.16探針與seqidno.22探針進行復(fù)孔熔解曲線試驗分析。

圖5seqidno.17探針與seqidno.20探針進行復(fù)孔熔解曲線試驗分析。

圖6seqidno.19探針與seqidno.22探針進行復(fù)孔熔解曲線試驗分析。

圖7a為引物探針混合后復(fù)孔進行熔解曲線分析。

圖7b為試劑盒hpv16型熔解曲線分型結(jié)果，圓圈位置標(biāo)示曲線為hpv16型特征峰。

圖8hpv18型熔解曲線分型結(jié)果，圓圈位置標(biāo)示曲線為hpv18型特征峰。

圖9hpv31型熔解曲線分型結(jié)果，圓圈位置標(biāo)示曲線為hpv31型特征峰。

圖10hpv52型熔解曲線分型結(jié)果，圓圈位置標(biāo)示曲線為hpv52型特征峰。

圖11hpv59型熔解曲線分型結(jié)果，圓圈位置標(biāo)示曲線為hpv59型特征峰。

具體實施方式

以下為該發(fā)明結(jié)合具體的實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過技術(shù)常識對本發(fā)明作各種技術(shù)性改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實施例1人乳頭瘤病毒16、18、31、52、59型核酸分型檢測試劑盒(熒光pcr法)

1.引物探針合成

委托英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成引物探針，合成的引物探針序列具體如下：

上游引物為：

5’-caactatttgttactgttgttgatactac-3’如seqidno.1所示；

5’-caattatttgttactgtggtagataccac-3’如seqidno.2所示；

5’-cagttgtttgtcacagttgtggataccac-3’如seqidno.3所示；

5’-caattgtttttaacagttgtagatcctac-3’，如seqidno.4所示；

下游引物為：

5’-gaaatataaactgcaaatcaaattcctc-3’，如seqidno.5所示；

5’-gaaaaataaattgtaaatcaaattcctc-3’，如seqidno.6所示；

5’-gaaatataaattgtaaatcaaattcctc-3’，如seqidno.7所示；

5’-gaaaaataaactgcaaatcatattcctc-3’，如seqidno.8所示；

5’-gaaaaataaactgtaaatcatattcctc-3’，如seqidno.9所示。

taqman探針序列為：

5’-tgctgccatatctacttcagaaactacatataa-3’，5’端標(biāo)記fam，3’端標(biāo)記bhq2，如seqidno.15所示。

5’-tgcttctacacagtctcctgtacctggg-3’，5’端標(biāo)記fam，3’端標(biāo)記bhq2，如seqidno.16所示。

5’-tgctgcaattgcaaacagtgatactacatttaa-3’，5’端標(biāo)記fam，3’端標(biāo)記bhq2，如seqidno.17所示。

5’-tgctgaggttaaaaaggaaagcacatataa-3’，5’端標(biāo)記fam，3’端標(biāo)記bhq2，如seqidno.18所示。

5’-tgcttctactacttcttctattcctaatgtac-3’，5’端標(biāo)記fam，3’端標(biāo)記bhq2，如seqidno.19所示。

pco探針序列為：

5’-ttatatgtagtatcactgttagctatcgcagca-3’，3’端標(biāo)記pho，如seqidno.20所示。

5’-ttatatgtagtttcagatgtaaatatgcgagca-3’，如3’端標(biāo)記bhq2淬滅基團，如seqidno.21所示。

5’-gtatatatttggtacaggagactctgtagagg-3’，3’端標(biāo)記bhq2，如seqidno.22所示。

合成后用無菌雙蒸水溶解至濃度為200μm或者500μm，-20℃保存。

2.pcr緩沖液，288μl

配制方法：在14.2ml超純水中依次加入10*pcrbuffer（含100mmph8.3的tris-hcl、500mmkcl）30.0ml，5mmdntps（包括datp、dgtp、dctp、dutp）各12ml，0.05mol/lmgcl233ml，10mg/mlbsa0.8ml，振蕩混勻，終體積為90.0ml，以288μl/管分裝后即為試劑盒中pcr緩沖液。

3.引物探針，256μl

配制方法：在76.31ml滅菌超純水中分別加入156μl200pmol/μl引物seqidno.1，156μl200pmol/μl引物seqidno.2，156μl200pmol/μl引物seqidno.3，156μl200pmol/μl引物seqidno.4，156μl200pmol/μl引物seqidno.5，156μl200pmol/μl引物seqidno.6，156μl200pmol/μl引物seqidno.7，156μl200pmol/μl引物seqidno.8，156μl200pmol/μl引物seqidno.9，112.5μl200pmol/μl引物seqidno.15，139.5μl200pmol/μl引物seqidno.16，84μl200pmol/μl引物seqidno.17，97.5μl200pmol/μl引物seqidno.18，84μl200pmol/μl引物seqidno.19，555μl200pmol/μl引物seqidno.20，284.8μl200pmol/μl引物seqidno.21，474μl200pmol/μl引物seqidno.22，60μl200pmol/μl引物seqidno.23，90μl200pmol/μl引物seqidno.24，300μl200pmol/μl引物seqidno.25，震蕩混勻后以256μl/管分裝，即為試劑盒中引物探針。

4.dna聚合酶，96μl

配制方法：在24.8ml酶稀釋液（從上海宏誼生物技術(shù)有限公司外購）中加入taq-dna聚合酶（5u/μl）1.5ml和ung酶（1u/μl）3.7ml，顛倒多次混勻，終體積為30.0ml，以96μl/管分裝即為試劑盒dna聚合酶。

5.陰性對照，400μl

用含有0.9%nacl，1mmol/ledta,10mmol/ltris-hcl和0.1%tritonx-100的緩沖液稀釋正常人類基因組dna至10ng/ml，以400μl/管分裝即為陰性對照。

6.陽性對照和臨界陽性對照各400μl

用含有0.9%nacl，1mmol/ledta,10mmol/ltris-hcl、0.1%tritonx-100和10ng/ml正常人類基因組dna的緩沖液分別稀釋hpv陽性質(zhì)粒至10⁴copies/μl、10²copies/μl，旋渦震蕩混勻10分鐘，以400μl/管分裝后即為陽性對照和臨界陽性對照。

將上述組分2-6分別進行抽樣檢驗，檢驗合格后進行包裝。

上述組裝的試劑盒在-20℃保存，凍融次數(shù)應(yīng)小于3次。

試劑盒制備工藝簡述如下：

(1)合成的引物探針定量配制、濃度檢測、抽樣質(zhì)檢。

(2)將pcr緩沖液、taq酶、核酸提取液、內(nèi)參照無菌分裝，抽樣質(zhì)檢。

(3)將陰性、陽性對照品進行濃度測定、分裝，抽樣質(zhì)檢。

(4)組裝成品試劑盒，保存于-20℃。

實施例2人乳頭瘤病毒16、18、31、52、59型核酸分型檢測試劑盒(熒光pcr法)的應(yīng)用

采用本發(fā)明所得試劑盒對20例臨床樣本進行測試，同時用艾康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的人乳頭瘤病毒基因分型（25型）檢測試劑盒（pcr-反向點雜交法）進行平行對比試驗，評價試劑盒效果。

1.人乳頭瘤病毒16、18、31、52、59型核酸分型檢測試劑盒(熒光pcr法)檢測臨床樣本

(1)試劑配制

按樣本數(shù)n（樣本數(shù)=待檢樣本數(shù)+對照品3個+1）配制反應(yīng)液：

取pcr緩沖液n×9μl、酶混合液n×3μl、引物探針n×8μl于一離心管中混勻；低速離心數(shù)秒，按20μl/管分裝到反應(yīng)管中。分裝后反應(yīng)管可在2～8℃放置3小時。

(2)核酸提取

將取樣管中的宮頸刷充分振蕩洗滌，取400μl洗滌液，采用上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司生產(chǎn)的磁珠法純化試劑（核酸提取及純化試劑（產(chǎn)品型號：拭子dna））進行核酸提取。

核酸提取完成后，核酸提取液用于pcr檢測，或?qū)⒑怂崽崛∫恨D(zhuǎn)移到離心管中于-20℃保存。

(3)樣本及對照品加樣

取陰性對照、陽性對照、臨界陽性對照以及待檢樣本核酸提取液各10μl分別加入反應(yīng)管中，低速離心數(shù)秒，取出置實時熒光定量pcr儀上。

(4)pcr擴增及熔解曲線分析

將pcr擴增管按順序放入pcr儀，設(shè)置如下圖的反應(yīng)程序

[1]50℃2min

[2]95℃3min

[3]95℃6s

[4]66℃45s

[5]goto[3]，9cycles

[6]95℃3s

[7]60℃33s

[8]63℃15s

[9]goto[6]，42cycles

在第[7]步采集fam和cy5通道熒光信號

[10]95℃15s

[11]25℃1min

[12]25℃——75℃熔解曲線分析

[13]75℃15s

[14]end。

注：rochelightcycler480熒光pcr儀上反應(yīng)程序具體參數(shù)設(shè)置要求如下：

1）檢測模式選擇“multicolorhydrolysisprobe”，且同時選擇fam及cy5通道；

2）擴增及熒光采集步驟，選擇在60℃采集熒光；

3）熔解曲線步驟，熔解溫度范圍25～75℃，其中參數(shù)“raperate（℃/s）”選擇0.03，“acquisitions(per℃)”選擇5，并且連續(xù)采集fam及cy5通道的熒光。

2.人乳頭瘤病毒基因分型（25型）檢測試劑盒（pcr-反向點雜交法）檢測臨床樣本

臨床操作方法見艾康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的人乳頭瘤病毒基因分型（25型）檢測試劑盒（pcr-反向點雜交法）說明書。

3.結(jié)果分析

對比人乳頭瘤病毒16、18、31、52、59型核酸分型檢測試劑盒(熒光pcr法)和人乳頭瘤病毒基因分型（25型）檢測試劑盒（pcr-反向點雜交法）檢測20例臨床樣本結(jié)果，檢測結(jié)果顯示兩種試劑盒對hpv16、18、31、52、59型的分型結(jié)果相同，采用本發(fā)明試劑盒具有操作步驟少、檢測時間短的優(yōu)點。

sequencelisting

<110>上海星耀醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司

<120>一種高危人乳頭瘤病毒分型檢測方法與試劑盒

<160>25

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>29

<212>dna

<213>artifical

<220>

<221>seqidno.1

<222>(1)..(29)

<400>1

caactatttgttactgttgttgatactac29

<210>2

<211>29

<212>dna

<213>artifical

<220>

<221>seqidno.2

<222>(1)..(29)

<400>2

caattatttgttactgtggtagataccac29

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<211>29

<212>dna

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<220>

<221>seqidno.3

<222>(1)..(29)

<400>3

cagttgtttgtcacagttgtggataccac29

<210>4

<211>29

<212>dna

<213>artifical

<220>

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<222>(1)..(29)

<400>4

caattgtttttaacagttgtagatcctac29

<210>5

<211>28

<212>dna

<213>artifical

<220>

<221>seqidno.5

<222>(1)..(28)

<400>5

gaaatataaactgcaaatcaaattcctc28

<210>6

<211>28

<212>dna

<213>artifical

<220>

<221>seqidno.6

<222>(1)..(28)

<400>6

gaaaaataaattgtaaatcaaattcctc28

<210>7

<211>28

<212>dna

<213>artifical

<220>

<221>seqidno.7

<222>(1)..(28)

<400>7

gaaatataaattgtaaatcaaattcctc28

<210>8

<211>28

<212>dna

<213>artifical

<220>

<221>seqidno.8

<222>(1)..(28)

<400>8

gaaaaataaactgcaaatcatattcctc28

<210>9

<211>28

<212>dna

<213>artifical

<220>

<221>seqidno.9

<222>(1)..(28)

<400>9

gaaaaataaactgtaaatcatattcctc28

<210>10

<211>277

<212>dna

<213>humanpapillomavirustype16

<220>

<221>seqidno.10

<222>(1)..(277)

<400>10

ctgatgcccaaatattcaataaaccttattggttacaacgagcacagggccacaataatg60

gcatttgttggggtaaccaactatttgttactgttgttgatactacacgcagtacaaata120

tgtcattatgtgctgccatatctacttcagaaactacatataaaaatactaactttaagg180

agtacctacgacatggggaggaatatgatttacagtttatttttcaactgtgcaaaataa240

ccttaactgcagacgttatgacatacatacattctat277

<210>11

<211>281

<212>dna

<213>humanpapillomavirustype18

<220>

<221>seqidno.11

<222>(1)..(281)

<400>11

gctctattgttacctctgactcccagttgtttaataaaccatattggttacataaggcac60

agggtcataacaatggtgtttgctggcataatcaattatttgttactgtggtagatacca120

ctcccagtaccaatttaacaatatgtgcttctacacagtctcctgtacctgggcaatatg180

atgctaccaaatttaagcagtatagcagacatgttgaggaatatgatttgcagtttattt240

ttcagttgtgtactattactttaactgcagatgttatgtcc281

<210>12

<211>259

<212>dna

<213>humanpapillomavirustype31

<220>

<221>seqidno.12

<222>(1)..(259)

<400>12

caaatttttaataaaccatattggatgcaacgtgctcagggacacaataatggtatttgt60

tggggcaatcagttatttgttactgtggtagataccacacgtagtaccaatatgtctgtt120

tgtgctgcaattgcaaacagtgatactacatttaaaagtagtaattttaaagagtattta180

agacatggtgaggaatttgatttacaatttatatttcagttatgcaaaataacattatct240

gcagacataatgacatata259

<210>13

<211>262

<212>dna

<213>humanpapillomavirustype52

<220>

<221>seqidno.13

<222>(1)..(262)

<400>13

aaaccgtactggttacaacgtgcgcagggccacaataatggcatatgttggggcaatcag60

ttgtttgtcacagttgtggataccactcgtagcactaacatgactttatgtgctgaggtt120

aaaaaggaaagcacatataaaaatgaaaattttaaggaataccttcgtcatggcgaggaa180

tttgatttacaatttatttttcaattgtgcaaaattacattaacagctgatgttatgaca240

tacattcataagatggatgcca262

<210>14

<211>308

<212>dna

<213>humanpapillomavirustype59

<220>

<221>seqidno.14

<222>(1)..(308)

<400>14

atttaataaaccatattggctgcacaaggctcagggtttaaacaatggtatatgttggca60

caatcaattgtttttaacagttgtagatcctactcgcagcaccaatctttctgtgtgtgc120

ttctactacttcttctattcctaatgtacacacacctaccagttttaaagaatatgccag180

acatgtggaggaatttgatttgcagtttatatttcaactgtgtaaaataacattaactac240

agaggtaatgtcatacattcataatatgaataccactattttggaggattggaattttgg300

tgttacac308

<210>15

<211>35

<212>dna

<213>artifical

<220>

<221>seqidno.15

<222>(2)..(34)

<223>b=fam,d=bhq2

<400>15

btgctgccatatctacttcagaaactacatataad35

<210>16

<211>30

<212>dna

<213>artifical

<220>

<221>seqidno.16

<222>(2)..(29)

<223>b=fam,d=bhq2

<400>16

btgcttctacacagtctcctgtacctgggd30

<210>17

<211>35

<212>dna

<213>artifical

<220>

<221>seqidno.17

<222>(2)..(34)

<223>b=fam,d=bhq2

<400>17

btgctgcaattgcaaacagtgatactacatttaad35

<210>18

<211>32

<212>dna

<213>artifical

<220>

<221>seqidno.18

<222>(2)..(31)

<223>b=fam,d=bhq2

<400>18

btgctgaggttaaaaaggaaagcacatataad32

<210>19

<211>34

<212>dna

<213>artifical

<220>

<221>seqidno.19

<222>(2)..(33)

<223>b=fam,d=bhq2

<400>19

btgcttctactacttcttctattcctaatgtacd34

<210>20

<211>34

<212>dna

<213>artifical

<220>

<221>seqidno.20

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<223>d=pho

<400>20

ttatatgtagtatcactgttagctatcgcagcad34

<210>21

<211>34

<212>dna

<213>artifical

<220>

<221>seqidno.21

<222>(1)..(33)

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<400>21

ttatatgtagtttcagatgtaaatatgcgagcad34

<210>22

<211>33

<212>dna

<213>artifical

<220>

<221>seqidno.22

<222>(1)..(32)

<223>d=bhq2

<400>22

gtatatatttggtacaggagactctgtagaggd33

<210>23

<211>21

<212>dna

<213>artifical

<220>

<221>seqidno.23

<222>(1)..(21)

<400>23

ctaagcagaactcttccccat21

<210>24

<211>19

<212>dna

<213>artifical

<220>

<221>seqidno.24

<222>(1)..(19)

<400>24

ctcagccagtcctccacat19

<210>25

<211>26

<212>dna

<213>artifical

<220>

<221>seqidno.25

<222>(2)..(25)

<223>b=cy5,d=bhq2

<400>25

btctgcctatggcttgaccaggcagd26