本發(fā)明屬于分子生物學領域，尤其涉及一種可異位展示兩種多肽的噬菌體雙展示載體。

背景技術：

1985年密蘇里大學George Smith博士開創(chuàng)了著名的噬菌體展示技術，經過近三十年的研究該技術也被不斷地完善。噬菌體展示技術是指通過基因工程技術將外源多肽或蛋白的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，重組的噬菌體基因組進入宿主菌以后利用宿主菌的表達體系，使外源多肽或蛋白和噬菌體外殼蛋白以融合蛋白的方式表達，并在噬菌體自組裝過程將外源多肽或蛋白展示到噬菌體外殼上。被展示在噬菌體外殼上的的外源多肽和蛋白因為空間位阻較小，所以能保持相對獨立的空間結構和生物活性?；谝陨蟽?yōu)勢噬菌體基因工程化被廣泛應用于靶向篩選、確定抗原表位，研制多肽和蛋白藥物，探索蛋白受體和配體作用，蛋白質-DNA相互作用和遞呈抗原制備抗體等領域。

絲狀噬菌體是一種由外殼蛋白圍繞基因組形成的900nm、直徑為6.5nm的生物納米纖維。它像其他納米顆粒一樣具有較大的比表面積，所以能攜帶大量的分子藥物；同時，它分子量較大具有很強的免疫原性，比較容易機體產生免疫反應，很容易被機體清除。因為噬菌體是特異性針對細菌的病毒顆粒，所以對人體而言是一種安全的納米材料。并且噬菌體還可以通過噬菌體展示技術和生物淘選獲得與目標靶向物(如：納米顆粒、蛋白質、細胞和器官)特異性識別的結合肽。故絲狀噬菌體是一種具有巨大潛能的靶向阻斷藥物載體。但目前很多研究只利用了它的靶向性，而沒有在一個噬菌體上同時展示上靶向性功能肽和治療性功能肽。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種可異位展示兩種多肽的噬菌體雙展示載體。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：一種可異位展示兩種多肽的噬菌體雙展示載體，它通過以下方法制備得到：

(1)基于fd絲狀噬菌體fUSE55基因組1022位置的BsrGI單酶切位點和2244的BamHI單酶切位點，利用BsrGI/BamHI雙酶切獲得含有重組gene3的長為1223bp的基因片段，所述fUSE55的序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)基于fd絲狀噬菌體f88-4基因組1022位置的BsrG I單酶切位點和2221的BamHI單酶切位點。利用BsrGI/BamHI雙酶切敲除掉f88-4的野生gene3，獲得剩下長為8034bp的基因片段，所述f88-4的序列如SEQ ID NO.2所示；

(3)構建雙展示載體fd388：將步驟1得到的長為1223bp的基因片段和步驟2得到的長為8034bp的基因片段按1:3的比例，通過T4DNA連接酶16℃過夜連接；

(4)將連接產物轉化進入JM109感受態(tài)細胞，并涂抹在四環(huán)素抗性平板上37℃過夜獲取陽性單克隆，從而得到長為9257bp的可異位展示兩種多肽的噬菌體雙展示載體fd388，fd388的序列如SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明利用基因工程技術將fd絲狀噬菌體單展示載體fUSE55基因組的重組gene3取代另一個fd絲狀噬菌體單展示載體f88-4的野生gene3，得到了雙展示噬菌體載體fd388。該展示載體含有fd噬菌體的全基因組，且其gene3和gene8的起始密碼子端含有單酶切位點(SfiI，PstI和HindIII)，能夠直接插入外源多肽基因以完成噬菌體展示。且fd388載體因為攜帶了f88-4載體的基因Tn10，所以繼承了f88-4的四環(huán)素抗性，能為后續(xù)陽性克隆篩選帶來很大的方便。經過不同長度多肽的成功展示驗證，可以展望fd388雙展示載體可以展示制備出多種雙功能噬菌體，并應用于腫瘤靶向治療、重大疾病分子標志物超靈敏檢測、干細胞定向分化和納米顆粒合成和自組裝等領域。

附圖說明

圖1為fd388雙展示載體構建瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2為實例1中利用fd388雙展示載體構建的能同時特異性識別乳腺癌和angiogenin的雙功能性fd388-AR-WR噬菌體的表征圖；其中，(a)為TEM圖，(b)AFM圖，(c)為SDS-PAGE電泳銀染圖。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，以下實施例是對本發(fā)明的解釋而本發(fā)明并不局限于以下實施例。

實施例1：

1、獲得重組gene3：按照New England Biolab公司的BsrGI/BamHI雙酶切體系加入fUSE55載體(序列如SEQ ID NO.1所示)37℃雙酶切3h；利用Qiagen公司的質?；厥赵噭┖谢厥招∑我垣@得包含有重組gene3的長為1222bp的DNA片段1。其中，所述fUSE55是通過overlap PCR實驗將含有2個SfiI酶切位點(SEQ ID NO.4：GCCGACGTGGCCCGGCCTCTGGGGCC)的DNA片段插入野生fd噬菌體的gene3的5’端獲得。

2、獲得噬菌體基因組其他部分：按照New England Biolab公司的BsrGI/BamHI雙酶切體系加入f88-4載體(序列如SEQ ID NO.2所示)37℃雙酶切3h；利用Qiagen公司的質?；厥赵噭┖谢厥沾笃我垣@得包含有噬菌體基因組中除去DNA片段1剩下的長為8034bp的DNA片段2。其中f88-4載體是通過overlap PCR反應將PstI和HindIII酶切位點插入野生gene8的5’端獲得工程化gene8，并將工程化的gene8插入野生的fd噬菌體獲得。

3、構建雙展示載體fd388：將DNA片段1和DNA片段2按1:3的比例，通過T4DNA連接酶16℃過夜連接。

4、將連接產物轉化進入JM109感受態(tài)細胞，并涂抹在四環(huán)素抗性平板上37℃過夜獲取陽性單克隆，得到可異位展示兩種多肽的噬菌體雙展示載體。然后挑取單克隆進行DNA測序，得到可異位展示兩種多肽的噬菌體雙展示載體的DNA序列(序列如SEQ ID NO.3所示)。圖1為fd388雙展示載體構建電泳圖，第一泳道為marker；第二泳道為fUSE55經過BsrGI/BamHI雙酶切后回收的1222bp小片段；第三泳道為f88-4經過BsrGI/BamHI雙酶切后回收的8034bp大片段；第四泳道為連接成功的fd388雙展示載體質粒。

p3展示：將測序成功的fd388載體克隆得到大量質粒，并用New England Biolab公司的SfiI限制性內切酶37℃過夜酶切；利用Qiagen公司的質?；厥赵噭┖谢厥沾笃?，將其與公司合成的帶有SfiI粘性末端的編碼乳腺癌靶向多肽的DNA序列通過T4DNA連接酶進行連接；連接產物轉化入JM109感受態(tài)細胞，挑選克隆進行DNA測序。

p8展示：將p3成功展示的質?？寺。⒂肗ew England Biolab公司的PstI和HindIII限制性內切酶37℃過夜雙酶切；利用Qiagen公司的質?；厥赵噭┖谢厥沾笃?，將其與公司合成的帶有PstI和HindIII粘性末端的編碼Angiogenin識別肽的DNA序列通過T4DNA連接酶進行連接；連接產物轉化入JM109感受態(tài)細胞，挑選克隆進行DNA測序。

噬菌體表征：通過TEM、AFM和瓊脂糖凝膠電泳銀染，結果如圖2所示。

實施例2：

fd388絲狀噬菌體雙展示載體構建和實施例1一致。驗證fd388是否能成功雙展示多肽時，我們在p3展示了黑色素瘤靶向多肽；在P8展示了腫瘤治療免疫靶點蛋白PD-1L特異識別肽。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大學

<120> 一種可異位展示兩種多肽的噬菌體雙展示載體

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9206

<212> DNA

<213> 人工設計

<400> 1

aacgctacta ccattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60

atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac taaatctact 120

cgttcgcaga attgggaatc aactgttaca tggaatgaaa cttccagaca ccgtacttta 180

gttgcatatt taaaacatgt tgaactacag caccagattc agcaattaag ctctaagcca 240

tccgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggag caattaaagg tactgtctaa tcctgacctg 300

ttggaatttg cttccggtct ggttcgcttt gaggctcgaa ttgaaacgcg atatttgaag 360

tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaattcgct ttgcttctga ctataataga 420

cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctcgt tttctgaact gtttaaagca 480

tttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag tattggacgc tatccagtct 540

aaacatttta caattacccc ctctggcaaa acttcctttg caaaagcctc tcgctatttt 600

ggtttctatc gtcgtctggt taatgagggt tatgatagtg ttgctcttac catgcctcgt 660

aattcctttt ggcgttatgt atctgcatta gttgagtgtg gtattcctaa atctcaattg 720

atgaatcttt ccacctgtaa taatgttgtt ccgttagttc gttttattaa cgtagatttt 780

tcctcccaac gtcctgactg gtataatgag ccagttctta aaatcgcata aggtaattca 840

aaatgattaa agttgaaatt aaaccgtctc aagcgcaatt tactacccgt tctggtgttt 900

ctcgtcaggg caagccttat tcactgaatg agcagctttg ttacgttgat ttgggtaatg 960

aatatccggt gcttgtcaag attactctcg acgaaggtca gccagcgtat gcgcctggtc 1020

tgtacaccgt gcatctgtcc tcgttcaaag ttggtcagtt cggttctctt atgattgacc 1080

gtctgcgcct cgttccggct aagtaacatg gagcaggtcg cggatttcga cacaatttat 1140

caggcgatga tacaaatctc cgttgtactt tgtttcgcgc ttggtataat cgctgggggt 1200

caaagatgag tgttttagtg tattctttcg cctctttcgt tttaggttgg tgccttcgta 1260

gtggcattac gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct 1320

caaagcctcc gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctg ctgagggtga 1380

cgatcccgca aaagcggcct ttgactccct gcaagcctca gcgaccgaat atatcggtta 1440

tgcgtgggcg atggttgttg tcattgtcgg cgcaactatc ggtatcaagc tgtttaagaa 1500

attcacctcg aaagcaagct gataaaccga tacaattaaa ggctcctttt ggagcctttt 1560

tttttggaga ttttcaacgt gaaaaaatta ttattcgcaa ttcctttagt tgttcctttc 1620

tattctcact cggccgacgt ggcctggcct ctggggccga aactgttgaa agttgtttag 1680

caaaacctca tacagaaaat tcatttacta acgtctggaa agacgacaaa actttagatc 1740

gttacgctaa ctatgagggc tgtctgtgga atgctacagg cgttgtggtt tgtactggtg 1800

acgaaactca gtgttacggt acatgggttc ctattgggct tgctatccct gaaaatgagg 1860

gtggtggctc tgagggtggc ggttctgagg gtggcggttc tgagggtggc ggtactaaac 1920

ctcctgagta cggtgataca cctattccgg gctatactta tatcaaccct ctcgacggca 1980

cttatccgcc tggtactgag caaaaccccg ctaatcctaa tccttctctt gaggagtctc 2040

agcctcttaa tactttcatg tttcagaata ataggttccg aaataggcag ggtgcattaa 2100

ctgtttatac gggcactgtt actcaaggca ctgaccccgt taaaacttat taccagtaca 2160

ctcctgtatc atcaaaagcc atgtatgacg cttactggaa cggtaaattc agagactgcg 2220

ctttccattc tggctttaat gaggatccat tcgtttgtga atatcaaggc caatcgtctg 2280

acctgcctca acctcctgtc aatgctggcg gcggctctgg tggtggttct ggtggcggct 2340

ctgagggtgg cggctctgag ggtggcggtt ctgagggtgg cggctctgag ggtggcggtt 2400

ccggtggcgg ctccggttcc ggtgattttg attatgaaaa aatggcaaac gctaataagg 2460

gggctatgac cgaaaatgcc gatgaaaacg cgctacagtc tgacgctaaa ggcaaacttg 2520

attctgtcgc tactgattac ggtgctgcta tcgatggttt cattggtgac gtttccggcc 2580

ttgctaatgg taatggtgct actggtgatt ttgctggctc taattcccaa atggctcaag 2640

tcggtgacgg tgataattca cctttaatga ataatttccg tcaatattta ccttctttgc 2700

ctcagtcggt tgaatgtcgc ccttatgtct ttggcgctgg taaaccatat gaattttcta 2760

ttgattgtga caaaataaac ttattccgtg gtgtctttgc gtttctttta tatgttgcca 2820

cctttatgta tgtattttcg acgtttgcta acatactgcg taataaggag tcttaatcat 2880

gccagttctt ttgggtattc cgttattatt gcgtttcctc ggtttccttc tggtaacttt 2940

gttcggctat ctgcttactt tccttaaaaa gggcttcggt aagatagcta ttgctatttc 3000

attgtttctt gctcttatta ttgggcttaa ctcaattctt gtgggttatc tctctgatat 3060

tagcgcacaa ttaccctctg attttgttca gggcgttcag ttaattctcc cgtctaatgc 3120

gcttccctgt ttttatgtta ttctctctgt aaaggctgct attttcattt ttgacgttaa 3180

acaaaaaatc gtttcttatt tggattggga taaataaata tggctgttta ttttgtaact 3240

ggcaaattag gctctggaaa gacgctcgtt agcgttggta agattcagga taaaattgta 3300

gctgggtgca aaatagcaac taatcttgat ttaaggcttc aaaacctccc gcaagtcggg 3360

aggttcgcta aaacgcctcg cgttcttaga ataccggata agccttctat ttctgatttg 3420

cttgctattg gtcgtggtaa tgattcctac gacgaaaata aaaacggttt gcttgttctt 3480

gatgaatgcg gtacttggtt taatacccgt tcatggaatg acaaggaaag acagccgatt 3540

attgattggt ttcttcatgc tcgtaaattg ggatgggata ttatttttct tgttcaggat 3600

ttatctattg ttgataaaca ggcgcgttct gcattagctg aacacgttgt ttattgtcgc 3660

cgtctggaca gaattacttt accctttgtc ggcactttat attctcttgt tactggctca 3720

aaaatgcctc tgcctaaatt acatgttggt gttgttaaat atggtgattc tcaattaagc 3780

cctactgttg agcgttggct ttatactggt aagaatttat ataacgcata tgacactaaa 3840

caggcttttt ccagtaatta tgattcaggt gtttattcat atttaacccc ttatttatca 3900

cacggtcggt atttcaaacc attaaattta ggtcagaaga tgaaattaac taaaatatat 3960

ttgaaaaagt tttctcgcgt tctttgtctt gcgataggat ttgcatcagc atttacatat 4020

agttatataa cccaacctaa gccggaggtt aaaaaggtag tctctcagac ctatgatttt 4080

gataaattca ctattgactc ttctcagcgt cttaatctaa gctatcgcta tgttttcaag 4140

gattctaagg gaaaattaat taatagcgac gatttacaga agcaaggtta ttccatcaca 4200

tatattgatt tatgtactgt ttcaattaaa aaaggtaatt caaatgaaat tgttaaatgt 4260

aattaatttt gttttcttga tgtttgtttc atcatcttct tttgctcaag taattgaaat 4320

gaataattcg cctctgcgcg atttcgtgac ttggtattca aagcaaacag gtgaatctgt 4380

tattgtctca cctgatgtta aaggtacagt gactgtatat tcctctgacg ttaagcctga 4440

aaatttacgc aatttcttta tctctgtttt acgtgctaat aattttgata tggttggctc 4500

aattccttcc ataattcaga aatataaccc aaatagtcag gattatattg atgaattgcc 4560

atcatctgat attcaggaat atgatgataa ttccgctcct tctggtggtt tctttgttcc 4620

gcaaaatgat aatgttactc aaacatttaa aattaataac gttcgcgcaa aggatttaat 4680

aagggttgta gaattgtttg ttaaatctaa tacatctaaa tcctcaaatg tattatctgt 4740

tgatggttct aacttattag tagttagcgc ccctaaagat attttagata accttccgca 4800

atttctttct actgttgatt tgccaactga ccagatattg attgaaggat taattttcga 4860

ggttcagcaa ggtgatgctt tagatttttc ctttgctgct ggctctcagc gcggcactgt 4920

tgctggtggt gttaatactg accgtctaac ctctgtttta tcttctgcgg gtggttcgtt 4980

cggtattttt aacggcgatg ttttagggct atcagttcgc gcattaaaga ctaatagcca 5040

ttcaaaaata ttgtctgtgc ctcgtattct tacgctttca ggtcagaagg gttctatttc 5100

tgttggccag aatgtccctt ttattactgg tcgtgtaact ggtgaatctg ccaatgtaaa 5160

taatccattt cagacggttg agcgtcaaaa tgttggtatt tctatgagtg tttttcccgt 5220

tgcaatggct ggcggtaata ttgttttaga tataaccagt aaggccgata gtttgagttc 5280

ttctactcag gcaagtgatg ttattactaa tcaaagaagt attgcgacaa cggttaattt 5340

gcgtgatggt cagactcttt tgctcggtgg cctcactgat tacaaaaaca cttctcaaga 5400

ttctggtgtg ccgttcctgt ctaaaatccc tttaatcggc ctcctgttta gctcccgttc 5460

tgattctaac gaggaaagca cgttgtacgt gctcgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct 5520

gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 5580

ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttctccg 5640

gctttccccg tcaagctcta aatcggggga tctcgggaaa agcgttggtg accaaaggtg 5700

ccttttatca tcactttaaa aataaaaaac aattactcag tgcctgttat aagcagcaat 5760

taattatgat tgatgcctac atcacaacaa aaactgattt aacaaatggt tggtctgcct 5820

tagaaagtat atttgaacat tatcttgatt atattattga taataataaa aaccttatcc 5880

ctatccaaga agtgatgcct atcattggtt ggaatgaact tgaaaaaatt agccttgaat 5940

acattactgg taaggtaaac gccattgtca gcaaattgat ccaagagaac caacttaaag 6000

cttatgatga tgatgtgctt aaaaacttac tcaatggctg gtttatgcat atcgcaatac 6060

atgcgaaaaa cctaaaagag cttgccgata aaaaaggcca atttattgct atttaccgcg 6120

gctttttatt gagcttgaaa gataaataaa atagataggt tttatttgaa gctaaatctt 6180

ctttatcgta aaaaatgccc tcttgggtta tcaagagggt cattatattt cgcggaataa 6240

catcatttgg tgacgaaata actaagcact tgtctcctgt ttactcccct gagcttgagg 6300

ggttaacatg aaggtcatcg atagcaggat aataatacag taaaacgcta aaccaataat 6360

ccaaatccag ccatcccaaa ttggtagtga atgattataa ataacagcaa acagtaatgg 6420

gccaataaca ccggttgcat tggtaaggct caccaataat ccctgtaaag caccttgctg 6480

atgactcttt gtttggatag acatcactcc ctgtaatgca ggtaaagcga tcccaccacc 6540

agccaataaa attaaaacag ggaaaactaa ccaaccttca gatataaacg ctaaaaaggc 6600

aaatgcacta ctatctgcaa taaatccgag cagtactgcc gttttttcgc cccatttagt 6660

ggctattctt cctgccacaa aggcttggaa tactgagtgt aaaagaccaa gacccgctaa 6720

tgaaaagcca accatcatgc tattccatcc aaaacgattt tcggtaaata gcacccacac 6780

cgttgcggga atttggccta tcaattgcgc tgaaaaataa ataatcaaca aaatgggcat 6840

cgttttaaat aaagtgatgt ataccgaatt cgattgcgtc tcaaccccta cttcggtatc 6900

tgtattatca cgtgtatttt tggtttcacg gaaccaaaac ataaccacaa ggaaagtgac 6960

aatatttagc aacgcagcga taaaaaaggg actatgcggt gaaatctctc ctgcaaaacc 7020

accaataata ggccccgcta ttaaaccaag cccaaaactt gcccctaacc aaccgaacca 7080

cttcacgcgt tgagaagctg aggtggtatc ggcaatgacc gatgccgcga cagccccagt 7140

agctcctgtg atccctgaaa gcaaacggcc taaatacagc atccaaagcg cacttgaaaa 7200

agccagcaat aagtaatcca gcgatgcgcc tattaatgac aacaacagca ctgggcgccg 7260

accaaatcgg tcagacattt ttccaagcca aggagcaaag ataacctgca ttaacgcata 7320

aagtgcaagc aatacgccaa agtggttagc gatatcttcc gaagcaataa attcacgtaa 7380

taacgttggc aagactggca tgataaggcc aatccccatg gcatcgagta acgtaattac 7440

caatgcgatc tttgtcgaac tattcatttc acttttctct atcactgata gggagtggta 7500

aaataactct atcaatgata gagtgtcaac aaaaattagg aattaatgat gtctagatta 7560

gataaaagta aagtgattaa cagcgcatta gagctgctta atgaggtcgg aatcgaaggt 7620

ttaacaaccc gtaaactcgc ccagaagcta ggtgtagagc agcctacatt gtattggcat 7680

gtaaaaaata agcgggcttt gctcgacgcc ttagccattg agatgttaga taggcaccat 7740

actcactttt gccctttaga aggggaaagc tggcaagatt ttttacgtaa taacgctaaa 7800

agttttagat gtgctttact aagtcatcgc gatggagcaa aagtacattt aggtacacgg 7860

cctacagaaa aacagtatga aactctcgaa aatcaattag cctttttatg ccaacaaggt 7920

ttttcactag agaatgcatt atatgcactc agcgctgtgg ggcattttac tttaggttgc 7980

gtattggaag atcaagagca tcaagtcgct aaagaagaaa gggaaacacc tactactgat 8040

agtatgccgc cattattacg acaagctatc gaattatttg atcaccaagg tgcagagcca 8100

gccttcttat tcggccttga attgatcata tgcggattag aaaaacaact taaatgtgaa 8160

agtgggtctt aaaagcagca taaccttttt ccgtgatggt aacttcacgg taaccaagat 8220

gtcgagttaa ccacccttta gattcataaa gcgaaaataa tgcggctcca acgtacccac 8280

ctaaatggaa acggcgttca ctccaatcta aacacgcaca acagatttta cgtgaatgtt 8340

tggaaggaac gtcaattccc atttcatgaa aatattgaat accacttaat gtgatcattg 8400

aaccattttc agtgatccat tgctgttgac aaagggaatc atagatccct ttagggttcc 8460

gatttagtgc tttacggcac ctcgacctcc aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta 8520

gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta 8580

atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcacaac taactcggcc tattcttttg 8640

atttataagg atttttgtca ttttctgctt actggttaaa aaataagctg atttaacaaa 8700

tatttaacgc gaaatttaac aaaacattaa cgtttacaat ttaaatattt gcttatacaa 8760

tcatcctgtt tttggggctt ttctgattat caatcggggt acatatgatt gacatgctag 8820

ttttacgatt accgttcatc gattctcttg tttgctccag actttcaggt aatgacctga 8880

tagcctttgt agacctctca aaaatagcta ccctctccgg catgaattta tcagctagaa 8940

cggttgaata tcatattgac ggtgatttga ctgtctccgg cctttctcac ccgtttgaat 9000

ctttgcctac tcattactcc ggcattgcat ttaaaatata tgagggttct aaaaattttt 9060

atccctgcgt tgaaattaag gcttcaccag caaaagtatt acagggtcat aatgtttttg 9120

gtacaaccga tttagcttta tgctctgagg ctttattgct taattttgct aactctctgc 9180

cttgcttgta cgatttattg gatgtt 9206

<210> 2

<211> 9234

<212> DNA

<213> 人工設計

<400> 2

aacgctacta ccattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60

atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac taaatctact 120

cgttcgcaga attgggaatc aactgttaca tggaatgaaa cttccagaca ccgtacttta 180

gttgcatatt taaaacatgt tgaactacag caccagattc agcaattaag ctctaagcca 240

tccgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggag caattaaagg tactgtctaa tcctgacctg 300

ttggaatttg cttccggtct ggttcgcttt gaggctcgaa ttgaaacgcg atatttgaag 360

tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaattcgct ttgcttctga ctataataga 420

cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctcgt tttctgaact gtttaaagca 480

tttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag tattggacgc tatccagtct 540

aaacatttta caattacccc ctctggcaaa acttcctttg caaaagcctc tcgctatttt 600

ggtttctatc gtcgtctggt taatgagggt tatgatagtg ttgctcttac catgcctcgt 660

aattcctttt ggcgttatgt atctgcatta gttgagtgtg gtattcctaa atctcaattg 720

atgaatcttt ccacctgtaa taatgttgtt ccgttagttc gttttattaa cgtagatttt 780

tcctcccaac gtcctgactg gtataatgag ccagttctta aaatcgcata aggtaattca 840

aaatgattaa agttgaaatt aaaccgtctc aagcgcaatt tactacccgt tctggtgttt 900

ctcgtcaggg caagccttat tcactgaatg agcagctttg ttacgttgat ttgggtaatg 960

aatatccggt gcttgtcaag attactctcg acgaaggtca gccagcgtat gcgcctggtc 1020

tgtacaccgt gcatctgtcc tcgttcaaag ttggtcagtt cggttctctt atgattgacc 1080

gtctgcgcct cgttccggct aagtaacatg gagcaggtcg cggatttcga cacaatttat 1140

caggcgatga tacaaatctc cgttgtactt tgtttcgcgc ttggtataat cgctgggggt 1200

caaagatgag tgttttagtg tattctttcg cctctttcgt tttaggttgg tgccttcgta 1260

gtggcattac gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct 1320

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attcacctcg aaagcaagct gataaaccga tacaattaaa ggctcctttt ggagcctttt 1560

tttttggaga ttttcaacgt gaaaaaatta ttattcgcaa ttcctttagt tgttcctttc 1620

tattctcact ccgctgaaac tgttgaaagt tgtttagcaa aacctcatac agaaaattca 1680

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agggaatcat agatcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgacctccaa 8520

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<210> 3

<211> 9257

<212> DNA

<213> 人工設計

<400> 3

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atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac taaatctact 120

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aaacttcctc atgaaaaagt ctttagttct taaagcatct gttgctgttg cgactcttgt 5820

tcctatgcta agctttgcca acgtccctgc agaaggtgat gacccggcta aagctgcttt 5880

tgactctctt caggcttctg ctactgaata catcggctac gcttgggcta tggtggttgt 5940

tatcgttggt gctactattg gcatcaaact tttcaaaaaa ttcacttcta aagcgtctta 6000

atgaactcag atacccagcc cgcctaatga gcgggctttt ttttaagcta gcttatgatg 6060

atgatgtgct taaaaactta ctcaatggct ggtttatgca tatcgcaata catgcgaaaa 6120

acctaaaaga gcttgccgat aaaaaaggcc aatttattgc tatttaccgc ggctttttat 6180

tgagcttgaa agataaataa aatagatagg ttttatttga agctaaatct tctttatcgt 6240

aaaaaatgcc ctcttgggtt atcaagaggg tcattatatt tcgcggaata acatcatttg 6300

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accggttgca ttggtaaggc tcaccaataa tccctgtaaa gcaccttgct gatgactctt 6540

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aaccatcatg ctattccatc caaaacgatt ttcggtaaat agcacccaca ccgttgcggg 6840

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tgccctttag aaggggaaag ctggcaagat tttttacgta ataacgctaa aagttttaga 7860

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atttagcttt atgctctgag gctttattgc ttaattttgc taactctctg ccttgcttgt 9240

acgatttatt ggatgtt 9257

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工設計

<400> 4

gccgacgtgg cccggcctct ggggcc 26