本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同步分離高純度植物葉綠體和線粒體的方法。

背景技術(shù)：

葉綠體(chloroplast)和線粒體(mitochondrion)的研究在系統(tǒng)進(jìn)化、物種鑒定、核質(zhì)互作、基因工程等領(lǐng)域具有舉足輕重的作用。分離高純度的葉綠體和線粒體細(xì)胞器是開(kāi)展相關(guān)研究的關(guān)鍵。密度梯度離心是目前分離這兩種細(xì)胞器最為常用的方法，它是用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞勻漿或混懸液至于介質(zhì)的頂部，通過(guò)重心或離心場(chǎng)力的作用使細(xì)胞分層和分離。密度梯度離心介質(zhì)包括蔗糖(sucrose)、血清白蛋白(serumalbumin,alb)、聚蔗糖(ficoll)、氯化銫(cscl)和percoll等。密度梯度離心方法存在一些不足：1)血清白蛋白、聚蔗糖、氯化銫和percoll等介質(zhì)的價(jià)格昂貴；2)價(jià)格相對(duì)低廉的蔗糖在高濃度時(shí)又會(huì)對(duì)線粒體和葉綠體活性造成不利影響，特別是線粒體對(duì)介質(zhì)的滲透壓十分敏感，高濃度會(huì)導(dǎo)致其變形或破裂；3)配置惰性梯度介質(zhì)溶液步驟繁瑣且耗時(shí)；4)配置的分離液無(wú)法重復(fù)使用；5)離心時(shí)間較長(zhǎng)；6)操作嚴(yán)格，不易掌握。盡管商業(yè)化的試劑盒(如inventbiotechnologies公司開(kāi)發(fā)的minute^tmchloroplastisolationkit、sigma公司開(kāi)發(fā)的chloroplastisolationkit和thermofisher公司研發(fā)的mitochondriaisolationkitforculturedcells)操作簡(jiǎn)便，分離效果可靠，但其價(jià)格昂貴，使用次數(shù)有限無(wú)法大批量使用，且不能同時(shí)分離兩種細(xì)胞器。

實(shí)際上，植物的葉綠體、線粒體以及葉肉細(xì)胞在形態(tài)、大小存在較大的差異。高等植物葉綠體呈雙凸或平凸透鏡狀，長(zhǎng)徑5-10μm，短徑2-4μm，厚2-3μm；線粒體是一些大小不一的球狀、棒狀或細(xì)絲狀顆粒，一般為0.5-1.0μm，長(zhǎng)1-2μm；葉肉細(xì)胞的大小為30-50μm。此外它們?cè)诔两迪禂?shù)上也存在差異，因此利用物理分篩和差速離心從葉片勻漿中同步分離高純度的葉綠體和線粒體理論上是可的。

具有活性的完整葉綠體在488nm激發(fā)光和650～750nm吸收光下產(chǎn)生紅色自發(fā)熒光；而線粒體可借助于線粒體特異染料(redcmxros)染色，在激發(fā)光和吸收光分別為579nm和599nm條件下觀察染料熒光。因此，利用熒光顯微技術(shù)(fluorescencemicroscopy)可有效地跟蹤檢測(cè)葉綠體和線粒體細(xì)胞器，提供了可視化鑒定分離的葉綠體和線粒體純度的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是在于提供一種同步分離高純度植物葉綠體和線粒體的方法，材料易得，方法簡(jiǎn)單，該方法可廣泛應(yīng)用于各種植物葉綠體和線粒體細(xì)胞器的同步分離以及高純度葉綠體和線粒體基因組提取。

為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：

一種同步分離高純度植物葉綠體和線粒體的方法，其步驟是：

1、植物葉片組織沖洗干凈并剪碎，按照1:15(m:v)加入cib緩沖液，研磨后依次通過(guò)70μm、35μm和15μm濾網(wǎng)過(guò)濾，過(guò)濾液200×g離心5min，去除組織殘?jiān)?、?xì)胞碎片；

2、根據(jù)葉綠體和線粒體不同的沉降系數(shù)，將步驟1獲得的濾液1000×g離心10min，收集富含葉綠體的沉淀，

3、收集步驟2離心后的上清液，選用5μm的濾網(wǎng)過(guò)濾，過(guò)濾液經(jīng)2000×g離心10min，棄沉淀，上清液17000×g離心10min，收集富含線粒體的沉淀；

4、收集得到的葉綠體和線粒體沉淀分別用洗滌緩沖液洗滌，并用dnasei消化，去除核基因組的污染；

5、葉綠體沉淀的消化液1000×g離心10min之后棄上清，沉淀用洗滌緩沖液洗滌，得到的即為葉綠體；線粒體沉淀的消化液17000×g離心10min之后棄上清，沉淀用洗滌緩沖液洗滌，得到的即為線粒體。

作為優(yōu)選，上述步驟均在冰上或4℃離心機(jī)中進(jìn)行，以避免細(xì)胞器的裂解。

作為優(yōu)選，選取的葉片組織為植物的新鮮幼嫩葉片。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

1)經(jīng)濟(jì)：密度梯度離心分離法中所用的大部分介質(zhì)價(jià)格昂貴；商業(yè)化試劑盒價(jià)格更高，且使用次數(shù)有限。該方法所用試劑耗材簡(jiǎn)單、廉價(jià)，且不同孔徑濾網(wǎng)可反復(fù)使用，可進(jìn)行大批量樣本的分離。

2)省時(shí)、省力、操作簡(jiǎn)單：密度梯度離心分離法中梯度介質(zhì)溶液配置比較繁瑣耗時(shí)，且后續(xù)操作嚴(yán)格，不易掌握。商業(yè)化試劑盒一般只針對(duì)單一細(xì)胞器(葉綠體或線粒體)進(jìn)行分離。此外，常規(guī)技術(shù)在線粒體分離時(shí)需要大量種子進(jìn)行黑暗萌發(fā)及生長(zhǎng)形成黃化苗，從而抑制葉綠體的形成。本發(fā)明省時(shí)、省力、操作簡(jiǎn)單；無(wú)需黃花苗處理，可從葉片勻漿中同步分離高純度葉綠體和線粒體兩種細(xì)胞器。

3)無(wú)毒害：密度梯度離心方法中所用的蔗糖，可因高濃度導(dǎo)致高滲透壓最終造成分離的細(xì)胞器變形或破裂；而介質(zhì)氯化銫等化學(xué)試劑可對(duì)分離的細(xì)胞器造成永久毒害，影響后續(xù)葉綠體或線粒體體外生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本發(fā)明利用優(yōu)化后的物理分篩(非化學(xué)方法)及常規(guī)差速離心來(lái)分離高純度葉綠體和線粒體，不會(huì)造成化學(xué)毒害，充分保證分離細(xì)胞器的活性，為后續(xù)體外生化實(shí)驗(yàn)提供了保障。

附圖說(shuō)明

圖1葉片組織處理及研磨流程圖

圖2葉綠體分離純化流程圖

圖3線粒體分離純化流程圖

圖4葉綠體和線粒體分離純化結(jié)果

其中圖a為葉綠體分離純化結(jié)果，圖b為線粒體分離純化結(jié)果；1：明場(chǎng)；2：葉綠體自發(fā)熒光；3：線粒體特異染色熒光；4：疊加結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。所述試劑或材料，如未特別說(shuō)明，均來(lái)源于商業(yè)渠道。

實(shí)施例1

本發(fā)明實(shí)施例以油菜葉片組織為例，該方法同樣適用于擬南芥、煙草、水稻、小麥等植物的葉綠體和線粒體的同步分離。

一種同步分離高純度植物葉綠體和線粒體的方法，其步驟是：

1、葉片組織處理及研磨

在植物生理生長(zhǎng)期，選擇油菜幼嫩的葉片組織作為分離純化葉綠體和線粒體的材料。剪取葉片組織后置于冰上暫時(shí)保存，用清水沖洗幾遍，將葉片上的泥土等雜質(zhì)清洗干凈。之后用吸水紙將葉片上的殘存的水珠吸干，再用滅菌后的手術(shù)剪刀將非葉脈部位剪碎，稱取5g置于滅菌好的研缽內(nèi)，加入提前預(yù)冷的cib緩沖液(0.33msorbitol,50mmtricine,2mmedta,2mmmgcl2,1mmdtt,0.1％bsa,ph7.8)10ml，在冰上研磨充分，再次加入適量cib緩沖液，通過(guò)70μm濾網(wǎng)過(guò)濾，在過(guò)濾過(guò)程中為加速過(guò)濾速度，可以用移液槍緩慢輕輕吹打，殘?jiān)够匮欣徖^續(xù)研磨并加入適量cib緩沖液，同樣經(jīng)70μm濾網(wǎng)過(guò)濾。過(guò)濾液再依次通過(guò)35μm、15μm濾網(wǎng)過(guò)濾(注：70μm、35μm和15μm的分級(jí)過(guò)濾是為了依次去除大殘?jiān)?、中等殘?jiān)洼^小殘?jiān)⑶曳乐怪苯佑幂^小孔徑濾網(wǎng)過(guò)濾導(dǎo)致的濾網(wǎng)堵塞而致使無(wú)法過(guò)濾或過(guò)濾速度慢)，棄殘?jiān)⑹占^(guò)濾液，過(guò)濾液再200×g，4℃，離心5min，以去除組織殘?jiān)?、?xì)胞碎片等的污染。

2、葉綠體的純化

將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管內(nèi)，采用1000×g，4℃離心10min，轉(zhuǎn)移上清于新的離心管內(nèi)，并用15mlcib緩沖液重懸沉淀，加入5uμl^-1的dnasei5μl，4℃，消化核基因組1h。1000×g，4℃離心10min之后棄上清，沉淀用洗滌緩沖液(0.33msorbitol,50mmtricine,2mmmgcl2,1mmdtt,ph7.8)洗滌兩次，得到的即為葉綠體。以上所述的方法，整個(gè)操作過(guò)程在冰上進(jìn)行，時(shí)間盡量縮短，以避免細(xì)胞器的裂解。

3、線粒體的純化

收集步驟2中離心后的上清液，所得上清液分別選用10μm、5μm、1μm的濾網(wǎng)再次過(guò)濾進(jìn)行線粒體的純化篩選(注：葉綠體和線粒體因?yàn)榇笮∩系牟町?，在此次過(guò)濾中分開(kāi))，并采用葉綠體自發(fā)熒光和線粒體特異染料鏡檢過(guò)濾液(具體方法見(jiàn)實(shí)施例3)，通過(guò)鏡檢發(fā)現(xiàn)10μm的過(guò)濾液含有葉綠體的污染較多，5μm濾網(wǎng)過(guò)濾液中葉綠體數(shù)量明顯減少，而1μm的過(guò)濾液中線粒體損失嚴(yán)重，且由于過(guò)濾時(shí)間較長(zhǎng)影響了線粒體活性，故而在后續(xù)實(shí)施方案中均采用5μm的濾網(wǎng)以達(dá)到篩選純化的目的。過(guò)濾液經(jīng)2000×g，4℃離心10min，以排除未沉淀的少許葉綠體及其他非線粒體的污染，上清液17000×g高速離心10min，4℃，收集線粒體沉淀。收集得到的線粒體經(jīng)15mlcib緩沖液重懸，加入5uμl^-1的dnasei5μl，4℃，消化核基因組1h。17000×g，4℃離心10min之后棄上清，并用洗滌緩沖液洗滌兩次，得到的即為線粒體。以上所述的方法，整個(gè)操作過(guò)程在冰上進(jìn)行，時(shí)間盡量縮短，以避免細(xì)胞器的裂解。

實(shí)施例2：葉綠體和線粒體的觀察

將實(shí)施例1中分離得到的葉綠體和線粒體，分出100μl，加入10μlredcmxros，室溫避光孵育10min，之后用洗滌緩沖液洗滌兩次，制片于激光共聚焦顯微鏡下觀察。觀察結(jié)果表明，使用本發(fā)明分離的油菜葉片葉綠體純度較高(圖4a)，僅有極少量線粒體污染(圖4a-3和圖4a-4)，且葉綠體形態(tài)完整且具有活性(圖4a-1，圖4a-2和圖4a-4)；同步分離的線粒體純度極高，無(wú)葉綠體污染，且具有活性(圖4b-3和圖4b-4)。