一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于體外定點(diǎn)突變獲得的油菜抗多種als抑制劑類除草劑基因及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

二、

背景技術(shù)：

田間雜草的生長一方面與農(nóng)作物競爭養(yǎng)分和生長空間，給農(nóng)作物正常生長發(fā)育帶來嚴(yán)重影響；另一方面人工除草費(fèi)時(shí)費(fèi)工增加勞動成本。而現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中越來越多的依靠化學(xué)除草劑來防除雜草。然而，除草劑在殺死雜草的同時(shí)往往也對農(nóng)作物帶來不同程度的危害。因此，培育抗除草劑作物新品種對除草劑的推廣應(yīng)用和農(nóng)作物的輕簡化栽培均具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

除草劑主要是通過抑制或干擾植物關(guān)鍵的代謝過程而抑制植物生長或殺死植物。以氨基酸生物合成過程中的關(guān)鍵酶為靶標(biāo)，是研發(fā)新型高效除草劑的一個(gè)重要方向和熱點(diǎn)，已成功開發(fā)的除草劑的靶酶有乙酰乳酸合成酶、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(epsps)和谷氨酰胺合成酶(gs)等。美國孟山都(monsanto)公司以epsps為靶酶開發(fā)的有機(jī)磷除草劑草甘膦，自1974年在美國注冊登記以來，因其廣譜、高效、低毒、易分解、低殘留和對環(huán)境相對安全等優(yōu)點(diǎn)在全球100多個(gè)國家得到應(yīng)用。德國hoechst公司以gs為靶酶開發(fā)的有機(jī)磷除草劑草銨膦在歐洲及北美被廣泛使用。

而以乙酰乳酸合成酶(als)為靶酶開發(fā)的除草劑，己經(jīng)成為新型高效除草劑的主流產(chǎn)品。als是催化分支氨基酸如纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成第一步的酶。als抑制劑類除草劑能抑制植物細(xì)胞內(nèi)的als酶活性，阻礙支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)生物合成，從而抑制植物細(xì)胞的分裂和生長。1961年美國杜邦(dupont)公司首先報(bào)道了嘧啶類化合物的活性及對植物體內(nèi)als酶的抑制作用，1982年該公司成功研發(fā)了第一個(gè)磺酰脲類除草劑氯磺隆(chlorsulfuron)。繼氯磺隆研發(fā)成功以來眾多國際化學(xué)公司以als為靶酶相繼開發(fā)成功了咪唑啉酮類、磺酰胺類、嘧啶水楊酸類和三唑嘧啶磺酰胺類除草劑，具體的除草劑品種和商品名更是不計(jì)其數(shù)。以als為靶酶開發(fā)的除草劑具有選擇性強(qiáng)、殺草譜廣，活性高、使用劑量低，對哺乳動物毒性小等優(yōu)點(diǎn)，既可作土壤處理劑也可莖葉噴施，因其除草效率高、使用方便深得廣大用戶歡迎。該類除草劑作用位點(diǎn)單一，長期使用極易讓雜草產(chǎn)生抗藥性，但同時(shí)也為誘變作物產(chǎn)生抗性、為選育非轉(zhuǎn)基因抗除草劑品種提供了便利。

利用傳統(tǒng)誘變技術(shù)如化學(xué)誘變劑處理種子可以誘導(dǎo)植物細(xì)胞als基因的堿基發(fā)生點(diǎn)突變，進(jìn)而導(dǎo)致als酶蛋白的氨基酸發(fā)生替換，而變得對除草劑不在敏感。而更多的抗als類除草劑基因是來自一些雜草。由于大量使用這類除草劑，使得抗該als類除草劑的抗性生物型雜草數(shù)量急劇增加，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)全球30多個(gè)國家已經(jīng)發(fā)現(xiàn)抗als抑制劑類除草劑的雜草生物型有98種，其中雙子葉雜草68種，單子葉雜草30種，已成為產(chǎn)生抗性雜草最為嚴(yán)重的一類除草劑。研究表明抗als抑制劑類除草劑的雜草生物型中絕大多數(shù)是有靶標(biāo)基因發(fā)生位點(diǎn)突變產(chǎn)生的。

如als酶蛋白第122位點(diǎn)(均以模式植物擬南芥als氨基酸位點(diǎn)計(jì)算)的丙氨酸被纈氨酸取代，對咪唑啉酮類除草劑產(chǎn)生抗性；第197位點(diǎn)的脯氨酸被組氨酸、或蘇氨酸、精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺取代，對磺酰脲類除草劑產(chǎn)生

迄今為止，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的als基因中，有8個(gè)位點(diǎn)，總計(jì)約26個(gè)氨基酸的替換突變會對相應(yīng)的除草劑產(chǎn)生抗性。這8個(gè)位點(diǎn)分別是：ala122、pro197、ala205、asp376、arg377、trp574、ser653、gly654，這些位點(diǎn)所標(biāo)注的數(shù)值均是相對于模式植物擬南芥的als酶蛋白氨基酸序列的位置。

除草劑抗性基因在培育抗除草劑農(nóng)作物中得到廣泛的應(yīng)用。人們通過各種途徑或技術(shù)手段分離獲得除草劑抗性基因并轉(zhuǎn)入到各種經(jīng)濟(jì)農(nóng)作物中，以獲得抗除草劑的農(nóng)作物新品種。

目前在油菜中報(bào)道的als基因突變位點(diǎn)比較少，僅限于197位、574和653位的氨基酸替換。swanson等通過誘變劑乙基亞硝基脲誘變油菜小孢子，選擇獲得了對咪唑啉酮類除草劑具有抗性的油菜pl(或記為pml)和p2(或記為pm2)。p1的抗性突變位點(diǎn)為bnalsl的ser653asp，p2的抗性突變位點(diǎn)是bnals3的trp574leu，p2的抗性水平比p1高。目前國外已商業(yè)化的抗咪唑啉酮clearfield油菜都是由這2個(gè)突變體轉(zhuǎn)育而成。

江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院在油菜和大豆多年輪作的試驗(yàn)田中發(fā)現(xiàn)了1株抗咪唑啉酮類除草劑油菜，培育出抗性穩(wěn)定的株系m9，該抗性株系的突變位點(diǎn)是bnalsl基因的ser653asp突變。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)報(bào)道從油菜ems突變后代群體中鑒定出幾株抗除草劑苯磺隆的突變體，測序表明它們的突變位點(diǎn)均為bnals3的pro197ser/leu突變。胡勝武等報(bào)道通過ems誘變甘藍(lán)型油菜中雙9，獲得3株抗除草劑突變體k1、k4、k5。發(fā)現(xiàn)抗除草劑突變體k1和k4是由于als基因中第535位c堿基突變?yōu)閠，導(dǎo)致其編碼的bnals3蛋白第197位氨基酸由pro突變?yōu)閟er；而k5則是bnalsl基因序列第544位c突變?yōu)閠，導(dǎo)致其編碼的bnalsl蛋白發(fā)生了pro197ser的改變。

這些部位的改變僅賦予油菜對咪唑啉酮類、磺酰脲類除草劑的抗性，對其它als抑制劑類除草劑則不具抗性。油菜als基因突變多是利用化學(xué)誘變劑處理油菜種子，然后篩選抗除草劑突變體，并進(jìn)一步鑒定抗除草劑突變體的基因型。鑒于誘變具有隨機(jī)性，需要篩選大量的種子，工作量比較大。如果能在體外進(jìn)行定點(diǎn)突變，并通過轉(zhuǎn)基因途徑驗(yàn)證突變基因功能，再利用現(xiàn)代的基因編輯技術(shù)將突變基因敲入到油菜染色體組中，這樣就可以較快且較精準(zhǔn)地獲得新的抗除草劑油菜。

本課題組曾育成抗除草劑油菜種質(zhì)系m342,抗除草劑油菜m342的als3基因上，存在一個(gè)突變位點(diǎn)，即位于核苷酸序列第1667位堿基由g突變成t，導(dǎo)致其編碼的als蛋白氨基酸序列在556位由色氨酸(w)變成亮氨酸(l)，因此，m342對咪唑啉酮類、磺酰脲類除草劑具有明顯抗性。

三、

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

1、技術(shù)問題

本發(fā)明旨在油菜已知als3基因序列的基礎(chǔ)上，通過設(shè)計(jì)pcr引物在特殊位點(diǎn)上引入堿基突變，再利用重疊pcr技術(shù)，最終目的是創(chuàng)造新的點(diǎn)突變位點(diǎn)，探討體外突變在創(chuàng)造油菜新的抗除草劑基因的可行性。

2、技術(shù)方案

一種基于體外定點(diǎn)突變獲得油菜抗多種als抑制劑類除草劑基因，其特征在于，該基因mals3是利用體外定點(diǎn)突變技術(shù)獲得的，是在已經(jīng)克隆的抗除草劑油菜m342的als3基因序列中引入一個(gè)新的突變位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于als3基因的第560位，原來是c堿基，編碼187位的丙氨酸，經(jīng)突變成t堿基后則在187位變成了纈氨酸，該基因mals3序列為：seqidno.1。

所述一種基于體外定點(diǎn)突變獲得油菜抗多種als抑制劑類除草劑基因mals3的應(yīng)用，是指所述油菜抗多種als除草劑基因mals3在植物抗als除草劑方面的應(yīng)用，尤其是指所述油菜抗多種als抑制劑類除草劑基因mals3在植物抗als抑制劑類除草劑方面的應(yīng)用。als抑制劑類除草劑是指所述als抑制劑類除草劑，是指咪唑啉酮類、磺酰脲類、三唑嘧啶磺酰胺類或嘧啶水揚(yáng)酸類除草劑，尤其是指咪唑乙酰胺、苯磺隆、雙氟磺酰胺或雙草醚除草劑。

所述的應(yīng)用，具體是指所述油菜抗多種als抑制劑類除草劑基因mals3在擬南芥抗als抑制劑類除草劑方面的應(yīng)用，具體為：

1)引物設(shè)計(jì)：

2)抗除草劑油菜als3基因克?。阂钥钩輨┯筒薽342基因組dna為模板，用引物對alsf/alsr及高保真dna聚合酶擴(kuò)增油菜的als3基因；

擴(kuò)增體系：5×transstartfastpfubuffer10μl,基因組dna1μl，10μm35-s-alsf1μl，10μmalsr1μl，2.5mmdntps5μl,transstartfastpfudna聚合酶1μl，補(bǔ)足ddh2o到50μl；

溫度程序：95℃，3min，95℃，30sec，58℃，30sec，72℃2min，35個(gè)循環(huán)后，72℃，5min，瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物，膠回收純化2kb的pcr產(chǎn)物并克隆到peasy-t1載體上經(jīng)測序確定，獲得克隆有抗除草劑油菜m342als3基因的peasy-t1質(zhì)粒；

3)利用重疊pcr引入堿基突變

以克隆有抗除草劑油菜m342的als3基因的peasy-t1質(zhì)粒為模板，分別用引物對alsf/alsrm和alsfm/alsr擴(kuò)增出上游片段大小為572bp和下游片段大小為1412bp；

擴(kuò)增體系：5×transstartfastpfubuffer10μl,基因組dna1μl，10μm引物取1μl，2.5mmdntps5μl,transstartfastpfudna聚合酶1μl，補(bǔ)足ddh2o到50μl；

溫度程序：95℃，3min，95℃，30sec,58℃,30sec,72℃1min,35個(gè)循環(huán)后，72℃，5min。

瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物分別回收大小約572bp和1412bp的上、下游pcr產(chǎn)物。后以上、下游產(chǎn)物的混合物為模板，用引物對alsf/alsr擴(kuò)增出全長的als3基因序列。

擴(kuò)增體系：5×transstartfastpfubuffer10μl,基因組dna1μl，10μm引物取1μl，2.5mmdntps5μl,transstartfastpfudna聚合酶1μl，補(bǔ)足ddh2o到50μl；

溫度程序：95℃，1min，55℃30sec,72℃2min,再95℃，30sec,58℃,30sec,72℃2min,35個(gè)循環(huán)，72℃，5min。

瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物分別回收大小約2000bp的片段，然后克隆到peasy-t1上，并測序分析，該產(chǎn)物序列除了在560處引入了點(diǎn)突變c/t外，其余堿基序列與m342的als3基因序列完全一致，定名為mals3；

4)植物表達(dá)載體構(gòu)建：以載體pcambia2300質(zhì)粒dna為模板，分別用引物對p0390-35sf/35sr和als-nosf/nosp0390r擴(kuò)增35s啟動子序列(約450bp)和nos終止子序列(約250bp)，膠回收相應(yīng)大小的pcr產(chǎn)物；

以克隆有mals3基因的peasy-t1質(zhì)粒為模板，用引物對35s-alsf/alsr擴(kuò)增mals3基因，膠回收大小約2000bp的pcr產(chǎn)物，通過重組反應(yīng)克隆到smali酶切線性化的pcambia0390載體上。反應(yīng)體系如下：5×cemultisbuffer4μl，mals3pcr產(chǎn)物2μl，35spcr產(chǎn)物2μl，nospcr產(chǎn)物2μl，exnase^tm2μl，線性化載體4μl,ddh2o2μl，于37℃下反應(yīng)30min，后取5-10μl反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，挑克隆pcr鑒定，抽提質(zhì)粒酶切鑒定，最終經(jīng)測序確定后，由此獲得的質(zhì)粒定名為p0390-mals3；

5)擬南芥轉(zhuǎn)化:用上述獲得的植物表達(dá)載體質(zhì)粒p0390-mals3轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌gv3101，采用農(nóng)桿菌液浸花的方法轉(zhuǎn)化擬南芥；

6)抗除草劑擬南芥植株的篩選：播種經(jīng)農(nóng)桿菌gv3101(含質(zhì)粒p0390-mals3)轉(zhuǎn)化處理的擬南芥t0代種子，在苗期進(jìn)行als抑制劑類除草劑的抗性鑒定，經(jīng)過除草劑篩選，獲得抗除草劑植株。其中所述als抑制劑類除草劑是指所述als抑制劑類除草劑是指咪唑啉酮類、磺酰脲類、三唑嘧啶磺酰胺類或嘧啶水揚(yáng)酸類除草劑，尤其是指咪唑乙酰胺、苯磺隆、雙氟磺酰胺或雙草醚除草劑。

3、有益效果

迄今為止，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的als基因中，有8個(gè)位點(diǎn)，總計(jì)約26個(gè)氨基酸的替換突變會對相應(yīng)的除草劑產(chǎn)生抗性。這8個(gè)位點(diǎn)分別是：ala122、pro197、ala205、asp376、arg377、trp574、ser653、gly654，這些位點(diǎn)所標(biāo)注的數(shù)值均是相對于模式植物擬南芥的als酶蛋白氨基酸序列的位置。目前在油菜中報(bào)道的als基因突變位點(diǎn)比較少，僅限于197位、574和653位的氨基酸替換。這些部位的改變僅賦予油菜對咪唑啉酮類、磺酰脲類除草劑的抗性，對其它als抑制劑類除草劑則不具抗性。油菜als基因突變多是利用化學(xué)誘變劑處理油菜種子，然后篩選抗除草劑突變體，并進(jìn)一步鑒定抗除草劑突變體的基因型。鑒于誘變具有隨機(jī)性，需要篩選大量的種子，工作量比較大。如果能篩選到位點(diǎn)進(jìn)行體外突變，并通過轉(zhuǎn)基因途徑驗(yàn)證確定突變基因功能，再利用現(xiàn)代的基因編輯技術(shù)將突變基因敲入到油菜染色體組中，這樣就可以較快地獲得新的抗除草劑油菜。

抗除草劑油菜m342的als3基因上，存在一個(gè)突變位點(diǎn)，即位于核苷酸序列第1667位堿基由g突變成t，導(dǎo)致其編碼的als蛋白氨基酸序列在556位由色氨酸(w)變成亮氨酸(l)，因此，m342對咪唑啉酮類、磺酰脲類除草劑具有明顯抗性。本發(fā)明在抗除草劑油菜m342的als3基因上，引入第二個(gè)突變位點(diǎn)，探討體外突變在創(chuàng)造油菜新的抗除草劑基因的可行性，通過引物設(shè)計(jì)在特殊位點(diǎn)上引入堿基突變，再利用重疊pcr技術(shù)，最終目的是創(chuàng)造新的點(diǎn)突變位點(diǎn)。

本發(fā)明通過大量試驗(yàn)篩選到抗除草劑油菜m342的als3基因的核苷酸序列第560處，將堿基c突變?yōu)閠，使其編碼的蛋白質(zhì)序列在第187位的丙氨酸(a)突變成纈氨酸(v)。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)驗(yàn)證突變基因?qū)ls抑制劑類除草劑的抗性。我們發(fā)現(xiàn)突變后的als3基因具有2個(gè)突變位點(diǎn)，分別是a187v和w556l。除了對咪唑啉酮類、磺酰脲類除草劑具有抗性外，該雙突變位點(diǎn)的基因?qū)θ蜞奏せ酋０奉惡袜奏に畵P(yáng)酸類除草劑也不再敏感，本發(fā)明為創(chuàng)造油菜新的抗除草劑基因提供了一種途徑，并獲得一個(gè)具有2個(gè)突變位點(diǎn)的抗als抑制劑類除草劑的基因，也為新的抗除草劑基因的應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本發(fā)明應(yīng)用體外定點(diǎn)突變技術(shù)獲得一個(gè)具有雙突變位點(diǎn)即a187v和w556l的油菜mals3基因，該雙突變位在油菜基因組中尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。經(jīng)過轉(zhuǎn)基因擬南芥初步的功能驗(yàn)證，結(jié)果表明含此雙突變位點(diǎn)的油菜mals3基因?qū)Τ輨┑榷喾Nals抑制劑類除草劑咪唑啉酮類(咪唑乙酰胺)、磺酰脲類(苯磺隆)、三唑嘧啶磺酰胺類(雙氟磺酰胺)和嘧啶水揚(yáng)酸類(雙草醚)具有明顯的抗性。該抗性基因可用于抗除草劑農(nóng)作物的培育。

四、附圖說明

圖1.突變位點(diǎn)示意圖。

mutatedals、m342和z11526.1分別指定點(diǎn)突變后的als基因、m342的als基因和序列號為z11526.1的als3基因的局部堿基序列；mutatedprotein和wildalsprotein為點(diǎn)突變后翻譯的als蛋白的氨基酸序列。其中靠近5’端的突變位點(diǎn)是新引入的突變位點(diǎn)，3’端的突變位點(diǎn)是m342原來具有的突變位點(diǎn)。

圖2.重疊pcr的電泳結(jié)果。

第1欄為分子量標(biāo)記(mkd2000:1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)，第2欄為基因5’端的大小約為570bp的pcr產(chǎn)物，第3欄為3’末大小約為1400bp的pcr產(chǎn)物，第4欄重疊pcr的最終產(chǎn)物也即為全長的pcr產(chǎn)物，大小約為1960bp的目標(biāo)片段。

圖3.所克隆的經(jīng)點(diǎn)突變的bnmals3基因核甘酸序列及其編碼蛋白的氨基酸序列。

其中紅色部分為編碼als蛋白質(zhì)的突變位點(diǎn)。

圖4.轉(zhuǎn)基因抗除草劑擬南芥的分子鑒定pcr產(chǎn)物。

第1欄是dna標(biāo)記mgenstar,d2000plus(5000,3000,2000,1000,750,500,250,100)，第2、3、4欄分別是als3和35s、和nos終止子的pcr產(chǎn)物。

圖5.pp0390-alsmncoi和smai酶切圖譜。

mgenstar,d2000plus(5000,3000,2000,1000,750,500,250,100)

圖6.除草劑篩選獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥。

圖7.轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的pcr鑒定結(jié)果。

圖8.轉(zhuǎn)基因擬南芥核酸雜交驗(yàn)證結(jié)果。

第1欄是dna分子量標(biāo)記，第2欄為陰性對照,第3-10是轉(zhuǎn)基因擬南芥植株基因組dna，第11欄是質(zhì)粒。

圖9.噴咪唑啉酮類除草劑咪唑乙酰胺效果。

圖10.噴磺酰脲類除草劑苯磺隆效果。

圖11.噴三唑咪啶磺胺類除草劑雙氟磺草胺效果。

圖12.噴嘧啶水揚(yáng)酸類除草劑雙草醚效果。

五、具體實(shí)施方式

(一)材料與方法：

1材料：

1.1抗除草劑甘藍(lán)型油菜品系m342(見授權(quán)專利zl201310111739.5一種甘藍(lán)型油菜抗磺酰脲類除草劑基因及其應(yīng)用)，系江蘇省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物研究所油菜研究室通過ems誘變獲得，研究證明該品系對磺酰脲類除草劑具有抗性。因其als3基因在1667位的堿基發(fā)生點(diǎn)突變，由原來的g堿基突變成了t堿基，導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)序列在556位點(diǎn)由色氨酸(w)突變?yōu)榱涟彼?l)，即w556l。(見授權(quán)專利zl201310111739.5)

1.2fastpfudna聚合酶、克隆載體peasy-t1、tagdna聚合酶、質(zhì)粒提取、膠回收試劑盒購自南京百斯凱生物技術(shù)有限公司，重組克隆試劑盒clonexpresstm，pcrmix購自南京諾唯贊生物科技有限公司。southern雜交試劑盒pcrdigprobesynthesiskit和地高辛雜交檢測試劑盒ii均購自roche公司。農(nóng)桿菌gv3101系公知公用。

1.3.pcambia0390(genbankno.af234291.1)和pcambia2300(genbankno.af234315.1)質(zhì)粒系澳大利亞pcambia公司惠贈。(均為公開序列，可以購買。)

2方法

2.1引物設(shè)計(jì)：應(yīng)用primerpremier5.0軟件分別依據(jù)模板序列設(shè)計(jì)各類引物。用于構(gòu)建植物表達(dá)載體的引物則根據(jù)clonexpress^tm快速克隆原理，在擴(kuò)增引物5’末端添加15個(gè)bp與連接片段末端同源的序列(小寫字母為同源序列)(見引物序列表1)。通過重組酶反應(yīng)將目的基因序列整合到載體中。

2.2.抗除草劑油菜als基因克隆：以抗除草劑油菜m342基因組dna為模板，用引物對alsf/alsr及高保真dna聚合酶擴(kuò)增油菜的als3基因；擴(kuò)增體系：5×transstartfastpfubuffer10μl,基因組dna1μl，10μm35-s-alsf1μl，10μmalsr1μl，2.5mmdntps5μl,transstartfastpfudna聚合酶1μl，補(bǔ)足ddh2o到50μl；溫度程序：95℃，3min，95℃，30sec，58℃，30sec，72℃2min，35個(gè)循環(huán)后，72℃，5min，瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物，膠回收純化2kb的pcr產(chǎn)物并克隆到peasy-t1載體上經(jīng)測序確定，獲得克隆有抗除草劑油菜m342als3基因的peasy-t1質(zhì)粒；

2.3利用重疊pcr引入堿基突變：

迄今為止，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的als基因中，有8個(gè)位點(diǎn)，總計(jì)約26個(gè)氨基酸的替換突變會對相應(yīng)的除草劑產(chǎn)生抗性。這8個(gè)位點(diǎn)分別是：ala122、pro197、ala205、asp376、arg377、trp574、ser653、gly654，這些位點(diǎn)所標(biāo)注的數(shù)值均是相對于模式植物擬南芥的als酶蛋白氨基酸序列的位置。目前在油菜中報(bào)道的als基因突變位點(diǎn)比較少，僅限于197位、574和653位的氨基酸替換。這些部位的改變僅賦予油菜對咪唑啉酮類、磺酰脲類除草劑的抗性，對其它als抑制劑類除草劑則不具抗性。油菜als基因突變多是利用化學(xué)誘變劑處理油菜種子，然后篩選抗除草劑突變體，并進(jìn)一步鑒定抗除草劑突變體的基因型。鑒于誘變具有隨機(jī)性，需要篩選大量的種子，工作量比較大。如果能在體外進(jìn)行定點(diǎn)突變，并通過轉(zhuǎn)基因途徑驗(yàn)證突變基因功能，再利用現(xiàn)代的基因編輯技術(shù)將突變基因敲入到油菜染色體組中，這樣就可以較快地獲得新的抗除草劑油菜。

抗除草劑油菜m342的als3基因上，存在一個(gè)突變位點(diǎn)，即位于核苷酸序列第1667位堿基由g突變成t，導(dǎo)致其編碼的als蛋白氨基酸序列在556位由色氨酸(w)變成亮氨酸(l)，因此，m342對咪唑啉酮類、磺酰脲類除草劑具有明顯抗性。本發(fā)明在抗除草劑油菜m342的als3基因上，引入第二個(gè)突變位點(diǎn)，探討體外突變在創(chuàng)造油菜新的抗除草劑基因的可行性，通過引物設(shè)計(jì)在特殊位點(diǎn)上引入堿基突變，再利用重疊pcr技術(shù)，最終目的是創(chuàng)造新的點(diǎn)突變位點(diǎn)。

經(jīng)過與多種植物的als基因的核酸序列和編碼的氨基酸序列比對分析，本發(fā)明嘗試找到油菜的als3基因的核苷酸序列第560位堿基由c突變成t，對應(yīng)的als酶蛋白第187位點(diǎn)，該位點(diǎn)原來編碼的是丙氨酸(a)，現(xiàn)通過生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)將其突變成纈氨酸(v)。

根據(jù)序列測定結(jié)果，設(shè)計(jì)2對特異性引物旨在als基因編碼區(qū)的560位將c堿基替換成t堿基。以克隆有抗除草劑油菜m342的als3基因的peasy-t1質(zhì)粒為模板，分別用引物對alsf/alsrm和alsfm/alsr擴(kuò)增出上游片段(大小為572bp)和下游片段(大小為1412bp)；

擴(kuò)增體系：5×transstartfastpfubuffer10μl,基因組dna1μl，10μm引物取1μl，2.5mmdntps5μl,transstartfastpfudna聚合酶1μl，補(bǔ)足ddh2o到50μl；

溫度程序：95℃，3min，95℃，30sec,58℃,30sec,72℃1min,35個(gè)循環(huán)后，72℃，5min。

瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物分別回收大小約572bp和1412bp的上、下游pcr產(chǎn)物。后以上、下游產(chǎn)物的混合物為模板，用引物對alsf/alsr擴(kuò)增出全長的als3基因序列。

擴(kuò)增體系：5×transstartfastpfubuffer10μl,基因組dna1μl，10μm引物取1μl，2.5mmdntps5μl,transstartfastpfudna聚合酶1μl，補(bǔ)足ddh2o到50μl；

溫度程序：95℃，1min，55℃30sec,72℃2min,再95℃，30sec,58℃,30sec,72℃2min,35個(gè)循環(huán)，72℃，5min。

瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物分別回收大小約2000bp的片段，然后克隆到peasy-t1上，并測序分析，該產(chǎn)物序列除了在560處引入了點(diǎn)突變c/t外，其余堿基序列與m342的als3基因序列完全一致，定名為mals3；

分別用引物對alsf/alsrm和alsfm/alsr擴(kuò)增出上游和下游2個(gè)片段，分別回收后，以上、下游pcr產(chǎn)物混合物為模板，用全長引物alsf/alsr擴(kuò)增出全長序列alsm，然后克隆到peasy-t1上，并測序分析。

2.4植物表達(dá)載體構(gòu)建：以載體pcambia2300質(zhì)粒dna為模板，分別用引物對p0390-35sf/35sr和als-nosf/nosp0390r擴(kuò)增35s啟動子序列(約450bp)和nos終止子序列(約250bp)，膠回收相應(yīng)大小的pcr產(chǎn)物；以克隆有mals3基因的peasy-t1質(zhì)粒為模板，用引物對35s-alsf/alsr擴(kuò)增mals3基因，膠回收大小約2000bp的pcr產(chǎn)物，通過重組反應(yīng)克隆到smali酶切線性化的pcambia0390載體上。

反應(yīng)體系如下：5×cemultisbuffer4μl，mals3pcr產(chǎn)物2μl，35spcr產(chǎn)物2μl，nospcr產(chǎn)物2μl，exnase^tm2μl，線性化載體4μl,ddh2o2μl，于37℃下反應(yīng)30min，后取5-10μl反應(yīng)液轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，挑克隆pcr鑒定，抽提質(zhì)粒酶切鑒定，最終經(jīng)測序確定后，由此獲得的質(zhì)粒定名為p0390-mals3；

2.5擬南芥轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌液浸花的方法轉(zhuǎn)化擬南芥。具體步驟首先用p0390-mals3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌gv3101，挑取轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌gv3101單克隆于5ml添加了利福平10mg/l、慶大霉素50mg/l、卡那霉素25mg/l的yeb液體培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)過夜。取1ml菌培養(yǎng)液于50ml相同培養(yǎng)基中再培養(yǎng)過夜至od600為0.8～1.0，離心，收集菌體，用ms液體培養(yǎng)基洗滌菌體1次，離心，菌體重新懸浮于ms液體培養(yǎng)基中，od600值在0.8左右。并加入silwetl-77至0.01％，混勻。每株花序浸泡1分鐘，處理10株，一周后，重復(fù)處理一次。成熟時(shí)收獲種子，日光下曬干。

2.6抗除草劑擬南芥植株的篩選將收獲到的種子播種于含有蛭石和營養(yǎng)土(2：1)的小盆缽中，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件光照16h,溫度22℃，黑暗8h，溫度18℃。待種子萌發(fā)至子葉展平時(shí)，于葉面噴施15μg/ml的苯磺隆溶液，由此篩選轉(zhuǎn)基因抗除草劑苯磺隆的t0代植株。讓t0植株繼續(xù)生長至開花結(jié)籽。將收獲到的t0代植株上的種子播種在盆缽中，即為t1代植株。待子葉展平后，再用15μg/ml的苯磺隆溶液噴施，篩選抗除草劑植株。讓抗性植物繼續(xù)生長至10余片真葉時(shí)，分別噴施咪唑乙酰胺(166.67μg/ml)、苯磺隆(15μg/ml)、雙氟磺酰胺(4.15μg/ml)和雙草醚(10μg/ml)，進(jìn)行各種als抑制劑類除草劑的抗性鑒定。

2.7轉(zhuǎn)基因抗除草劑擬南芥的分子鑒定：取抗除草劑轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的葉片用ctab方法提取基因組dna，進(jìn)行pcr鑒定和southern雜交鑒定。pcr鑒定的擴(kuò)增體系是：2×pcrmix10μl，引物saf和sar各1l，去離子水7μl，dna模板1μl。溫度程序：95℃，3min，95℃，30sec,58℃,30sec,72℃35sec，35個(gè)循環(huán)后，72℃，5min。1％瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物。southern雜交鑒定探針為熒光標(biāo)記的35s啟動子序列，探針長度為454bp。雜交實(shí)驗(yàn)按照試劑盒說明書進(jìn)行。

3.結(jié)果

3.1.體外定點(diǎn)突變als3基因克隆與分析

本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖抢皿w外定點(diǎn)突變技術(shù)在已經(jīng)克隆的抗除草劑油菜m342的als3基因序列中引入一個(gè)新的突變位點(diǎn)。如圖1所示。該位點(diǎn)位于als3基因的第560位，原來是c堿基，編碼187位的丙氨酸，經(jīng)突變成t堿基后則在187位變成了纈氨酸。我們通過在相應(yīng)區(qū)域設(shè)計(jì)特定的含有突變堿基t的pcr引物擴(kuò)增目的基因片段引入突變，使其突變后的堿基由c變成t。經(jīng)體外突變的als3基因定名為mals3。

經(jīng)克隆、測序，mals3序列除了在560處引入的點(diǎn)突變(c/t)外其它的堿基序列與m342的als3基因序列完全一致。利用ncbi網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)分析mals3基因的序列結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，該基因編碼區(qū)全長由1959bp組成，編碼652個(gè)氨基酸(圖3)。其中masl3基因序列與z11526.1的基因序列亦顯示高度同源，但存在4個(gè)snp位點(diǎn)的差異：其中2個(gè)snp導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)序列的改變,分別是560堿基序列由c變?yōu)閠，導(dǎo)致187位的丙氨酸突變成了纈氨酸(a187v)該位點(diǎn)為新引入的突變位點(diǎn)，和第1667位堿基g變?yōu)閠，導(dǎo)致als蛋白質(zhì)第556位的色氨酸突變?yōu)榱肆涟彼?w556l)，為m342原有的突變位點(diǎn)。

3.2植物表達(dá)載體構(gòu)建

為進(jìn)一步驗(yàn)證經(jīng)過體外突變獲得的雙位點(diǎn)突變基因抗als抑制劑類除草劑的功能，本研究將pcr獲得的mals3基因序列(1959bp)、35s啟動子序列(454bp)和nos終止子序列(253bp)(圖4)，利用重組克隆技術(shù)，克隆到了pcambia0390的smali位點(diǎn)，獲得的植物表達(dá)載體，初步命名為p0390-mals3。該質(zhì)粒dna經(jīng)限制性內(nèi)切酶smali切可以獲得由35s、mals編碼序列nos終止子組成的大小為2993bp的片段，見圖5。并經(jīng)過測序進(jìn)一步驗(yàn)證各目的片段連接正確。

3.3轉(zhuǎn)基因擬南芥篩選與鑒定

經(jīng)過除草劑篩選，初步獲得9個(gè)抗除草劑擬南芥株系(圖5)。并進(jìn)一步用特異性引物對其基因組dna進(jìn)行了pcr鑒定。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了高度特異性引物對，上、下游引物分別取自35s啟動子3’末端序列和mals3基因5’末端序列，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期大小為374bp。經(jīng)檢測所有經(jīng)除草劑苯磺隆篩選到的陽性植株均可以擴(kuò)增出相應(yīng)大小的pcr產(chǎn)物(圖6)。

3.4轉(zhuǎn)基因擬南芥核酸雜交驗(yàn)證結(jié)果

進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因抗除草劑擬南芥是真正的轉(zhuǎn)基因擬南芥，本實(shí)驗(yàn)對其進(jìn)行了核酸雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果也證明獲得的抗除草劑擬南芥均為轉(zhuǎn)基因擬南芥。雜交結(jié)果見圖8。

3.5轉(zhuǎn)基因擬南芥抗除草劑特性驗(yàn)證

為檢驗(yàn)轉(zhuǎn)mals3基因擬南芥抗除草劑特性，我們在擬南芥苗期(10張葉片期)依此應(yīng)用4種als抑制劑類除草噴霧葉片。結(jié)果見圖9-12。

噴咪唑啉酮類除草劑效果:見圖9,上為轉(zhuǎn)基因苗,下為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?。左上下為噴水處理，右上下為噴除草劑處理。本?shí)驗(yàn)噴除草劑咪唑乙酰胺，濃度為田間使用濃度，換算成有效濃度為166.67μg/ml。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，非轉(zhuǎn)基因擬南芥在噴除草劑后死亡,而轉(zhuǎn)基因擬南芥能正常生長,表明轉(zhuǎn)基因擬南芥對咪唑啉酮類除草劑具有明顯抗性。

噴磺酰脲類除草劑效果:見圖10,上為轉(zhuǎn)基因苗,下為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?。左上下為噴水處理，右上下為噴除草劑處理。本?shí)驗(yàn)噴除草劑苯磺隆，濃度為田間使用濃度，換算成有效濃度為15μg/ml。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，非轉(zhuǎn)基因擬南芥在噴除草劑后死亡,而轉(zhuǎn)基因擬南芥能正常生長,表明轉(zhuǎn)基因擬南芥對磺酰脲類除草劑具有明顯抗性。

噴三唑嘧啶磺酰胺類除草劑效果:見圖11,上為轉(zhuǎn)基因苗,下為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡Ｗ笊舷聻閲娝幚?，右上下為噴除草劑處理。本?shí)驗(yàn)噴除草劑雙氟磺草胺，濃度為田間使用濃度，換算成有效濃度為4.15μg/ml。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，非轉(zhuǎn)基因擬南芥在噴除草劑后死亡,而轉(zhuǎn)基因擬南芥能正常生長,表明轉(zhuǎn)基因擬南芥對三唑嘧啶磺酰胺類除草劑具有明顯抗性。

噴嘧啶水揚(yáng)酸類除草劑效果:見圖12,上為轉(zhuǎn)基因苗,下為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?。左上下為噴水處理，右上下為噴除草劑處理。本?shí)驗(yàn)噴除草劑雙草醚，該除草劑系嘧啶水揚(yáng)酸類除草劑，濃度為田間使用濃度，換算成有效濃度為10μg/ml。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，非轉(zhuǎn)基因擬南芥在噴除草劑后死亡,而轉(zhuǎn)基因擬南芥能正常生長,表明轉(zhuǎn)基因擬南芥對嘧啶水揚(yáng)酸類除草劑具有明顯抗性。

小結(jié)：本發(fā)明嘗試應(yīng)用體外定點(diǎn)突變技術(shù)獲得一個(gè)具有雙突變位點(diǎn)即a187v和w556l的油菜mals3基因，該雙突變位在油菜基因組中尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。經(jīng)過轉(zhuǎn)基因擬南芥初步的功能驗(yàn)證，結(jié)果表明含此雙突變位點(diǎn)的油菜mals3基因?qū)Χ喾Nals抑制劑類除草劑咪唑啉酮類(咪唑乙酰胺)、磺酰脲類(苯磺隆)、三唑嘧啶磺酰胺類(雙氟磺酰胺)和嘧啶水揚(yáng)酸類(雙草醚)具有明顯的抗性。該抗性基因可用于抗除草劑農(nóng)作物的培育。

seqidno.1:

sequencelisting

<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>基于體外定點(diǎn)突變獲得的油菜抗多種als除草劑基因及應(yīng)用

<130>0

<160>12

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1959

<212>dna

<213>油菜m342

<220>

<221>mals3

<222>(1)..(1959)

<400>1

atggcggcggcaacatcgtcttctccgatctccttaaccgctaaaccttcttccaaatcc60

cctctacccatttccagattctcccttcccttctccttaaccccacagaaaccctcctcc120

cgtctccaccgtccactcgccatctccgccgttctcaactcacccgtcaatgtcgcacct180

gaaaaaaccgacaagatcaagactttcatctcccgctacgctcccgacgagccccgcaag240

ggtgctgatatcctcgtggaagccctcgagcgtcaaggcgtcgaaaccgtcttcgcttat300

cccggaggtgcctccatggagatccaccaagccttgactcgctcctccaccatccgtaac360

gtcctcccccgtcacgaacaaggaggagtcttcgccgccgagggttacgctcgttcctcc420

ggcaagccgggaatctgcatagccacttcgggtcccggagctaccaacctcgtcagcggg480

ttagccgacgcgatgcttgacagtgttcctctcgtcgccatcacaggacaggtccctcgc540

cggatgatcggtactgacgtgttccaagagacgccaatcgttgaggtaacgaggtctatt600

acgaaacataactatctggtgatggatgttgatgacatacctaggatcgttcaagaagca660

ttctttctagctacttccggtagacccggaccggttttggttgatgttcctaaggatatt720

cagcagcagcttgcgattcctaactgggatcaacctatgcgcttgcctggctacatgtct780

aggctgcctcagccgccggaagtttctcagttaggccagatcgttaggttgatctcggag840

tctaagaggcctgttttgtacgttggtggtggaagcttgaactcgagtgaagaactgggg900

agatttgtcgagcttactgggatccctgttgcgagtacgttgatggggcttggctcttat960

ccttgtaacgatgagttgtccctgcagatgcttggcatgcacgggactgtgtatgctaac1020

tacgctgtggagcatagtgatttgttgctggcgtttggtgttaggtttgatgaccgtgtc1080

acgggaaagctcgaggcgtttgcgagcagggctaagattgtgcacatagacattgattct1140

gctgagattgggaagaataagacacctcacgtgtctgtgtgtggtgatgtaaagctggct1200

ttgcaagggatgaacaaggttcttgagaaccgggcggaggagctcaagcttgatttcggt1260

gtttggaggagtgagttgagcgagcagaaacagaagttcccgttgagcttcaaaacgttt1320

ggagaagccattcctccgcagtacgcgattcaggtcctagacgagctaacccaagggaag1380

gcaattatcagtactggtgttggacagcatcagatgtgggcggcgcagttttacaagtac1440

aggaagccgaggcagtggctgtcgtcctcaggactcggagctatgggtttcggacttcct1500

gctgcgattggagcgtctgtggcgaaccctgatgcgattgttgtggacattgacggtgat1560

ggaagcttcataatgaacgttcaagagctggccacaatccgtgtagagaatcttcctgtg1620

aagatactcttgttaaacaaccagcatcttgggatggtcatgcaattggaagatcggttc1680

tacaaagctaacagagctcacacttatctcggggacccggcaagggagaacgagatcttc1740

cctaacatgctgcagtttgcaggagcttgcgggattccagctgcgagagtgacgaagaaa1800

gaagaactccgagaagctattcagacaatgctggatacacctggaccgtacctgttggat1860

gtcatctgtccgcaccaagaacatgtgttaccgatgatcccaagtggtggcactttcaaa1920

gatgtaataaccgaaggggatggtcgcactaagtactga1959

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工

<220>

<221>alsf

<222>(1)..(19)

<400>2

atggcggcggcaacatcgt19

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工

<220>

<221>als

<222>(1)..(22)

<400>3

tcagtacttagtgcgaccatcc22

<210>4

<211>39

<212>dna

<213>人工

<220>

<221>p0390-35sf

<222>(1)..(39)

<400>4

caggtcgacggatccccgggatggtggagcacgacactc39

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工

<220>

<221>35-sr

<222>(1)..(25)

<400>5

agagatagatttgtagagagagact25

<210>6

<211>34

<212>dna

<213>人工

<220>

<221>35-s-alsf

<222>(1)..(34)

<400>6

tacaaatctatctctatggcggcggcaacatcgt34

<210>7

<211>33

<212>dna

<213>人工

<220>

<221>als-nosf

<222>(1)..(33)

<400>7

cgcactaagtactgacgttcaaacatttggcaa33

<210>8

<211>41

<212>dna

<213>人工

<220>

<221>nosp0390r

<222>(1)..(41)

<400>8

actcctcttagaattcccgggcccgatctagtaacatagat41

<210>9

<211>25

<212>dna

<213>人工

<220>

<221>alsrm

<222>(1)..(25)

<400>9

gtctcttggaacacgtcagtaccga25

<210>10

<211>25

<212>dna

<213>

<220>

<221>alsfm

<222>(1)..(15)

<400>10

tcggtactgacgtgttccaagagac25

<210>11

<211>23

<212>dna

<213>

<220>

<221>saf

<222>(1)..(23)

<400>11

ccatcattgcgataaaggaaagg23

<210>12

<211>23

<212>dna

<213>

<220>

<221>sar

<222>(1)..(23)

<400>12

ggttaaggagaagggaagggaga23