本發(fā)明屬于細胞分選領域，特別涉及一種包埋功能化納米纖維膜的微流控芯片及其應用。

背景技術：

隨著人們生活方式的變化和人口老齡化趨勢的加劇，癌癥已經(jīng)成為現(xiàn)代人類死亡的第一大因素。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報告，2015年中國癌癥新發(fā)腫瘤病例429.2萬，死亡病例281.4萬。這其中90％的癌癥死亡病例都與腫瘤的轉移密切相關。在腫瘤轉移初期，腫瘤細胞從原發(fā)灶實體瘤上脫落，進入血液，成為循環(huán)腫瘤細胞(ctc)，有研究表明，許多腫瘤在直徑一毫米的情況下，已可以在血液里查到ctc，且癌癥病人外周血中的ctc數(shù)量與病情發(fā)展有緊密聯(lián)系。因而，ctc的檢測對于腫瘤的早期診斷、疾病發(fā)展預測、療效評估、預后判斷和個體化治療具有極其重要的意義。

但血液中ctc的數(shù)目極其稀少(大約每10⁶～10⁷個白細胞中才有一個循環(huán)腫瘤細胞)，采用常規(guī)手段難以實現(xiàn)分離和捕獲。例如：cellsearch是目前唯一獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局認可并用于ctc檢測的商業(yè)化產(chǎn)品。但是cellsearch的技術同其他大多數(shù)陽性分選的方法一樣，只能分離全血中上皮起源型的ctc，且檢測成本高，以磁珠靶向結合ctc不利于后續(xù)的檢測分析。陰性分選是以血液中的紅細胞和白細胞為去除對象，通過去除白細胞和紅細胞來實現(xiàn)ctc的分離和富集。與陽性分選方法相比，陰性分選不受腫瘤細胞表型的影響，適用于分選各種類型的腫瘤細胞，此外，陰性分選的方法省去了ctc釋放的環(huán)節(jié)，減少循環(huán)腫瘤細胞的損傷，且操作簡便，便于后續(xù)分析。盡管相比陽性分選，陰性分選的方法存在諸多優(yōu)點，但在實際操作中利用陰性分選方法分離富集ctc依然存在較多問題，仍需要改進和提升。例如，bhuvanendran等人以磁性顆粒靶向結合白細胞，通過外加磁場分離去除白細胞，再以微孔濾膜過濾除去紅細胞，最終實現(xiàn)ctc的分選。{s.bhuvanendrannairgourikutty,changchia-pin,danielpuiupoenar.anintegratedon-chipplatformfornegativeenrichmentoftumorcells.j.chromatogr.b,2016,1028,153-164.}diéguez等人利用微流控技術，在微流控通道內(nèi)修飾白細胞抗體cd45靶向捕獲白細胞，從而實現(xiàn)ctc細胞的陰性分選，并且通過硫酸腐蝕通道獲得粗糙面，增加靶向位點，提高cd45抗體對白細胞的捕獲效率。但該方法過程中損失了較多的ctc，最終得到的ctc回收率較低(僅為50％)，此外，硫酸腐蝕的方法易造成污染，且不能控制通道內(nèi)部形貌。{l.diéguez,am.a.winter,ak.j.pocock,etal.efficientmicrofluidicnegativeenrichmentofcirculatingtumorcellsinbloodusingroughenedpdms.analyst,2015,140,3565-3572.}hyun等人采用魚骨形微流控通道，直接以載玻片為底板，通過cd45抗體靶向結合白細胞，用于ctc的陰性分選。上述幾種方法都是通過抗原-抗體(cd45抗體)結合的方式去除白細胞，結合力較弱、靈敏度低，白細胞捕獲效率較低。{kyung-ahyun,taeyoonlee,hyo-iljung.negativeenrichmentofcirculatingtumorcellsusingageometricallyactivatedsurfaceinteractionchip.anal.chem.2013,85,4439-4445.}針對上述情況本發(fā)明以納米纖維膜為底物，增加了靶細胞與基底的碰撞接觸幾率，并以生物素-親和素為結合配體，結合力強，特異性高。

靜電紡納米纖維具有比表面積大、形貌可控以及易于功能化修飾等優(yōu)點，將靜電紡納米纖維膜用于ctc的分離富集，可以增加細胞與靶向材料的碰撞接觸幾率，進而提高細胞的捕獲效率。近年來，基于微流控芯片和納米材料的檢測平臺受到了廣泛的關注。微流控芯片具有樣品需求量少、檢測靈敏度高和分析速度快等優(yōu)點，非常適合應用于細胞分選。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種包埋功能化納米纖維膜的微流控芯片及其應用，該芯片針對循環(huán)腫瘤細胞傳統(tǒng)分選方法存在的效率低、操作復雜、易損傷細胞等問題，利用表面功能化的納米纖維特異性粘附血液中的白細胞，結合微流控分選技術，實現(xiàn)循環(huán)腫瘤細胞的高效分離。

本發(fā)明的一種包埋功能化納米纖維膜的微流控芯片，包括玻璃底板、樣品注入口、細胞捕獲通道和儲液池，所述功能化納米纖維膜位于細胞捕獲通道和玻璃底板之間；其中，功能化納米纖維膜為表面修飾有鏈霉親和素(streptavidin，sa)的納米纖維膜。

所述細胞捕獲通道內(nèi)具有250-300個橢圓柱陣列。

所述納米纖維膜為采用靜電紡絲技術制備的plga納米纖維膜。

靜電紡絲工藝參數(shù)為：電壓為20kv，接收距離為12cm，流速為0.4ml/h，單管噴頭，環(huán)境溫度為20-25℃，相對濕度為30-40％。

所述微流控芯片的四周為開有螺栓孔的有機玻璃板。

本發(fā)明還提供了一種包埋功能化納米纖維膜的微流控芯片的應用，所述微流控芯片用于去除白細胞及陰性分選循環(huán)腫瘤細胞。

具體步驟如下：

(1)以表面修飾有sa的plga納米纖維膜為基底，通過等離子處理將玻璃基底、plga納米纖維膜與微流控通道鍵合，得到微流控芯片；

(2)將半胱氨酸(l-cysteine)溶液通入微流控芯片，再通入磷酸鹽緩沖液(pbs)，得到表面鈍化處理后的微流控芯片；

(3)取血液樣品，利用紅細胞裂解液去除血液中的紅細胞，得到白細胞懸浮液，隨后用4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚dapi對得到的白細胞進行染色，并用血球計數(shù)板對白細胞進行計數(shù)；再利用生物素化的白細胞抗體anti-cd45通過抗原-抗體結合對白細胞進行生物素標記，得到生物素標記的白細胞懸浮液；最后將白細胞懸浮液通入步驟(2)得到的微流控芯片，即可。

所述步驟(1)中的修飾sa的方法為：將plga納米纖維膜放入到加有超純水的染色缸中，利用二氯乙烷edc和n-羥基硫代琥珀酰亞胺nhs活化納米纖維膜表面的羧基；逐滴加入濃度為1.25-1.5mg/ml的鏈霉親和素溶液，磁力攪拌下反應2-3天，然后用超純水對反應后的納米纖維膜清洗，自然晾干，得到鏈霉親和素功能化的plga納米纖維膜。

將鏈霉親和素功能化的plga納米纖維膜按照長50mm、寬8mm的尺寸裁切，以匹配微流控通道尺寸。

所述步驟(2)中的半胱氨酸溶液的濃度為5mg/ml，通入時間為30min。

所述步驟(3)中的生物素化的白細胞抗體anti-cd45濃度為50μg/ml，與血液樣品的體積比為1:50。

本發(fā)明將納米纖維膜與微流控芯片相結合，針對循環(huán)腫瘤細胞傳統(tǒng)分選方法存在的效率低、操作復雜、易損傷細胞等問題，利用表面功能化的納米纖維特異性黏附血液中的白細胞，結合微流控分選技術，實現(xiàn)循環(huán)腫瘤細胞的高效分離。本發(fā)明有如下優(yōu)點：第一，采用微流控通道包埋納米纖維技術利用陰性捕獲法將血液中的白細胞捕獲，而直接分選出循環(huán)腫瘤細胞方法，適用于分選各種類型的腫瘤細胞，此外，該分選的方法省去了細胞釋放的環(huán)節(jié)，減少循環(huán)腫瘤細胞損傷，且操作簡便，便于后續(xù)分析。第二，傳統(tǒng)抗體修飾，缺陷在于結合力低。該方法利用親和素-生物素的特異性結合捕獲白細胞，結合力強，特異性高。第三，陰性捕獲法可以采用二級或多級芯片結構進行多次分選，使白細胞的捕獲效率大大提高，進而提高癌細胞分離純度。本發(fā)明操作簡便，并且過程中使用的鏈霉親和素方便易得，性質穩(wěn)定，可以高效、無損分選循環(huán)腫瘤細胞。

有益效果

(1)本發(fā)明以plga-sa納米纖維膜為基底，結合微流控技術，具有裝置簡易、重復性好的優(yōu)點；

(2)采用鏈霉親和素修飾的納米纖維膜特異性捕獲血液中的白細胞，不需要進行循環(huán)腫瘤細胞的后續(xù)釋放，直接分選出高活性的循環(huán)腫瘤細胞，對腫瘤細胞沒有損傷，過程操作簡便、分離效率高；

(3)所需血液樣品量少，檢測效率高，具有很好的應用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明用于陰性捕獲循環(huán)腫瘤細胞的芯片(b)以及原理圖(a)；

圖2為本發(fā)明制備的plga靜電紡納米纖維的sem圖(左)及直徑分布圖(右)；

圖3為本發(fā)明制備的plga靜電紡納米纖維(a)、經(jīng)過sa修飾后的plga納米纖維(b)和sa粉末的紅外光譜圖(c)；

圖4為本發(fā)明制備的plga納米纖維、經(jīng)過sa修飾的功能化后納米纖維的熱重分析圖；

圖5為本發(fā)明制備的plga靜電紡納米纖維、經(jīng)過sa修飾后的plga納米纖維和經(jīng)過半胱氨酸修飾后的sa-plga納米纖維的水接觸角圖像；

圖6為本發(fā)明制備的plga靜電紡納米纖維、經(jīng)過sa修飾后的plga納米纖維和經(jīng)過半胱氨酸修飾后的sa-plga納米纖維的水接觸角；

圖7(a)為本發(fā)明制備的sa修飾的功能化靜電紡plga納米纖維對血液相容性的評價的紫外吸收圖譜；(b)為(a)圖在500-600nm處的放大圖；

圖8為本發(fā)明制備的sa修飾的功能化靜電紡plga納米纖維在不同的時間點的抗凝血行為；

圖9為本發(fā)明制備的sa修飾的功能化靜電紡plga納米纖維微流控芯片對裂解紅細胞后健康人全血在不同流速在(0.125ml/h、0.25ml/h、0.5ml/h、1.0ml/h、2.0ml/h)的動態(tài)捕獲效率；

圖10為該陰性捕獲方法在0.25ml/h的流速下對全血中的循環(huán)腫瘤細胞的分離的效率；

圖11為該陰性捕獲方法對分離出來的癌細胞進行的免疫熒光染色鑒定。

具體實施方式

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。

實施例1

如圖1所示，本實施例提供了一種包埋功能化納米纖維膜的微流控芯片，具體如下：

(1)具有277個橢圓柱陣列的微流控芯片細胞捕獲通道，通道的一端有樣品注入口，另一端有出樣口，進口和出口處以等腰三角的方式設計；(2)修飾有sa的plga靜電紡絲納米纖維膜，納米纖維膜夾在載玻片和聚二甲基硅氧烷pdms通道的中間，形成夾層；(3)修飾有sa的納米纖維膜，根據(jù)生物素-親和素的結合，能特異性捕獲血液中修飾有生物素的白細胞，從而將白細胞捕獲在納米纖維上，將循環(huán)腫瘤細胞流進回收液。

實施例2

plga靜電紡納米纖維的具體方法如下：

(1)稱取1.0g的plga，將其溶于四氫呋喃(thf)和n，n-二甲基甲酰胺(dmf)的混合溶劑(thf和dmf的體積比為3：1)中，然后在磁力攪拌器下攪拌8小時左右，直到plga成為均一穩(wěn)定的溶液為止，得到納米纖維紡絲液濃度為25％(質量/體積)，冷卻至室溫存儲在4℃冰箱中待用。

(2)將上述所制紡絲液緩慢吸取到注射器內(nèi)，利用高壓靜電紡絲機和微量注射泵進行靜電紡絲，紡絲條件為：溫度20-30℃，濕度40-50％，電壓20kv；接收距離12cm；液體流速0.4ml/h。所形成的納米纖維膜通過覆蓋有鋁箔紙的平板裝置接收。然后放入真空干燥箱中12-24h，得到plga納米纖維。

(3)將制得的plga納米纖維膜制樣，然后通過掃描電鏡儀(sem)對其進行形貌的觀察。結果顯示，獲得的納米纖維表面光滑，直徑均勻，纖維平均直徑為(773.1±172.0)nm(圖2)，符合實驗所需的納米級纖維的要求。

實施例3

通過對修飾過的納米纖維進行定性(圖3)和定量(圖4)分析，證明確實制得實驗所需的功能化的plga納米纖維，其修飾的具體步驟如下：

(1)將負載有plga納米纖維膜的載玻片放入到染色架里，再把染色架浸泡在裝超純水的500ml染色缸中，加入edc的濃度為8.0mg/ml，活化30min，之后加入濃度為2.0mg/ml的nhs反應3小時，以此活化plga納米纖維的羧基。

(2)將上述溶液倒掉換上新的超純水，逐滴加入鏈霉親和素溶液(1.25mg/ml)500ml，在磁力攪拌器作用下反應2天，然后用超純水浸泡清洗3次，取出置于通風廚內(nèi)自然晾干。分別對純的plga納米纖維膜，鏈霉親和素以及功能化的納米纖維膜進行紅外表征，由紅外吸收光譜圖可知，sa成功地修飾到plga納米纖維表面(圖3)。然后再對修飾前后的納米纖維膜進行熱重分析，由熱重分析圖可知，plga納米纖維膜表面修飾sa的量為11.7wt％(圖4)。

實施例4

plga納米纖維具有較強的疏水性，這在一定程度上也限制了其應用。通過水接觸角測量儀研究了修飾sa前后plga納米纖維的親水性能。即，將負載有厚度均勻納米纖維的載玻片放在載樣臺上，隨機選取不同的部位，將儀器注射針頭處3μl液滴滴在纖維氈上，通過測量軟件測定接觸角的大小，并將拍攝液滴形貌如圖5所示，由此可知plga納米纖維、修飾有sa的納米纖維以及sa-lysteine納米纖維的接觸角在0s時分別為127.0±0.40°，41.2±1.0°和28.9±0.2°。圖6所示為1min內(nèi)各種材料上接觸角的變化情況。這說明修飾后的納米纖維具有較強的親水性能。

實施例5

血液相容性是評定一種材料能否應用于捕獲血液中存在ctcs的重要指標。通過溶血實驗評價所制備的納米纖維膜的血液相容性。

取1ml健康人的血液，離心5min(轉速為1500r/min)，棄上清，用pbs洗滌沉淀5次，得紅細胞。用pbs按照1:10的比例配置紅細胞懸浮液，于4℃冰箱中備用。對照組將0.2ml紅細胞懸濁液分別溶于0.8mlpbs中(陰性對照)和0.8mlh2o中(陽性對照)。然后，將所配置紅細胞懸浮液再稀釋10倍，將sa修飾后的plga納米纖維按照質量體積比為2,4,5,6mg/ml浸入到稀釋10倍后的紅細胞懸浮液中，同一濃度下納米纖維均取3個平行樣，在37℃條件下孵育2h。最后取出纖維氈，將對照組及浸泡過纖維氈的紅細胞懸浮液離心1min(10000r/min)，取上清液并用lamada25型紫外分光光度計對上清液在450-800nm處的吸光值進行測試(圖7)，根據(jù)不同樣品在540nm處的吸光值計算溶液率。

結果表明，在450-800nm范圍內(nèi)，對照組水中上清液的吸光值明顯較高，這表明血紅蛋白含量較高，即紅細胞在水中完全漲破，出現(xiàn)嚴重的溶血現(xiàn)象。但在sa修飾后的plga納米纖維和pbs中，上清液吸光值很低，說明未發(fā)生紅細胞漲破。根據(jù)540nm處吸光值計算可知，當功能化的納米纖維與人血紅細胞懸浮液體積比2,4,5,6mg/ml時，材料的溶血率為(0.24±0.02)％，(0.36±0.21)％，(2.5±0.61)％,(4.1±0.73)％，其值均低于5％，表明該sa修飾后的plga納米纖維均不能使人血細胞產(chǎn)生溶血現(xiàn)象，具有良好的血液相容性。

實施例6

為了驗證sa修飾后的plga納米纖維是否具有抗凝血性，采用動態(tài)凝血時間方法對功能化的納米纖維進行抗凝血性能評價。

首先將sa修飾后的plga納米纖維剪成圓形(φ＝14mm)，放入24孔板中，每個樣品取4個平行樣(對照組是tcp)。然后向每孔纖維氈以及對照組上滴加20μl健康人血液及10μlcacl2溶液(0.2mol/l)，置于37℃條件下孵育5、10、20、40、60min。在每個培養(yǎng)時間結束后，向每個孔板加入3ml蒸餾水，然后再孵育5min，用紫外分光光度計測定540nm的吸光值。

因為血紅蛋白的含量越高代表發(fā)生凝固的血細胞越少，即材料的抗凝血性能越好。圖8所示是sa修飾后的plga納米纖維抗凝血性能的評價結果，對照組為tcp。在不同的時間點，sa修飾后的plga納米纖維上清液中血紅蛋白的吸光值均顯著高于tcp，這說明sa修飾后的plga納米纖維具有較好的抗凝血作用。

實施例7

為了驗證sa修飾后的plga納米纖維對血液中循環(huán)腫瘤陰性捕獲的效果，對血液中的白細胞的特異性捕獲，進行了不同流速下的捕獲效率的測定，結果如圖9所示。

(1)首先，以表面修飾有sa的plga納米纖維膜為基底，通過等離子處理將玻璃基底、plga納米纖維膜與微流控通道鍵合，得到微流控芯片。

微流控芯片包括：(1)具有277個橢圓柱陣列的微流控芯片細胞捕獲通道，通道的一端有樣品注入口，另一端有出樣口，進口和出口處以等腰三角的方式設計；(2)修飾有sa的plga靜電紡絲納米纖維膜，納米纖維膜夾在載玻片和聚二甲基硅氧烷pdms通道的中間，形成夾層；(3)修飾有sa的納米纖維膜，根據(jù)生物素-親和素的結合，能特異性捕獲血液中修飾有生物素的白細胞，從而將白細胞捕獲在納米纖維上，將循環(huán)腫瘤細胞流進回收液。

(2)將濃度為5mg/ml的半胱氨酸(l-cysteine)溶液通入微流控芯片中30min，目的在于減少細胞的非特異性吸附，之后繼續(xù)通入pbs溶液，目的在于把多余的半胱氨酸溶液沖洗干凈。

(3)取1ml新鮮的健康人血液，離心5min(1500r/min)，去除血清，然后加入10倍的紅細胞裂解液進行紅細胞裂解，之后離心，棄上清。再用pbs溶液重懸浮細胞，進行再離心得到白細胞，以洗掉多余的細胞裂解液。然后用4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚dapi對血液中的白細胞進行染色，用血球計數(shù)板對血液中的白細胞進行計數(shù)，之后對血液中的白細胞和濃度50g/ml生物素化的抗體cd45(20μl)在37℃條件下進行孵育處理1h。之后，再加入pbs溶液，離心5min(1000r/min)，以洗掉多余的抗體。觀察對白細胞的捕獲效率。

(4)分別取1×10⁵個細胞在不同的流速下(0.125ml/h，0.25ml/h，0.5ml/h，1.0ml/h，2.0ml/h)通入到微流控通道，由于納米纖維膜表面修飾有大量的鏈霉親和素，而修飾過的白細胞表面含有大量的生物素，利用生物素和親和素之間的結合力，當細胞在微流通道中沿著纖維表面流過時，細胞會被靶向捕獲，粘附在纖維表面，而非靶向細胞就會流出通道，從而實現(xiàn)陰性分選循環(huán)腫瘤細胞的目的。

(5)在熒光顯微鏡下分別對不同流速下捕獲的白細胞進行計數(shù)，求出白細胞的捕獲效率(圖9)。由圖9可知隨著流速的降低，白細胞的捕獲效率提高。當流速為0.125ml/h時，捕獲效率高達95％。當流速為2.0ml/h時，捕獲效率為80％。

實施例8

為了驗證sa修飾后的plga納米纖維對血液中循環(huán)腫瘤陰性分離的效果，選取上述注射泵設定在0.25ml/h的流速下，進行如下實驗操作。

(1)取1ml新鮮的健康人血液，離心5min(1500r/min)，去除血清，然后將稀釋60倍的dapi(500μl)加入到血液中對白細胞進行染色10min，然后加入pbs溶液進行離心5min(1000r/min)，以去除多余未結合的染料。之后在血液中直接加入生物素化的抗體(50μl)進行孵育處理1h。

(2)選取a549細胞作為肺癌細胞的模型，取稀釋60倍的鈣黃綠素(c-am)20μl加入到a549細胞懸浮液中，37℃條件下孵育12min，之后，加培養(yǎng)液進行離心5min(1000r/min)，用細胞計數(shù)器對細胞進行計數(shù)，分別取50、100、200和300個a549細胞加入到上述健康人血液中。

(3)將步驟(2)中計好數(shù)的a549細胞分別加到步驟(1)的血液中，以0.25ml/h的流速通入微流控通道，收集回收液，在熒光顯微鏡下進行計數(shù)，得出循環(huán)腫瘤細胞的分離效率(圖10)。由圖10可知該裝置滿足對循環(huán)腫瘤細胞分選的需求，其循環(huán)腫瘤細胞的分離效率高達92.5％。

實施例9

為了驗證sa修飾后的plga納米纖維對血液中循環(huán)腫瘤細胞陰性分離的效果，取出口處的回收液利用免疫熒光染色對循環(huán)腫瘤細胞進行鑒定，具體操作如下。

(1)取2ml患者血液，首先對血液進行紅細胞裂解處理，以去除紅細胞。然后將稀釋60倍的dapi(500μl)加入到血液中，對血液中剩余的細胞進行染色，然后再加入稀釋50倍的fitc-anti-cd45(20μl)，之后再加入稀釋50倍的ck7(10μl)。

(2)將步驟(1)處理過的血液通入微流控通道，在出口處收集回收液，在熒光顯微鏡下觀察，如圖11所示。由圖11可知，根據(jù)癌細胞鑒別標準，dapi對所有的細胞都進行染色，anti-cd45只對白細胞進行染色，而ck7只能鑒別循環(huán)腫瘤細胞。由此可知，該微流控芯片能實現(xiàn)對血液中循環(huán)腫瘤細胞的分離的目的。