本發(fā)明涉及苦豆子堿二聚體a～d的發(fā)現及其在制備抗炎或抗腫瘤藥物制劑中的應用。
背景技術：
：苦豆子是豆科槐屬植物苦豆子(sophoraalopecuroidesl.)的干燥全草、根及種子，其別名又稱苦甘草、苦豆根、苦豆草等(中國藥學雜志，1993，26：328-329)，始載于《神農本草經》，謂其能安五臟，定志益精(寧夏醫(yī)學院學報，2004，26：214-217)?？喽棺有院⑽犊唷⒂卸?，具有清熱解毒、抗菌消炎作用，民間用其治療胃痛、腹瀉等癥(時珍國醫(yī)國藥，2010，21：2217-2218)。該物種為中國植物圖譜數據庫收錄的有毒植物，全草均有毒。其主要分布在寧夏、甘肅、山西、青海、新疆、河南、內蒙古、河北、陜西等省區(qū)；國外分布于蒙古、哈薩克斯坦及歐洲部分地區(qū)(甘肅畜牧獸醫(yī)，2008，6：36-37)。長期以來研究證明其具有抗炎、抗癌、保肝、抗病毒、抗心率失常、抑菌以及鎮(zhèn)痛等多種藥理作用?？喽棺拥幕瘜W成分主要是蛋白質、糖類、有機酸、黃酮類、色素和生物堿等?？喽棺由飰A屬于喹諾里西啶(quinolizidine)生物堿，由三價氮原子形成的稠合的二個哌啶環(huán)，又稱雙稠哌啶，仍屬于哌啶或吡啶(piperdine)的衍生物。技術實現要素：本發(fā)明的目的是提供苦豆子堿二聚體a～d及其新用途，所述苦豆子堿二聚體a～d的化學結構如下：本發(fā)明的目的之一是提供苦豆子堿二聚體a～d在制備抗炎藥物制劑的應用。本發(fā)明的目的之二是提供苦豆子堿二聚體a～d在制備抗腫瘤藥物制劑的應用。本發(fā)明中所述的抗腫瘤藥物制劑包括肺癌、結腸癌、鼻咽癌、肝癌、宮頸癌、乳腺癌、胃癌和食道癌等各種腫瘤的藥物制劑。具體地，所述抗腫瘤藥物制劑可抑制人非小細胞肺癌細胞、人結腸癌細胞、人鼻咽癌細胞、人肝癌細胞、人宮頸癌細胞、人乳腺癌細胞、人胃癌細胞、人白血病細胞、人食道癌細胞、人前列腺癌細胞、人黑色毒瘤細胞、人口腔上皮癌細胞的生長。所述藥物制劑含有治療有效量的苦豆子堿二聚體a或b或c或d，還包含藥用輔料或其它可配伍的藥物。所述藥用輔料是指常規(guī)的藥用賦形劑，如溶劑、崩解劑、矯味劑、防腐劑、著色劑和粘合劑中的一種或兩種組合。所述其它可配伍的藥物，指的是以有效劑量的苦豆子堿二聚體a或b或c或d為藥物原料，再配伍其它天然藥物或化學藥品。所述的抗炎藥物制劑或抗腫瘤藥物制劑均包括多種臨床藥物劑型，如膠囊劑、顆粒劑、片劑、注射劑、脂質體納米粒、緩釋劑、控釋劑或分散片等。本發(fā)明目的之三是提供一種藥物組合物。具體地，所述藥物組合物，含有作為活性成分的權利要求1的苦豆子堿二聚體a或b或c或d、其藥學上可接受的鹽或它們的溶劑合物，以及藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。作為本發(fā)明另一個實施例，所述藥物組合物，其含有作為活性成分的權利要求2的苦豆子堿二聚體a或b或c或d、其藥學上可接受的鹽或它們的溶劑合物，以及藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。其中，所述藥用賦形劑包括溶劑、崩解劑、矯味劑、防腐劑、著色劑和粘合劑中的一種或兩種以上的組合。本發(fā)明相對于現有技術具有如下的優(yōu)點及技術效果：(1)本發(fā)明的苦豆子堿二聚體a～d具有良好的體內外抗炎、抗腫瘤活性，具有良好的藥用前景。(2)本發(fā)明的苦豆子堿二聚體a～d在治療劑量下未觀察到明顯的毒副作用，尤其是對肝臟、肺和腎臟的毒副作用。附圖說明圖1是新型苦豆子堿二聚體a的x-射線晶體結構圖。圖2是新型苦豆子堿二聚體b的x-射線晶體結構圖。圖3是新型苦豆子堿二聚體c的x-射線晶體結構圖。圖4是新型苦豆子堿二聚體d的x-射線晶體結構圖。具體實施方式下面結合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實驗例1苦豆子堿二聚體的分離取苦豆子的干燥全草150kg，粉碎成粗粉。置提取罐中加入95乙醇800l回流提取2小時，過濾，濾渣再加入95乙醇800l回流提取2小時，過濾。濾液合并，濃縮，得浸膏，浸膏加水混懸，用5％hcl調ph至2～3，加入氯仿萃取5次，每次200l。酸水層再加入氨水調ph至9-10，加入氯仿萃取5次，每次200l，合并氯仿層，回收至干，得浸膏1.95kg。取浸膏拌入80-100目的硅膠2.5kg，裝柱5kg硅膠柱，用氯仿-甲醇(95:5,90:10,85:15,80:20,75:25,70:30,60:40,50:50和0:100)梯度洗脫，通過hplc-ms檢測分子量為496的流份，回收至干，得到富含苦豆子堿二聚體的提取物323g。將富含苦豆子堿二聚體的提取物過sephadexlh-20柱，以hplc-ms檢測，合并分子量為496的流份，回收至干，即得總苦豆子堿二聚體296g。取總苦豆子堿二聚體過ods柱，以甲醇-水(30:70～10:90)梯度洗脫，每250ml為一個流份，回收各流份至干，通過薄層層析(tlc)檢識，合并相同斑點的流份，得到10個流份，分別為fr.1至fr.10。fr.6經過hplc分析，并用制備型高效液相制備，流動相為62％的甲醇-水(萬分之二的二乙胺溶液)，分別得到化合物1(13.5g)和化合物2(11.7g)。fr.8經過hplc分析，并用制備型高效液相制備，流動相為67％的甲醇-水(萬分之二的二乙胺溶液)，得到化合物3(9.2g)。fr.9經過hplc分析，并用制備型高效液相制備，流動相為38％的乙腈-水(萬分之二的二乙胺溶液)，別得到化合物4(8.1g)。實驗例2苦豆子堿二聚體結構鑒定化合物1為無色塊晶(50％甲醇-水)，hr-esi-msm/z:493.3531(calcdfor[m+h]+:493.3537)，給出該化合物的分子式為c30h44n4o2。化合物1為三斜方晶系，空間群是p1，晶胞參數:z＝1，計算密度＝1.237g·cm-3，最終一致因子[i＞2sigma(i)]r1＝0.0617,wr2＝0.1656；一致性因子(alldata)r1＝0.0618,wr2＝0.1657；絕對構型的flack參數為0.00(8)。最后，單晶數據提交保存至cambridgecrystallographicdatacentre(ccdc)數據庫，ccdc號為1522189。通過cu-kαx-射線晶體衍射法鑒定了本化合物結構的絕對構型(圖1)，并通過核磁共振法(1hnmr,13cnmr,1h-1hcosy和hsqc)對化合物的碳、氫信號進行了全歸屬(表1)，在hmbc譜中，可以觀察到δh2.12(h-10)與δc132.9(c-2')有遠程相關，δh5.54(h-2')與δc69.4(c-10)，δh1.92(h-5')與δc111.1(c-3')有遠程相關，由此可以確定化合物1是一分子苦參堿與另一分子的苦參堿通過c10-c3'相連的，為具有新穎骨架的苦豆子堿二聚體，命名為苦豆子二聚體并命名為苦豆子二聚體a。表1化合物1的一維和2維核磁數據(cdcl3,δ)化合物2為無色塊晶(50％甲醇-水)，hr-esi-msm/z:493.3539(calcdfor[m+h]+:493.3537)，給出該化合物的分子式為c30h44n4o2?；衔?為三斜方晶系，空間群是p1，晶胞參數:z＝1，計算密度＝1.254g·cm-3，最終一致因子[i＞2sigma(i)]r1＝0.0403,wr2＝0.1063；一致性因子(alldata)r1＝0.0408,wr2＝0.1072；絕對構型的flack參數為0.16(12)。最后，單晶數據提交保存至cambridgecrystallographicdatacentre(ccdc)數據庫，ccdc號為1522203。通過cu-kαx-射線晶體衍射法鑒定了本化合物結構的絕對構型(圖2)，并通過核磁共振法(1hnmr,13cnmr,1h-1hcosy和hsqc)對化合物的碳、氫信號進行了全歸屬(表2)，在hmbc譜中，可以觀察到δh2.18,2.08(h-3')與δc109.6(c-9)有遠程相關，δh5.54(h-10)與δc22.2(c-2')有遠程相關，δh2.11(h-2')與δc134.0(c-10)，由此可以確定化合物2是一分子苦參堿與另一分子的苦參堿通過c9-c2'相連，為具有新穎骨架的苦豆子堿二聚體，命名為苦豆子二聚體b。表2化合物2的一維和2維核磁數據(cdcl3,δ)化合物3為無色塊晶(50％甲醇-水)，hr-esi-msm/z:497.3856(calcdfor[m+h]+:493.3850)，給出該化合物的分子式為c30h48n4o2。化合物2為三斜方晶系，空間群是p1，晶胞參數:z＝1，計算密度＝1.253g·cm-3，最終一致因子[i＞2sigma(i)]r1＝0.0283,wr2＝0.0741；一致性因子(alldata)r1＝0.0284,wr2＝0.0742；絕對構型的flack參數為0.01(7)。最后，單晶數據提交保存至cambridgecrystallographicdatacentre(ccdc)數據庫，ccdc號為1502007。通過cu-kαx-射線晶體衍射法鑒定了本化合物結構的絕對構型(圖3)，并通過核磁共振法(1hnmr,13cnmr,1h-1hcosy和hsqc)對化合物的碳、氫信號進行了全歸屬(表3)，在hmbc譜中，可以觀察到δh2.03,2.68(h-2)與δc35.1(c-2')有遠程相關，δh2.28(h-2')與δc61.0(c-2)，由此可以確定化合物3是一分子苦參堿與另一分子的苦參堿通過c3-c2'相連，為一具有新穎骨架的苦豆子堿二聚體，命名為苦豆子二聚體c。表3化合物3的一維和2維核磁數據(cdcl3,δ)position13c1h1h-1hcosyhmbc261.02.03,2.68h-3h-2'334.11.58h-2,h-2',h-4430.51.56,1.81,h-3,h-5h-17535.61.69h-6,h-17664.52.02h-5,h-7h-17743.81.48h-8,h-11828.11.56,1.71h-7,h-9921.31.42,1.71h-8,h-101057.91.88,2.76,h-91155.83.73h-7,h-12h-61227.91.492.10,h-11,h-131319.11.60,1.79h-12,h-141433.02.04,2.40h-1315169.1-h-171742.22.97,4.36h-5h-62'35.12.28,1.69h-3,h-3'h-23'21.91.41,1.53h-4',h-2'4'35.21.56,1.71h-5',h-6'5'47.11.69h-6',h-17'6'54.72.83h-5',h-7'h-17'7'47.11.39h-6',h-8'8'27.01.10,1.43h-7',h-9'9'26.31.30h-8',h-10'10'47.9.2.57,3.11h-9'11'55.23.39h-7',h-12'h-6'12'27.81.43,2.03h-11',h-13'13'19.01.60,1.79h-14',h-12'14'32.92.04,2.40h-15',h-13'15'169.6-h-17'17'40.14.41,3.10h-5',h-6'化合物4為無色塊晶(50％甲醇-水)，hr-esi-msm/z:534.3432(calcdfor[m+h]+:534.3439)，給出該化合物的分子式為c31h43n5o3。化合物4為單斜方晶系，空間群是p21，晶胞參數:z＝2，計算密度＝1.320g·cm-3，最終一致因子[i＞2sigma(i)]r1＝0.0375,wr2＝0.1013；一致性因子(alldata)r1＝0.0378,wr2＝0.1017；絕對構型的flack參數為0.07(8)。最后，單晶數據提交保存至cambridgecrystallographicdatacentre(ccdc)數據庫，ccdc號為1522211。通過cu-kαx-射線晶體衍射法鑒定了本化合物結構的絕對構型(圖4)，并通過核磁共振法(1hnmr,13cnmr,1h-1hcosy和hsqc)對化合物的碳、氫信號進行了全歸屬(表4)，在hmbc譜中，可以觀察到δh4.28(h-2'),2.56(h-4')與δc56.3(c-10')有遠程相關，δh1.35(h-9),2.21(h-5')與δc61.0(c-3')有遠程相關，可以確定化合物4為c10-c3'相連；δh4.28(h-2')與δc114.2(c-18')有相關，確定了cn基團連接在c2'位置；c-3'(δc61.0)和c4'(δc51.1)比正常的c3(δc21.2)和c4(δc27.8)往低場位移了30ppm左右，可推測該兩個碳原子與o雜原子相連，結合高分辨質譜可知該處為3元環(huán)氧雜環(huán)。綜上，可以確定化合物4是一分子苦參堿與另一分子的苦參堿通過c10-c3'相連，同時c2'-c3'處含有3元環(huán)氧雜環(huán)，c4'連有cn基團，為一罕見的具有新穎骨架的苦豆子堿二聚體，命名為苦豆子二聚體d。表4化合物4的一維和2維核磁數據(cdcl3,δ)實驗例3苦豆子堿二聚體a～d對lps致raw264.7細胞炎癥的抑制作用試驗方法：取5x106個對數生長期raw264.7細胞，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，設空白組、對照組和不同濃度的樣品組，每組設8個平行孔。置37℃、5％(v/v)co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，加入脂多糖lps(1μg/ml)預處理1h后，加入苦豆子堿二聚體a～d(10μm)，繼續(xù)培養(yǎng)24h。采用elisa法檢測細胞培養(yǎng)上清中的il-6和tnf-α。試驗結果苦豆子堿二聚體a～d對lps所致raw264.7細胞炎癥具有顯著的抑制作用(表5)。表5苦豆子堿二聚體對lps所致raw264.7細胞炎癥的抑制作用實驗例4苦豆子堿二聚體a～d對lps致大鼠急性肺損傷的抑制作用試驗方法：雄性wistar大鼠(180克-220克)隨機分為：對照組，苦豆子堿二聚體a～d組。對照組使用生理鹽水(1ml/天)灌胃；苦豆子堿二聚體a～d組使用苦豆子堿二聚體a～d(40mg/kg/天)腹腔注射。5天之后，苦豆子堿二聚體a～d組使用脂多糖lps(5mg/kg)進行氣管滴注，制造急性肺損傷模型。用灌洗液灌洗肺泡后，將灌洗液離心(3000rpm，4℃)10min，elisa法檢測灌洗液中il-6、tnf-α。試驗結果苦豆子堿二聚體a～d對lps所致大鼠急性肺損傷炎癥具有顯著的抑制作用(表6)。表6苦豆子堿二聚體對lps所致大鼠急性肺損傷炎癥的抑制作用實驗例5苦豆子堿二聚體a～d對腫瘤細胞增殖的抑制作用試驗方法：取106個對數生長期細胞，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μl，設空白組、對照組和不同濃度的樣品組，每組設8個平行孔。置37℃、5％(v/v)co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24h后，加入不同濃度苦豆子堿二聚體a～d，繼續(xù)培養(yǎng)48h。于終止前每孔加30μlmtt(5g/l)，作用4h后除去上清液并添加100μldmso溶解反應產物，使用酶標儀在570nm波長處檢測各孔od值，按下公式計算抑制率：生長抑制率％＝(1-實驗組平均od值/對照組平均od值)×100％試驗結果苦豆子堿二聚體a～d對多種腫瘤細胞及其耐藥株的生長均具有顯著抑制作用，并且對不同細胞具有選擇性的抑制作用(表7)。表7mtt法測定新型苦豆子堿二聚體對多種腫瘤細胞的生長抑制作用實驗例6苦豆子堿二聚體a～d體內抗腫瘤作用試驗方法：取體重18-22g的裸鼠(購自南方醫(yī)科大學)，隨機分組，每組8只。分別在其右前肢腋下接種人肝癌細胞huh71×107個，24小時后腹腔注射給藥，苦豆子堿二聚體a～d每天給藥一次，5-氟尿嘧啶(5-fu，購于北京百靈威科技有限公司)隔天給藥，連續(xù)注射21天后停藥，處死動物，取瘤稱重。抑瘤率按如下公式計算：抑瘤率(％)＝(1–給藥組平均瘤重/對照組平均瘤重)×100％。統(tǒng)計分析采用t檢驗處理，p<0.05認為有顯著性差異。結果見表8。表8苦豆子堿二聚體對人肝癌細胞huh7裸鼠移植瘤生長的抑制作用(n＝8)與模型組相比，*p<0.05，**p<0.01有顯著性差異試驗結果：結果表明，苦豆子堿二聚體a～d(20mg/kg/day)對人肝癌細胞huh7裸鼠移植瘤生長有明顯的抑制作用。給藥組和對照組小鼠體重無明顯差異，未見小鼠外觀、活動狀態(tài)等方面異常，且肝臟、肺及腎臟組織未見明顯變化，說明苦豆子堿二聚體a～d的毒副作用較小。實施例7膠囊劑的制備苦豆子堿二聚體2g，乳糖20g，羥甲基淀粉鈉0.1g，淀粉漿適量，硬脂酸鎂0.1g混合，過篩制粒，干燥后混勻裝入膠囊，每個膠囊含苦豆子堿二聚體a或b或c或d0.02g，每日口服1-2粒，每日兩次。實施例8片劑的制備苦豆子堿二聚體5g，乳糖200g，淀粉漿適量，硬脂酸鎂1g，混合，過篩，干燥后壓片。每片含苦豆子堿二聚體a或b或c或d0.02g。每日口服1-2片，每日兩次。實施例9注射液的制備苦豆子堿二聚體a或b或c或d2g，丙二醇50g，研磨，再加少量注射用水稀釋，混勻，然后加入氯化鈉適量，溶解后再加入注射用水至1000ml，調ph值5.5-6.5，濾過，灌封，滅菌，即得1000支注射用針劑。實施例10脂質體納米粒的制備苦豆子堿二聚體1g，大豆卵磷脂500mg，溶于25ml乙醇中，另取硬脂酸200mg和大豆卵靈脂500mg溶于25ml環(huán)己烷中，混合攪拌均勻。于37℃恒溫水浴中減壓旋轉蒸發(fā)除去有機溶劑，使藥物及輔料在燒瓶壁形成均勻脂質薄膜，于真空干燥器中放置過夜，除盡有機溶劑；另取聚乙二醇單硬脂酸酯3750mg,攪拌溶解在175ml水中，加入上述薄膜中，超聲10min，定容至250ml，得淡黃色透明溶液。將此溶液冷凍干燥可得凍干粉。用球磨機研磨24小時，制得粒徑均勻的納米粒，混勻并分裝。每袋含苦豆子堿二聚體a或b或c或d0.005g。口服，一次一袋，每日兩次。實施例11緩釋劑的制備將苦豆子堿二聚體50g，羥丙基甲基纖維素30g，乳糖10g，加適量粘合劑制備軟材，過20目篩制粒。干燥，整粒，加入硬脂酸鎂0.3g，混合均勻，壓片。每片含苦豆子堿二聚體a或b或c或d0.005g。每日口服1-2片，每日一次。實施例12控釋劑的制備苦豆子堿二聚體1g，乳糖40g和淀粉漿適量直接裝到旋轉制粒機/包衣器制備顆粒，將稀釋到15％固體的塑化乙基纖維素包衣劑懸浮液噴霧到苦豆子堿二聚體顆粒的旋轉床上。在噴霧期間，用泊洛沙姆188制成的分散體載體膜包衣苦豆子堿二聚體顆粒，形成平均顆粒度大約為450μm的持續(xù)釋放的顆粒?；靹蜓b入膠囊，每個膠囊含苦豆子堿二聚體a或b或c或d0.005g，每日口服1-2粒，每日兩次。實施例13分散片的制備取苦豆子堿二聚體50g，羥乙酸淀粉鈉50g，預凝膠淀粉340g，低取代羧丙基纖維素25g，糖精鈉3g，薄荷香精3g，混合均勻制粒，并控制粒度在35-80μm范圍內，直接壓片。每片含苦豆子堿二聚體a或b或c或d0.005g。每日口服1-2片，每日兩次。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。當前第1頁12