本申請要求了2017年03月17日提交中國專利局的，申請?zhí)?01710162191.5，發(fā)明名稱為“應(yīng)用itraq技術(shù)研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質(zhì)組的方法”的中國專利申請的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用結(jié)合在本申請中。本發(fā)明涉及寄生蟲學領(lǐng)域，具體涉及一種應(yīng)用itraq技術(shù)研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質(zhì)組的方法。
背景技術(shù)：
：弓形蟲(toxoplasmagondii)是一種機會致病性原蟲，可以引起世界性的人獸共患寄生蟲病。據(jù)調(diào)查，約30％的世界人口有潛在的弓形蟲感染，其中90％發(fā)生弓形蟲腦炎的病人死亡，繼發(fā)性癱瘓的比例更高。近年來，弓形蟲慢性感染導致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem,cns)損傷越發(fā)受到廣泛關(guān)注，這類病患表現(xiàn)為局部或彌散性的神經(jīng)損傷，常伴隨精神癥狀和行為失常，如產(chǎn)生類似阿茲海默癥的癥狀表現(xiàn)。全球范圍內(nèi)，i、ii、iii型弓形蟲均有感染病患報道，但基因型ii型引起的人類弓形蟲病占主導地位。關(guān)于弓形蟲的致病性及癥狀已經(jīng)有了大量的研究，然而關(guān)于弓形蟲和宿主cns具體的相互作用機制大多還僅限于血清學的檢測，具體的致病機制和互作蛋白十分復(fù)雜，至今所知甚少。蛋白質(zhì)組學技術(shù)已被廣泛應(yīng)用到包括寄生蟲在內(nèi)的許多生物體研究中，但目前寄生蟲的基因圖譜極不完善，因此給蛋白質(zhì)組的研究帶來了一定困難。同位素標記相對和絕對定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation，itraq)技術(shù)是美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司2004年推出的一種體外同位素標記技術(shù)。作為一種新型蛋白質(zhì)組學定量研究技術(shù)，itraq技術(shù)可以在同一實驗中對4種或8種不同樣本進行蛋白質(zhì)定量比較，對一個基因組表達的全部蛋白質(zhì)或者一個復(fù)雜混合體系中的所有蛋白質(zhì)進行精確定量和分析鑒定。目前還未有報道應(yīng)用itraq技術(shù)研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質(zhì)組的方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種應(yīng)用itraq技術(shù)研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質(zhì)組的方法。第一方面，本發(fā)明提供了一種應(yīng)用itraq技術(shù)研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質(zhì)組的方法，包含以下步驟：(1)小鼠腦蛋白的提??；(2)對步驟(1)所得的蛋白質(zhì)樣品進行fasp酶解、肽段標記；(3)對步驟(2)標記的蛋白質(zhì)樣品進行hplc分離肽段混合物及l(fā)c-ms質(zhì)譜分析；(3)對上步所得的質(zhì)譜鑒定結(jié)果進行生物信息學分析、定量分析，獲取弓形蟲慢性感染小鼠腦組織過程中的差異表達蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，步驟(1)中，小鼠包括昆明鼠、balb/c鼠、沙鼠中的一種或多種。優(yōu)選地，步驟(1)中所述小鼠腦蛋白的提取，具體步驟為：分別取感染弓形蟲的小鼠腦及健康spf小鼠腦，進行ripa裂解、超聲、離心處理，收集上清液。進一步優(yōu)選地，所述超聲處理的條件為：20w，工作0.8s，停0.8s，超聲10次后放于冰上冷卻，并重復(fù)6次。進一步優(yōu)選地，所述離心處理的條件為：4℃，12000rpm，離心20min，收集上清液。優(yōu)選地，步驟(2)中fasp酶切具體包括：a)在對步驟(1)所得的蛋白質(zhì)樣品定量后，每個樣本取200μg蛋白溶液置于離心管中，加入tcep還原試劑，60℃反應(yīng)1h；然后加入mmts半胱氨酸封閉試劑，室溫反應(yīng)30分鐘；獲得還原烷基化后的蛋白溶液；b)將還原烷基化后的蛋白溶液加入超濾管中，離心，棄掉收集管底部溶液；加入8m尿素(ph8.5)，離心，棄掉收集管底部溶液；加入0.25mteab(ph8.5)，離心，棄掉收集管底部溶液；更換新的收集管，在超濾管中加入0.5mteab，加入胰蛋白酶(胰蛋白酶與蛋白質(zhì)量比優(yōu)選為1:50)，37℃反應(yīng)過夜；次日加入胰蛋白酶(胰蛋白酶與蛋白質(zhì)量比優(yōu)選為1:100)，37℃反應(yīng)4h，離心獲得酶解消化后的肽段溶液。優(yōu)選地，步驟(2)肽段標記具體包括：參照ab公司試劑盒itraqreagent-8plexmultiplexkit(absciex)說明書進行fasp酶切后所得肽段的標記。進一步優(yōu)選地，步驟(2)肽段標記包括：a)取8標itraq試劑盒，平衡至室溫；向每管itraq試劑中加入150μl異丙醇，渦旋振蕩，離心至管底，獲得異丙醇處理后的itraq試劑；b)取50μl樣品(約100μg酶解產(chǎn)物)轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入步驟a)異丙醇處理后的的itraq試劑到樣品中，渦旋振蕩，離心至管底，室溫反應(yīng)2h；加入水終止反應(yīng)，獲得標記肽段。優(yōu)選地，步驟(3)具體包括：a)先用95％的a相5％b相平衡柱子，然后將步驟(2)標記后多肽用a相復(fù)溶，進樣后以0.2ml/min的速率進行梯度洗脫：b相從5％到37％，最后在5min內(nèi)使b相的比例上升至95％并保持5min，共85min；收取肽段溶液，真空干燥后，進行第二維lc-ms分析；其中，a相：水(nh3inh2o，ph10)；b相：80％乙腈(nh3inh2o，ph10)；b)步驟(a)真空干燥后的肽段用樣品溶解液溶解，充分振蕩渦旋、離心，上清轉(zhuǎn)移到上樣管中，進行質(zhì)譜鑒定；色譜柱信息：75umi.d.x150mm,裝填acclaimpepmaprslcc18,2μm,nanoviper；流動相a：0.1％甲酸；流動相b：0.1％甲酸，80％can(硝酸鈰銨)；流速：300nl/min；每個組分分析時間：65min；有效梯度：b相從5％上升至35％，40min。進一步優(yōu)選地，步驟(3)具體包括：a)先用95％的a相5％b相平衡柱子(phenomenexcolumns；gemini-nx3uc18110a；150*2.00mm)30min，然后將標記后抽干的混合多肽用200μl的a相復(fù)溶，取100μl進樣后以0.2ml/min的速率進行梯度洗脫：b相從5％到37％，最后在5min內(nèi)使b相的比例上升至95％并保持5min，共85min；整個洗脫過程在214nm吸光度下進行監(jiān)測，從線性梯度開始根據(jù)峰型收取24個組分，每1管每50秒鐘接1次，梯度為85min，反復(fù)循環(huán)接樣；根據(jù)峰型和時間共收取24個組分(肽段)，真空干燥后，進行第二維lc-ms分析；其中，a相：水(nh3inh2o，ph10)；b相：80％乙腈(nh3inh2o，ph10)b)肽段用樣品溶解液(0.1％甲酸、5％乙腈)溶解，充分振蕩渦旋，13500rpm，4℃離心20min，上清轉(zhuǎn)移到上樣管中，進行質(zhì)譜鑒定；色譜柱信息：75umi.d.x150mm,裝填acclaimpepmaprslcc18,2μm,nanoviper；流動相a：0.1％甲酸；流動相b：0.1％甲酸，80％can(硝酸鈰銨)；流速：300nl/min；每個組分分析時間：65min；有效梯度：b相從5％上升至35％，40min；c)分離后的肽段直接進入質(zhì)譜儀thermoscientificqexactive進行在線檢測，具體參數(shù)如下：一級質(zhì)譜參數(shù)：resolution：70,000；agctarget：3e6；maximumit：100ms；scanrange：350to1800m/z；二級質(zhì)譜參數(shù)：resolution：17,500；agctarget：5e4；maximumit：120ms；topn：20；nce/steppednce：30。優(yōu)選地，步驟(4)生物信息學分析具體包括：用proteomediscoverer1.4(thermofisherscientific)的默認設(shè)置進行蛋白質(zhì)組分析；用proteinpilot5.0(appliedbiosystemssciex)進行蛋白質(zhì)組學分析和蛋白定量分析；差異表達倍數(shù)>2倍和<0.5倍(兩個標準“p≤0.05和|fc|≥2”)，分別選出作為蛋白表達量上調(diào)和下調(diào)的研究對象。本發(fā)明所述的p值為proteinpilot5.0軟件分析時進行的假設(shè)檢驗，fc為foldchange的縮寫。優(yōu)選地，步驟(4)生物信息學分析進一步具體包括：通過quickgo，從生物學進程、分子功能以及細胞組分，對差異表達蛋白進行分析。優(yōu)選地，步驟(4)生物信息學分析進一步具體包括：通過kegg(http://www.genome.jp/kegg/)進行生物學通路分析，在uniprot上可找到該蛋白的序列和功能信息。優(yōu)選地，如第一方面提供的方法，獲取弓形蟲慢性感染小鼠腦組織過程中的差異表達蛋白質(zhì)不低于4983個蛋白。優(yōu)選地，如第一方面提供的方法，通過用兩個標準“p≤0.05和|fc|≥2”進行顯著性差異分析，被弓形蟲感染的昆明鼠腦部與對照組相比，可獲得上調(diào)蛋白有不低于215個。進一步優(yōu)選地，可獲得不低于215個的上調(diào)蛋白優(yōu)選包括表2中所例高表達蛋白。優(yōu)選地，如第一方面提供的方法，通過用兩個標準“p≤0.05和|fc|≥2”進行顯著性差異分析，被弓形蟲感染的昆明鼠腦部與對照組相比，可獲得下調(diào)蛋白有不低于246個。進一步優(yōu)選地，可獲得不低于246個的下調(diào)蛋白優(yōu)選包括表2中所例低表達蛋白。優(yōu)選地，如第一方面提供的方法，通過用兩個標準“p≤0.05和|fc|≥2”進行顯著性差異分析，被弓形蟲感染的balb/c鼠腦部與對照組相比，可獲得上調(diào)蛋白有不低于159個。優(yōu)選地，如第一方面提供的方法，通過用兩個標準“p≤0.05和|fc|≥2”進行顯著性差異分析，被弓形蟲感染的balb/c鼠腦部與對照組相比，可獲得下調(diào)蛋白有不低于353個。優(yōu)選地，如第一方面提供的方法，通過用兩個標準“p≤0.05和|fc|≥2”進行顯著性差異分析，被弓形蟲感染的沙鼠腦部與對照組相比，可獲得上調(diào)蛋白有不低于48個(優(yōu)選包括表3中所例48種高表達蛋白)。優(yōu)選地，如第一方面提供的方法，通過用兩個標準“p≤0.05和|fc|≥2”進行顯著性差異分析，被弓形蟲感染的沙鼠腦腦部與對照組相比，可獲得下調(diào)蛋白有不低于63個(優(yōu)選包括表3中所例63種低表達蛋白)。優(yōu)選地，如第一方面提供的方法獲得的差異表達蛋白質(zhì)涉及的通路包括代謝信號通路、氧化磷酸化信號通路、谷氨酸能突觸信號通路、鈣信號信號通路、cgmp-pkg信號通路、突觸囊泡循環(huán)信號通路，以及mdh2、pdhx、pvalb、atp5a1、cox4i1、me1、dbn1、impdh2、syt7、hadha、actb蛋白相關(guān)信號通路中的一種或多種。第二方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面提供的方法在制備弓形蟲慢性感染關(guān)聯(lián)信號通路生物標志物或診斷試劑中的應(yīng)用，其中，所述信號通路包括代謝信號通路、氧化磷酸化信號通路、谷氨酸能突觸信號通路、鈣信號信號通路、cgmp-pkg信號通路、突觸囊泡循環(huán)信號通路，以及mdh2、pdhx、pvalb、atp5a1、cox4i1、me1、dbn1、impdh2、syt7、hadha、actb蛋白相關(guān)信號通路中的一種或多種。第三方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面提供的方法在在制備弓形蟲慢性感染關(guān)聯(lián)疾病生物標志物、診斷試劑或靶向藥物中的應(yīng)用，其中，所述弓形蟲慢性感染關(guān)聯(lián)疾病包括亨廷氏舞蹈癥、阿茲海默癥、帕金森氏癥中的一種或多種。本發(fā)明通過比較弓形蟲慢性感染小鼠與健康小鼠的腦組織，篩選差異表達的鼠腦蛋白質(zhì)，以期從蛋白質(zhì)組學角度挖掘其導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem,cns)損傷的機制，并為尋找生物標志物提供靶標。本發(fā)明提供的itraq結(jié)合lcms/ms技術(shù)能快速有效地進行蛋白質(zhì)組學研究，為研究弓形蟲慢性感染致宿主cns損傷機制以及發(fā)現(xiàn)新的生物標志物提供參考。附圖說明圖1為差異表達蛋白的通路富集分析結(jié)果；圖2為部分差異表達蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果；圖3為部分差異表達蛋白mrna表達水平的熒光定量pcr驗證結(jié)果；圖4為pvalb和syt7表達水平變化wb驗證結(jié)果；圖5為pvalb和syt7表達水平變化wb驗證量化結(jié)果。具體實施方式以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明的保護范圍。在本發(fā)明第一實施例中，本發(fā)明提供了一種應(yīng)用itraq技術(shù)研究弓形蟲慢性感染小鼠腦組織差異表達蛋白質(zhì)組的方法。本發(fā)明實施例中若無特別說明，所用試劑及耗材均為市售商品。6～8周齡的spf級昆明小鼠，購于廣東省實驗動物中心；弓形蟲pru株，由華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院寄生蟲實驗室保存。1材料與方法1.1樣品制備弓形蟲慢性感染小鼠模型建立實驗動物昆明小鼠40只，體重約22g，隨機均分為實驗組和對照組。將一只弓形蟲慢性感染小鼠用頸椎脫白法處死，取小鼠的腦組織，加入適量pbs，用研缽充分研磨至不見任何組織，取腦勻漿平鋪在玻片上，于顯微鏡下計數(shù)包囊個數(shù)，重復(fù)3次，根據(jù)計數(shù)結(jié)果將腦組織勻漿用pbs稀釋成20個包囊/ml。釆取經(jīng)口感染的方式，實驗組接種10個包囊/只，即0.5ml腦勻漿液。對照組每只灌胃0.5mlpbs。分別分籠飼養(yǎng)，每籠5只，正常取食及飲水。感染弓形蟲30天的成年昆明小鼠18只，雌雄各半，隨機均分為3組。無菌環(huán)境下解剖取腦，每組鼠腦混合后將其分為2等份，一半用于蛋白質(zhì)組學研究，另一半用于做熒光定量pcr和westernblot驗證。另取相同年齡、相同性別的18只健康spf小鼠腦，相同處理，作為空白對照。1.2主要儀器及試劑冷凍離心機(湘儀h2050r)；超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；pmsf(-20℃保存，使用前需搖勻使結(jié)晶溶解)(上海生工)；旋渦混合器vortex-5；ripa裂解液(50mmtris-hcl，amresco)；bca定量試劑盒(sigma)；分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；8-plexitraq試劑盒(absciex)；胰酶(promega)；10k超濾管(pall)；三乙基碳酸氫銨緩沖液teab(sigma)；液相色譜shimadzuhplc(thermodionexultimate3000rslcnano)；質(zhì)譜儀(thermoscientificqexactive)。pbs(ph7.4)：nacl8g，kcl0.2g，na2hpo41.42g，kh2po40.27g，加入約800ml蒸餾水充分溶解，將ph調(diào)至7.4后再加蒸餾水定容至1l，高壓滅菌后使用。ripa裂解液(使用前加入1×的pmsf)：50mmtris-hcl，150mmnacl，1％sds，0.1％trionx-100，1％sdcph8.0。1.3蛋白質(zhì)的提取及純化在ep管中加入100μlripa，充分溶解組織后超聲處理(20w，工作0.8s，停0.8s，超聲10下后放于冰上冷卻，重復(fù)6次)，破碎核酸，4℃，12000rpm，離心20min，收集上清液。bca法進行蛋白質(zhì)定量，取1、2、4、6、8、10、12、14μg的bsa制作標準曲線，樣品取2μl，雙復(fù)管測定。每支管加入100μl去離子水，100μlbca染液，渦旋振蕩20s，60℃反應(yīng)1h，575nm處測定吸光值。1.4蛋白酶解及itraq試劑標記使用fasp方法酶解樣品，蛋白定量后每個樣本取200μg蛋白溶液置于離心管中；加入4μltcepreducingreagent，60℃反應(yīng)1h；加入2μlmmtscysteine-blockingreagent，室溫30分鐘；將還原烷基化后的蛋白溶液加入10k的超濾管中，12,000rpm離心20min，棄掉收集管底部溶液；加入8m尿素(ph8.5)100μl，12000rpm離心20分鐘，棄掉收集管底部溶液，重復(fù)2次；加入0.25mteab(ph8.5)100μl，12000rpm離心20min，棄掉收集管底部溶液，重復(fù)3次；更換新的收集管，在超濾管中加入0.5mteab使終體積為50μl，加入胰蛋白酶(胰蛋白酶與蛋白質(zhì)量比1:50)，37℃反應(yīng)過夜；次日加入胰蛋白酶(胰蛋白酶與蛋白質(zhì)量比1:100)，37℃反應(yīng)4h，反應(yīng)后12000rpm離心20min，酶解消化后的肽段溶液離心于收集管底部；在超濾管中加入50μl0.5mteab，12000rpm再次離心20min，與上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的樣品；itraq試劑標記，從冰箱中取出8標的itraq試劑盒，平衡到室溫，將itraq試劑離心至管底；向每管itraq試劑中加入150μl異丙醇，渦旋振蕩，離心至管底；取50μl樣品(100μg酶解產(chǎn)物)轉(zhuǎn)移到新的離心管中；將itraq試劑添加到樣品中，渦旋振蕩，離心至管底，室溫反應(yīng)2h；加入100μl水終止反應(yīng)；混合標記后的樣品，渦旋振蕩，離心至管底；真空冷凍離心干燥；抽干后的樣品冷凍保存待用。1.5hplc分離肽段混合物以及質(zhì)譜檢測第一維高ph-rp液相分離先用95％的a相5％b相平衡柱子(柱子信息：phenomenexcolumns；gemini-nx3uc18110a；150*2.00mm)30min，然后將標記后抽干的混合多肽用200μl的a相(h2o)復(fù)溶，取100μl進樣后以0.2ml/min的速率進行梯度洗脫：b相(80％acn)從5％到37％，最后在5min內(nèi)使b相的比例上升至95％并保持5min，共85min。整個洗脫過程在214nm吸光度下進行監(jiān)測，從線性梯度開始根據(jù)峰型收取24個組分，每1管每50秒鐘接1次，梯度為85min，反復(fù)循環(huán)接樣；根據(jù)峰型和時間共收取24個組分，真空干燥后，進行第二維lc-ms分析。a相：水(nh3inh2oph10)；b相：80％乙腈(nh3inh2oph10)。具體梯度洗脫程序如表1所示。表1梯度洗脫程序第二維反相液質(zhì)聯(lián)用rplc-ms肽段用樣品溶解液(0.1％甲酸、5％乙腈)溶解，充分振蕩渦旋，13500rpm，4℃離心20min，上清轉(zhuǎn)移到上樣管中，進行質(zhì)譜鑒定；色譜柱信息：75umi.d.x150mm,packedwithacclaimpepmaprslcc18,2μm,nanoviper；流動相a：0.1％甲酸；流動相b：0.1％甲酸，80％can；流速：300nl/min；每個組分分析時間：65min；有效梯度：b相從5％上升至35％，40min。具體梯度洗脫程序如表2所示。表2梯度洗脫程序分離后的肽段直接進入質(zhì)譜儀thermoscientificqexactive進行在線檢測，具體參數(shù)如下：一級質(zhì)譜參數(shù)：resolution：70,000；agctarget：3e6；maximumit：100ms；scanrange：350to1800m/z。二級質(zhì)譜參數(shù)：resolution：17,500；agctarget：5e4；maximumit：120ms；topn：20；nce/steppednce：30。1.6蛋白質(zhì)鑒定與數(shù)據(jù)分析將原文件轉(zhuǎn)換為mascot軟件的通用格式(.mgf)，用proteomediscoverer1.4(thermofisherscientific)的默認設(shè)置進行蛋白質(zhì)組分析。輸入.mgf格式文件，用proteinpilot5.0(appliedbiosystemssciex)進行蛋白質(zhì)組學分析和蛋白定量分析。proteinpilot5.0中的paragonalgorithm用于數(shù)據(jù)庫檢索，利用該軟件，itraq系統(tǒng)得到的肽段數(shù)據(jù)得以轉(zhuǎn)換成蛋白水平上的差異分析數(shù)據(jù)。參數(shù)設(shè)置如下：cysalkylation:mmts；idfocus:biologicalmodifications；digestion:typsin；database:uniprot_mouse；searcheffort:thoroughid。差異表達倍數(shù)>2倍和<0.5倍，分別選出作為蛋白表達量上調(diào)和下調(diào)的研究對象。為了找到生物學功能顯著變化的蛋白，我們通過quickgo，利用生物信息研究最權(quán)威的數(shù)據(jù)庫，從生物學進程、分子功能以及細胞組分，對差異表達蛋白進行分析。quickgo是通過blast和uniprot找到差異表達蛋白的id并對其進行注釋。選取的蛋白通過kegg(http://www.genome.jp/kegg/)進行生物學通路分析，在uniprot上可找到該蛋白的序列和功能信息。另外，可以借助string10.0(http://string-db.org)探索互作關(guān)系網(wǎng)中的功能與蛋白質(zhì)差異表達的關(guān)系。統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)以均數(shù)標準差為標準，并對數(shù)據(jù)進行t檢驗用來評估組間的顯著性差異。應(yīng)用spss18進行統(tǒng)計分析。p＜0.05時表明差異顯著。1.7實時熒光定量pcr分析驗證mrna的表達水平qrt-pcr分析是用于驗證itraq結(jié)果得到的驗證基因表達差異。根據(jù)操作說明書通過rnaisoplus方法(takara,大連,中國)對感染鼠腦進行總rna的提取，最后用無酶水重懸所得rna。提取的rna濃度以及純度由紫外分光光度計(thermoscientificnanodrop2000,waltham,ma,usa)測量所得。通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒sybrprimescripttmrtmastermix(perfectrealtime)試劑盒(takara,大連,中國)轉(zhuǎn)錄成cdna。參照unigene上的基因序列用premier5.0軟件(premierbiosoftinternational,paloalto,ca,usa)設(shè)計特異性qpcr引物。引物序列見表3。qpcr使用儀器rotor-geneq(qiagen)的實時系統(tǒng)，采用sybrgreenmastermix(sybrpremixextagtmii；takarabio；http://www.takara-bio.com),qrt-pcr反應(yīng)條件是95℃5min；95℃30s，60℃1min，40個循環(huán)。每個樣品三次生物學重復(fù)，mrna的表達水平通過公式2–△△ct得出。為了標準化，我們采用β-actin基因的表達作為內(nèi)參，空白對照作為一個參照樣品設(shè)為1。表3熒光定量pcr引物設(shè)計1.8westernblot實驗分別選取實驗組中差異表達下調(diào)蛋白dbn1和上調(diào)蛋白pvalb進行免疫印跡實驗來驗證實驗結(jié)果。處理好的樣品進行sds-page，120v。然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜(roche,indianapolis,usa)上，45min，120ma。然后把膜放在含有0.1％的吐溫20以及5％的脫脂牛奶的pbs中過夜孵育鼠抗β-actin單抗(neobioscience,中國.1:500稀釋)，特異性兔抗syt7(1:250,abcam，ab106618)和兔抗pvalbalb(1:300,abcam，ab11427)抗體。孵育抗體之后洗膜三次再分別用羊抗兔的二抗1：2500稀釋。膜是用二氨基聯(lián)苯胺(dab)底物溶液(天根生化科技(北京)有限公司，中國)顯像，圖像是由ecl-pluswesternblotting檢測分析系統(tǒng)進行成像分析(tiannon，上海，中國)。2結(jié)果2.1原始數(shù)據(jù)分析及差異表達蛋白的檢測通過proteinpilot5.0搜索軟件進行蛋白質(zhì)組學定量分析，檢測到4983個蛋白，通過用兩個標準“p≤0.05和|fc|≥2”進行顯著性差異分析，發(fā)現(xiàn)被弓形蟲包囊感染的小鼠腦部與對照組相比有215個蛋白上調(diào)(46.63％)和246個下調(diào)蛋白(53.37％)。部分上調(diào)和下調(diào)蛋白已分別列出(表4)。表4部分差異表達蛋白信息2.2差異表達蛋白的生物信息學分析通過go分析鑒定各個功能相關(guān)的差異表達蛋白，主要涉及生物學進程(bp)有解剖結(jié)構(gòu)的發(fā)展、信號傳導、運輸、細胞分化、應(yīng)激反應(yīng)等。分子功能(mf)分類揭示差異蛋白主要與體內(nèi)分子的結(jié)合與捆綁相關(guān)。細胞組分(cc)分析發(fā)現(xiàn)差異表達蛋白主要參與細胞質(zhì)、細胞器、胞外結(jié)構(gòu)和質(zhì)膜形成。同時，keggpathway分析可見差異表達蛋白一共涉及了227個通路，圖1為差異表達蛋白的通路富集分析結(jié)果，包含差異蛋白最多的前10個通路，包括代謝通路、氧化磷酸化、谷氨酸能突觸、鈣信號通路、cgmppkg信號通路、亨廷氏舞蹈癥、突觸囊泡循環(huán)、和阿茲海默癥、多巴胺能神經(jīng)突觸、帕金森氏癥等。根據(jù)string10.0數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)探索差異表達蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，這些差異表達蛋白至少與其中另一個蛋白存在相互作用，結(jié)果如圖2所示，圖2為部分差異表達蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果。不同顏色的線表明蛋白質(zhì)不同種類的互作證據(jù)(由于專利申請文件為灰度圖，顯示不出色彩效果，若需要，申請人可提供帶顏色的原圖)。mdh2、pdhx、pvalb、atp5a1、cox4i1、me1、dbn1、impdh2、syt7、hadha、actb等是處在關(guān)系互作網(wǎng)的重要節(jié)點，散在的蛋白目前尚未見相關(guān)報道?？偟膩碚f，從本發(fā)明實施例的結(jié)果來看，弓形蟲慢性感染導致包括但不限于如下兩方面的影響：一方面是直接影響了某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異蛋白的表達，從而影響各類神經(jīng)細胞的正常生長和正常功能；另一方面則是對腦部細胞的線粒體造成影響，導致氧化磷酸化過程中重要的多個復(fù)合體產(chǎn)生功能障礙，使呼吸鏈電子傳遞及atp合成受到影響，宿主細胞能量代謝等代謝途徑都不同程度產(chǎn)生障礙，從生命活動的出發(fā)點造成宿主機能障礙。具體地，差異表達蛋白ndufa4和ndufa9等位于復(fù)合體i，真核生物的電子傳遞鏈位于線粒體內(nèi)膜，包含四種膜結(jié)合復(fù)合體(i,ii,iii,iv)，它們通過膜梯度循環(huán)將氫和電子傳遞給atp合成酶(又稱復(fù)合體v)。線粒體呼吸鏈為細胞提供95％的能量。差異表達蛋白ndufa4和ndufa9的表達量的改變可能影響復(fù)合體i的成功組裝及穩(wěn)定性，或引起復(fù)合體i的功能障礙，影響脫氫作用和電子傳遞，進而影響atp的合成。研究發(fā)現(xiàn)：復(fù)合體i是五個復(fù)合體中最大最復(fù)雜的，同時也是電子傳遞的起始位置和活性氧(ros)的重要部位，因此復(fù)合體i的功能障礙與許多退行性疾病有關(guān)。一方面，復(fù)合體i組裝成功率和穩(wěn)定性的降低將引起新生兒leigh氏綜合征和線粒體腦病的發(fā)生率顯著增高[24,25]。另一方面，復(fù)合體i上任何模塊發(fā)生功能障礙都可能導致線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和腦卒中樣發(fā)作(melas)、萊伯遺傳性視神經(jīng)病(lhon)或其他退行性疾病。差異表達的sdhc可能影響復(fù)合體ii和輔酶q的相互作用，以及三羧酸循環(huán)中琥珀酸脫氫成延胡索酸的氧化反應(yīng)，這些改變都將最終影響atp的合成。與復(fù)合體i類似，已發(fā)現(xiàn)在亨廷氏舞蹈癥(hd)中復(fù)合體ii失活，復(fù)合體ii的活性抑制劑可誘發(fā)hd。hd的線粒體功能障礙包括線粒體蛋白和atp合成不足。生理條件下，atp合成酶利用電子傳遞鏈產(chǎn)生的質(zhì)子動力勢作為能量合成atp，整個過程稱為氧化磷酸化。在復(fù)合體v上我們鑒定到的差異表達的蛋白多屬于v型atp酶，位于細胞膜和細胞內(nèi)膜，作用是改變ph和產(chǎn)生跨膜電位[34]，其表達水平發(fā)生明顯改變極有可能影響atp合成功能。溶酶體酸化缺陷可以導致溶酶體貯積癥(lsd)和常見的神經(jīng)退行性疾病，如ad、pd等。v型atp酶復(fù)合物中包含調(diào)節(jié)溶酶體酸化的蛋白成分，其發(fā)生功能缺陷將造成破壞性神經(jīng)性lsd[35]。我們在臨床觀察到的小鼠慢性感染弓形蟲1個月以上發(fā)生癱瘓可能就是線粒體功能障礙引起的退行性癥狀。在早期實驗中，我們觀察到慢性感染弓形蟲小鼠精神沉郁、被毛粗亂，感染1個月以上則大多發(fā)生大小便失禁和癱瘓。已有文獻報道，慢性感染弓形蟲的病人產(chǎn)生的各類腦損傷會導致精神分裂癥和阿茲海默癥等癥狀。本研究鑒定出一批差異表達鼠腦蛋白質(zhì)，并且與多個cns損傷的信號通路有關(guān)。差異表達鼠腦蛋白質(zhì)大腦發(fā)育調(diào)節(jié)蛋白(drebrin)在調(diào)節(jié)樹突棘與神經(jīng)突觸的形態(tài)結(jié)構(gòu)上有重要作用。在大腦的學習和記憶機制中，樹突棘是一個關(guān)鍵角色，并且影響神經(jīng)突觸的生長發(fā)育。阿茲海默癥早期的認知功能障礙就與突觸退化有關(guān)，樹突棘形態(tài)退化、數(shù)量和密度同時下降，drebrin的表達水平在大腦顳葉也發(fā)生顯著下調(diào)。kojima等在實驗中發(fā)現(xiàn)drebrina在成年鼠腦中對突觸的可塑性和海馬依賴性的恐懼記憶是至關(guān)重要的。慢性感染弓形蟲的小鼠精神沉郁很可能與鼠腦中drebrin表達水平顯著下調(diào)有關(guān)。樹突棘和突觸的病變與通路富集分析結(jié)果一致。突觸結(jié)合蛋白家族(syts)在神經(jīng)分泌小跑和內(nèi)分泌細胞中廣泛分布。syt7位于突觸前，在神經(jīng)突觸中有較高表達量。以往研究發(fā)現(xiàn)syt7參與異步釋放過程，有利于抑郁癥中的鈣離子依賴性恢復(fù)。syt7是一種鈣離子傳感器，因其高親和力和慢動力特征促進一些中樞突觸中滯留鈣的調(diào)節(jié)。此外，syt7還與神經(jīng)細胞中的溶酶體糖蛋白相互作用，介導溶酶體和內(nèi)含體向胞外分泌，促進軸突延伸和損傷后再生。大腦中有許多與鈣離子結(jié)合有關(guān)的蛋白質(zhì)，小清蛋白(pvalb)是cns神經(jīng)元中的一種鈣離子結(jié)合蛋白，可以作為研究大腦發(fā)育過程中皮質(zhì)結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元回路的標志物。pvalb可以對鈣離子流起濃度緩沖的作用，預(yù)防鈣超載，通過維持神經(jīng)細胞的鈣離子穩(wěn)定保護cns正常生長發(fā)育。γ氨基丁酸(gaba)是大腦皮層主要的神經(jīng)遞質(zhì)抑制劑，erickson發(fā)現(xiàn)鱈魚大腦中g(shù)aba神經(jīng)元的細胞體和突觸都包含大量pvalb。pvalb有助于維持gaba能神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定，其抑制作用的改變是癲癇產(chǎn)生的主要原因。brown等發(fā)現(xiàn)pvalb+中間神經(jīng)元傳遞gaba能減少會影響小鼠的恐懼感和對新事物的探索欲，類似精神分裂癥的癥狀表現(xiàn)。本研究檢測到慢性感染弓形蟲的鼠腦中pvalb表達水平明顯上調(diào)，可能與蟲體入侵導致的機械損傷與細胞能鈣離子濃度改變有關(guān)，宿主細胞需要更多的pvalb來參與鈣離子調(diào)控。2.3差異表達蛋白的qrt-pcr分析驗證為了進一步驗證itraq的實驗結(jié)果的可靠性，我們選取10個差異表達蛋白進行qrt-pcr檢測，結(jié)果中有9個蛋白的結(jié)果與itraq結(jié)果一致(高達90％的相似性)。另外1個蛋白的鑒定結(jié)果不一致，可能是由于itraq技術(shù)優(yōu)于qrt-pcr的高度靈敏性。結(jié)果表明itraq結(jié)果在本研究中的可靠性。鑒定結(jié)果如圖3所示(圖3為部分差異表達蛋白mrna表達水平的熒光定量pcr驗證結(jié)果)2.4wb結(jié)果為了對itraq結(jié)果提供一個對照和驗證，我們重復(fù)進行了三次wb實驗。通過分析選取差異表達蛋白中變化顯著的上調(diào)蛋白(pvalb，4.53倍)和下調(diào)蛋白(syt7，0.35倍)。實驗組wb結(jié)果顯示：pvalb表達水平明顯增加，syt7表達水平顯著下降，這與itraq的結(jié)果一致。鑒定結(jié)果如圖4所示(圖4為pvalb和syt7表達水平變化wb驗證結(jié)果；圖5為pvalb和syt7表達水平變化wb驗證量化結(jié)果)本發(fā)明第一實施例中通過建立弓形蟲pru株慢性感染小鼠模型，運用8標itraq技術(shù)，結(jié)合lc-ms/ms分析比較弓形蟲慢性感染小鼠與健康小鼠的腦組織，篩選差異表達的鼠腦蛋白質(zhì)，并采用熒光定量pcr和westernblot驗證itraq數(shù)據(jù)。結(jié)果共鑒定出4983個蛋白，差異表達蛋白461個，其中215個蛋白上調(diào)表達，246個蛋白下調(diào)表達，差異蛋白主要涉及代謝和神經(jīng)過程等通路。為了進一步說明本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明第二實施例還采用沙鼠替換本發(fā)明上述第一實施例中的昆明鼠，其他步驟不變，獲得部分差異表達蛋白信息如表5所示：表5部分差異表達蛋白信息在uniprot數(shù)據(jù)庫登錄號為了進一步說明本發(fā)明的有益效果，本發(fā)明第三實施例還采用balb/c鼠替換本發(fā)明上述第一實施例中的昆明鼠，其他步驟不變，獲得差異表達蛋白情況為：上調(diào)蛋白159種；下調(diào)蛋白有353種，部分差異表達蛋白情信息如表6所示：表6部分差異表達蛋白信息在uniprot數(shù)據(jù)庫登錄號序號10種高表達蛋白信息10種低表達蛋白信息1tr|b2rqx9|b2rqx9_mousesp|q9r257|hebp1_mouse2tr|a0a0a6ywr2|a0a0a6ywr2_mousesp|q8k207|ca021_mouse3sp|p01897|ha1l_mousetr|g3ux33|g3ux33_mouse4sp|p03995|gfap_mousesp|q8ci32|bag5_mouse5sp|q9esm3|hpln2_mousesp|q80xg9|lrrt4_mouse6tr|q62293|q62293_mousesp|p68369|tba1a_mouse7sp|p19246|nfh_mousesp|p62245|rs15a_mouse8sp|q3uy34|cl043_mousesp|p15209|ntrk2_mouse9sp|p08553|nfm_mousesp|p01630|kv2a6_mouse10sp|q91x72|hemo_mousesp|o35682|myadm_mouse本發(fā)明提供的方法通過比較弓形蟲慢性感染小鼠與健康小鼠的腦組織，篩選出了的差異表達的鼠腦蛋白質(zhì)，有助于從蛋白質(zhì)組學角度挖掘差異表達的鼠腦蛋白質(zhì)導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem,cns)損傷的機制，可為尋找生物標志物提供靶標。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁12