本發(fā)明屬于腫瘤免疫治療領(lǐng)域，具體涉及一種非小細(xì)胞肺癌全細(xì)胞抗原樹突狀細(xì)胞瘤苗的制備方法。
背景技術(shù)：
肺癌發(fā)生于支氣管黏膜上皮，近50年來肺癌的發(fā)病率顯著增高，在歐美工業(yè)發(fā)達(dá)國家和我國的一些工業(yè)大城市中，肺癌發(fā)病率在男性惡性腫瘤中已居首位，在女性發(fā)病率也迅速增高，占女性常見惡性腫瘤的第2位或第3位。肺癌成為危害生命健康的一種主要疾病,肺癌通常分為兩種：非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)約占80±85％，小細(xì)胞肺癌(small cell carcinoma，SCC),約占15±20％。
非小細(xì)胞肺癌主要有三種亞型，包括腺癌(50％)、鱗癌(30％)、大細(xì)胞癌(5％),盡管手術(shù)、放療、化療的技術(shù)在不斷進(jìn)步，但25年來，其五年期生存率也僅從5％提高到15％,因此開發(fā)一種新的治療方法也就尤為必要。
腫瘤疫苗是腫瘤生物治療的重要組成部分，近年來發(fā)展迅速，為腫瘤的預(yù)防和治療開辟了新的途徑,腫瘤疫苗原理是利用腫瘤抗原激發(fā)機體自身的免疫保護機制，達(dá)到全身性的特異性抗腫瘤作用,與現(xiàn)有治療方法相比，腫瘤疫苗毒副作用小，特異性高，作用范圍廣，在阻止腫瘤擴散，防止復(fù)發(fā)等方面逐漸展現(xiàn)出其功效。
樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)是體內(nèi)功能最強的抗原提呈細(xì)胞，能有效攝取、加工腫瘤抗原，表達(dá)高水平MHC-Ⅰ，MHC-Ⅱ類分子及CD54、CD80、CD86等多中共刺激分子，并分泌多種細(xì)胞因子如IL-12p70，誘導(dǎo)特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，也促進(jìn)了體液免疫，在機體抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用。
目前DC瘤苗負(fù)載的抗原主要有：腫瘤相關(guān)抗原肽(TAA)、腫瘤全細(xì)胞裂解物、凋亡細(xì)胞等,關(guān)于小細(xì)胞肺癌瘤苗制備方面，目前還主要在研究和探索階段，目前還未找到有效激發(fā)免疫應(yīng)答的肺癌特異性抗原,因此選擇何種相關(guān)抗原并以何種手段刺激活化DC，從而增強患者免疫狀態(tài)，成為免疫治療的關(guān)鍵問題。體外研究表明，體外培養(yǎng)、擴增DC，并用腫瘤的裂解物致敏DC回輸體內(nèi)，可有效誘發(fā)機體的特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答,該方法簡單易行，無需明確腫瘤抗原，回避了鑒定腫瘤特異性抗原的困難，可以激發(fā)針對多個已知或未知的腫瘤相關(guān)抗原的T細(xì)胞免疫，減少了腫瘤逃逸的可能性，且因其高表達(dá)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子，同時啟動廣泛的Th1和CTL的免疫反應(yīng)，可誘發(fā)多重免疫反應(yīng)。
同時近年來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞在熱休克過程中能大量產(chǎn)生熱休克蛋白(HSP70、HSP90、鈣網(wǎng)蛋白等)，HSP已被證明其作為一種免疫佐劑能有效地增強免疫反應(yīng),因此，經(jīng)過熱休克的腫瘤細(xì)胞裂解物能更有效的致敏DC細(xì)胞,此外,研究表明，細(xì)菌脂多糖(LPS)刺激DC細(xì)胞后可增強DC細(xì)胞表面表達(dá)共刺激分子、促進(jìn)其分泌細(xì)胞因子等，故其可以用來增強DC的抗原提成功能，增強免疫效應(yīng)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的副作用大、效果比較差的缺陷，提供一種非小細(xì)胞肺癌全細(xì)胞抗原樹突狀細(xì)胞瘤苗的制備方法來解決上述問題。
本發(fā)明公開了一種非小細(xì)胞肺癌全細(xì)胞抗原樹突狀細(xì)胞瘤苗的制備方法，具體步驟為：
(一)、全細(xì)胞腫瘤抗原制備：
(1)、分別取對數(shù)生長期的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H520和H522各2×106個，懸浮于1ml PBS中，得到細(xì)胞懸液；
(2)、將細(xì)胞懸液置于40-43℃恒溫水浴鍋中，處理1h；
(3)、水浴鍋中取出細(xì)胞懸液，立即放到-75--85℃超低溫冰箱中，1h之后，轉(zhuǎn)入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃，至完全融化，再次放入-75--85℃超低溫冰箱中，如此反復(fù)3次；
(4)、在12000rpm的條件下，離心10min；
(5)、取上清，即為熱休克腫瘤細(xì)胞凍融抗原，并用0.2μm孔徑過濾器過濾上清液，去除雜質(zhì)后，將上清液置于-75--85℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>
(二)、DC細(xì)胞制備：
(6)、取自體外周血100ml于血袋中，在無菌條件下分裝于含有15ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，每管15ml，在2000rpm的條件下，離心15-25min；
(7)、離心結(jié)束后，吸取黃色透明層上的白膜層，再用生理鹽水重懸于50ml離心管中，離心3-8min，棄上清，如此反復(fù)兩次；
(8)、將細(xì)胞重懸于10ml的GT-T551培養(yǎng)基中，然后裝于T75培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育2h；
(9)、吸棄懸浮液，DC細(xì)胞貼壁，再加入40ml GT-T551培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換一次培養(yǎng)液；
(三)、DC瘤苗制備：
(10)、DC細(xì)胞培養(yǎng)第6天，將凍融抗原加入DC細(xì)胞中孵育4h；
(11)、加入Poly(I:C)25μg/ml孵育20小時，誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟；
(12)、在上述細(xì)胞液中加入LPS，使?jié)舛葹?μg/ml，孵育24h，以增強DC細(xì)胞表達(dá)共刺激分子，分泌IL-12p70；
(13)、第8天，細(xì)胞刮子從培養(yǎng)瓶底部刮起腫瘤細(xì)胞，收集到50ml離心管中，2000rpm，5min離心；
(14)、棄上清，并重懸上述DC細(xì)胞于生理鹽水中，離心3-8min，棄上清，重復(fù)兩次，即制成負(fù)載全細(xì)胞抗原的DC瘤苗。
作為優(yōu)選，所述的步驟(7)中，離心速度為1500rpm。
作為優(yōu)選，所述的步驟(8)中，所述的GT-T551培養(yǎng)基中含有40U/ml的硫酸慶大霉素和50μg/ml的兩性霉素B。
作為優(yōu)選，所述的步驟(9)中，所述的GT-T551培養(yǎng)基中含有40U/ml的硫酸慶大霉素、5％(v/v)滅活人AB血清、50μg/ml兩性霉素B、1000U/ml GM-CSF、500U/ml IL-4。
作為優(yōu)選，所述的步驟(10)中，DC細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的濃度比在5:1-10:1之間，其中凍融抗原H520:H522＝1:1。
作為優(yōu)選，所述的步驟(14)中，離心速度為1500rpm。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點：
1、本發(fā)明采用非小細(xì)胞肺癌全細(xì)胞裂解物作為抗原致敏DC細(xì)胞；
2、本發(fā)明選用兩種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系分別為H520和H522，且其比例為H520:H522＝1:1；
3、本發(fā)明采用熱休克方法，促使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生熱休克蛋白。
4、本發(fā)明DC細(xì)胞來源于自體外周血，通過體外培養(yǎng)，獲得大量DC細(xì)胞，無毒副作用。
5、本發(fā)明采用多聚肌苷酸(Poly(I:C))誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟，其濃度為25μg/ml。
6、本發(fā)明使用LPS刺激DC細(xì)胞，增強免疫反應(yīng)，免疫效果好。
具體實施方式
下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。
本發(fā)明公開了一種非小細(xì)胞肺癌全細(xì)胞抗原樹突狀細(xì)胞瘤苗的制備方法，具體步驟為：
(一)、全細(xì)胞腫瘤抗原制備：
(1)、分別取對數(shù)生長期的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H520和H522各2×106個，懸浮于1ml PBS中，得到細(xì)胞懸液；
(2)、將細(xì)胞懸液置于40-43℃恒溫水浴鍋中，處理1h；
(3)、水浴鍋中取出細(xì)胞懸液，立即放到-75--85℃超低溫冰箱中，1h之后，轉(zhuǎn)入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃，至完全融化，再次放入-75--85℃超低溫冰箱中，如此反復(fù)3次；
(4)、在12000rpm的條件下，離心10min；
(5)、取上清，即為熱休克腫瘤細(xì)胞凍融抗原，并用0.2μm孔徑過濾器過濾上清液，去除雜質(zhì)后，將上清液置于-75--85℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>
(二)、DC細(xì)胞制備：
(6)、取自體外周血100ml于血袋中，在無菌條件下分裝于含有15ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，每管15ml，在2000rpm的條件下，離心15-25min；
(7)、離心結(jié)束后，吸取黃色透明層上的白膜層，再用生理鹽水重懸于50ml離心管中，離心3-8min，棄上清，如此反復(fù)兩次；
(8)、將細(xì)胞重懸于10ml的GT-T551培養(yǎng)基中，然后裝于T75培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育2h；
(9)、吸棄懸浮液，DC細(xì)胞貼壁，再加入40ml GT-T551培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換一次培養(yǎng)液；
(三)、DC瘤苗制備：
(10)、DC細(xì)胞培養(yǎng)第6天，將凍融抗原加入DC細(xì)胞中孵育4h；
(11)、加入Poly(I:C)25μg/ml孵育20小時，誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟；
(12)、在上述細(xì)胞液中加入LPS，使?jié)舛葹?μg/ml，孵育24h，以增強DC細(xì)胞表達(dá)共刺激分子，分泌IL-12p70；
(13)、第8天，細(xì)胞刮子從培養(yǎng)瓶底部刮起腫瘤細(xì)胞，收集到50ml離心管中，2000rpm，5min離心；
(14)、棄上清，并重懸上述DC細(xì)胞于生理鹽水中，離心3-8min，棄上清，重復(fù)兩次，即制成負(fù)載全細(xì)胞抗原的DC瘤苗。
作為優(yōu)選，所述的步驟(7)中，離心速度為1500rpm。
作為優(yōu)選，所述的步驟(8)中，所述的GT-T551培養(yǎng)基中含有40U/ml的硫酸慶大霉素和50μg/ml的兩性霉素B。
作為優(yōu)選，所述的步驟(9)中，所述的GT-T551培養(yǎng)基中含有40U/ml的硫酸慶大霉素、5％(v/v)滅活人AB血清、50μg/ml兩性霉素B、1000U/ml GM-CSF、500U/ml IL-4。
作為優(yōu)選，所述的步驟(10)中，DC細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的濃度比在5:1-10:1之間，其中凍融抗原H520:H522＝1:1。
作為優(yōu)選，所述的步驟(14)中，離心速度為1500rpm。
實施例1
本發(fā)明公開了一種非小細(xì)胞肺癌全細(xì)胞抗原樹突狀細(xì)胞瘤苗的制備方法，具體步驟為：
(一)、全細(xì)胞腫瘤抗原制備：
(1)、分別取對數(shù)生長期的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H520和H522各2×106個，懸浮于1ml PBS中，得到細(xì)胞懸液；
(2)、將細(xì)胞懸液置于42℃恒溫水浴鍋中，處理1h；
(3)、水浴鍋中取出細(xì)胞懸液，立即放到-80℃超低溫冰箱中，1h之后，轉(zhuǎn)入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃，至完全融化，再次放入-80℃超低溫冰箱中，如此反復(fù)3次；
(4)、在12000rpm的條件下，離心10min；
(5)、取上清，即為熱休克腫瘤細(xì)胞凍融抗原，并用0.2μm孔徑過濾器過濾上清液，去除雜質(zhì)后，將上清液置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>
(二)、DC細(xì)胞制備：
(6)、取自體外周血100ml于血袋中，在無菌條件下分裝于含有15ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，每管15ml，在2000rpm的條件下，離心20min；
(7)、離心結(jié)束后，吸取黃色透明層上的白膜層，再用生理鹽水重懸于50ml離心管中，離心5min，棄上清，如此反復(fù)兩次；
(8)、將細(xì)胞重懸于10ml的GT-T551培養(yǎng)基中，然后裝于T75培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育2h；
(9)、吸棄懸浮液，DC細(xì)胞貼壁，再加入40ml GT-T551培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換一次培養(yǎng)液；
(三)、DC瘤苗制備：
(10)、DC細(xì)胞培養(yǎng)第6天，將凍融抗原加入DC細(xì)胞中孵育4h；
(11)、加入Poly(I:C)25μg/ml孵育20小時，誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟；
(12)、在上述細(xì)胞液中加入LPS，使?jié)舛葹?μg/ml，孵育24h，以增強DC細(xì)胞表達(dá)共刺激分子，分泌IL-12p70；
(13)、第8天，細(xì)胞刮子從培養(yǎng)瓶底部刮起腫瘤細(xì)胞，收集到50ml離心管中，2000rpm，5min離心；
(14)、棄上清，并重懸上述DC細(xì)胞于生理鹽水中，離心5min，棄上清，重復(fù)兩次，即制成負(fù)載全細(xì)胞抗原的DC瘤苗。
作為優(yōu)選，所述的步驟(7)中，離心速度為1500rpm。
作為優(yōu)選，所述的步驟(8)中，所述的GT-T551培養(yǎng)基中含有40U/ml的硫酸慶大霉素和50μg/ml的兩性霉素B。
作為優(yōu)選，所述的步驟(9)中，所述的GT-T551培養(yǎng)基中含有40U/ml的硫酸慶大霉素、5％(v/v)滅活人AB血清、50μg/ml兩性霉素B、1000U/ml GM-CSF、500U/ml IL-4。
作為優(yōu)選，所述的步驟(10)中，DC細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的濃度比在5:1-10:1之間，其中凍融抗原H520:H522＝1:1。
作為優(yōu)選，所述的步驟(14)中，離心速度為1500rpm。
實施例2
本發(fā)明公開了一種非小細(xì)胞肺癌全細(xì)胞抗原樹突狀細(xì)胞瘤苗的制備方法，具體步驟為：
(一)、全細(xì)胞腫瘤抗原制備：
(1)、分別取對數(shù)生長期的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H520和H522各2×106個，懸浮于1ml PBS中，得到細(xì)胞懸液；
(2)、將細(xì)胞懸液置于40℃恒溫水浴鍋中，處理1h；
(3)、水浴鍋中取出細(xì)胞懸液，立即放到-75℃超低溫冰箱中，1h之后，轉(zhuǎn)入37℃水浴鍋中，輕輕搖晃，至完全融化，再次放入-80℃超低溫冰箱中，如此反復(fù)3次；
(4)、在12000rpm的條件下，離心10min；
(5)、取上清，即為熱休克腫瘤細(xì)胞凍融抗原，并用0.2μm孔徑過濾器過濾上清液，去除雜質(zhì)后，將上清液置于-75℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>
(二)、DC細(xì)胞制備：
(6)、取自體外周血100ml于血袋中，在無菌條件下分裝于含有15ml淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，每管15ml，在2000rpm的條件下，離心15min；
(7)、離心結(jié)束后，吸取黃色透明層上的白膜層，再用生理鹽水重懸于50ml離心管中，離心8min，棄上清，如此反復(fù)兩次；
(8)、將細(xì)胞重懸于10ml的GT-T551培養(yǎng)基中，然后裝于T75培養(yǎng)瓶中，在37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育2h；
(9)、吸棄懸浮液，DC細(xì)胞貼壁，再加入40ml GT-T551培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換一次培養(yǎng)液；
(三)、DC瘤苗制備：
(10)、DC細(xì)胞培養(yǎng)第6天，將凍融抗原加入DC細(xì)胞中孵育4h；
(11)、加入Poly(I:C)25μg/ml孵育20小時，誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟；
(12)、在上述細(xì)胞液中加入LPS，使?jié)舛葹?μg/ml，孵育24h，以增強DC細(xì)胞表達(dá)共刺激分子，分泌IL-12p70；
(13)、第8天，細(xì)胞刮子從培養(yǎng)瓶底部刮起腫瘤細(xì)胞，收集到50ml離心管中，2000rpm，5min離心；
(14)、棄上清，并重懸上述DC細(xì)胞于生理鹽水中，離心3min，棄上清，重復(fù)兩次，即制成負(fù)載全細(xì)胞抗原的DC瘤苗。
作為優(yōu)選，所述的步驟(7)中，離心速度為1500rpm。
作為優(yōu)選，所述的步驟(8)中，所述的GT-T551培養(yǎng)基中含有40U/ml的硫酸慶大霉素和50μg/ml的兩性霉素B。
作為優(yōu)選，所述的步驟(9)中，所述的GT-T551培養(yǎng)基中含有40U/ml的硫酸慶大霉素、5％(v/v)滅活人AB血清、50μg/ml兩性霉素B、1000U/ml GM-CSF、500U/ml IL-4。
作為優(yōu)選，所述的步驟(10)中，DC細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的濃度比在5:1-10:1之間，其中凍融抗原H520:H522＝1:1。
作為優(yōu)選，所述的步驟(14)中，離心速度為1500rpm。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明要求的保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。