本發(fā)明屬于微生物培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種用于分離沉香結香內(nèi)生真菌并實現(xiàn)快速繁殖的培養(yǎng)基，是一種適用于沉香結香菌產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的綠色環(huán)保培養(yǎng)基，同時涉及所述培養(yǎng)基的制備方法。

背景技術：

沉香為瑞香科植物沉香屬的白木香樹aquilariasinensis(lour.)gilg含有樹脂的木材。自古以來，沉香被視作一種名貴香料和中藥材，在宋代已經(jīng)有“一兩沉香一兩金”的說法，具有很高的藥用價值和商業(yè)價值。沉香具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘之功效。其分布于廣東、海南、廣西、福建等地，喜生于低海拔的山地、丘陵以及路邊陽處疏林中。近年來，由于沉香樹自然繁殖率低、人為掠奪式砍伐等原因，國產(chǎn)沉香產(chǎn)量嚴重不足，而市場需求不斷擴大，供需矛盾突出。沉香已被列入國家二級保護瀕危樹種。

普遍觀點認為自然界的白木香樹中一般不會自然產(chǎn)生沉香樹脂，只有在受物理化學的損傷或某些生物的刺激，白木香樹出于自身的免疫修復機制，細胞會分泌出特殊的樹脂來保護自己，與內(nèi)生菌次級代謝產(chǎn)物一起形成了沉香，其自然積累過程需要漫長的數(shù)十年，且品質(zhì)不可控。隨著研究的深入，目前已有不少研究證實沉香的形成與其內(nèi)生菌的感染有關，這些沉香內(nèi)生菌可促進白木香樹結香。我們從野生沉香樹結香木材組織、健康白木組織和葉片組織中提取和分離出沉香內(nèi)生真菌，為下一步研究沉香結香機理提供真菌菌群供試材料。目前已經(jīng)公布的真菌培養(yǎng)基大多數(shù)添加的成分很多，其中添加的一些成分來自于化學合成，而沉香其中一個重要用途是做為名貴中藥，這些經(jīng)過化學提取加工得到的成分是否會對人體健康產(chǎn)生不良影響尚未可知。如中國專利(cn105331560a)公開了一種用于誘導沉香結香的內(nèi)生菌液體培養(yǎng)基，配方為：馬鈴薯70％，木屑17％、麩皮5％、玉米粉4％、黃豆粉1％、蛋白胨0.5％、葡萄糖1％、磷酸二輕鉀0.2％、硫酸鎂0.2％、維生素0.1％。

微生物生長繁殖速率跟菌種、菌齡、接種量及培養(yǎng)條件有關，如果培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分能滿足菌種生長的需要，則菌種很易適應，會起到縮短延滯期的作用，其生長速率會加快，進入對數(shù)生長期(生長速率達到最高的時期，菌數(shù)以幾何級數(shù)增加)的時間會大大縮短。微生物的代時雖然因種而異，可是同一個種也受培養(yǎng)基成分的影響。在自然環(huán)境中，很多菌種的生長速率并不能以幾何級數(shù)增加，而以算術級數(shù)增加，這是因為這些菌種需要某種必需的生長因子，如維生素等，這些生長因子能影響生長速率。而在自然環(huán)境中，生長因子的濃度極低，一旦被細菌繁殖用去一部分后，就會影響下一步的細菌生長率，因而造成算術級數(shù)生長現(xiàn)象。

藜麥，原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，是印加土著居民的主要傳統(tǒng)食物，有5000-7000多年的食用和種植歷史，由于其具有獨特的豐富、全面的營養(yǎng)價值，養(yǎng)育了印加民族，古代印加人稱之為“糧食之母”。藜麥在1980年代被美國宇航局用于宇航員的太空食品。聯(lián)合國糧農(nóng)組織認為藜麥是唯一一種單體植物即可基本滿足人體基本營養(yǎng)需求的食物，正式推薦藜麥為最適宜人類的完美的全營養(yǎng)食品。近幾年很多國家都在大力發(fā)展藜麥種植，中國的專業(yè)農(nóng)業(yè)公司也與南美洲一些藜麥專業(yè)公司合作，在國內(nèi)類似南美洲藜麥生長氣候的區(qū)域開始了大規(guī)模種植藜。藜麥胚芽占種子的30％，且具有營養(yǎng)活性，藜麥的蛋白質(zhì)含量高達16％-22％(牛肉20％)，品質(zhì)與奶粉及肉類相當，富含多種氨基酸，其中有人體必需的全部9種必需氨基酸，比例適當且易于吸收，尤其富含植物中缺乏的賴氨酸，鈣、鎂、磷、鉀、鐵、鋅、硒、錳、銅等礦物質(zhì)營養(yǎng)含量高，富含不飽和脂肪酸、類黃酮、b族維生素和e族維生素、膽堿、甜菜堿、葉酸、α-亞麻酸、β-葡聚糖等多種有益化合物。藜麥的特性為其能夠應用于微生物培養(yǎng)基中奠定了基礎，由于藜麥營養(yǎng)豐富全面，能夠替代傳統(tǒng)培養(yǎng)基中多種常規(guī)組分滿足微生物快速繁殖的需要。如中國專利(cn104718987a)公開了一種以藜麥膨化料和藜麥粉碎料為培養(yǎng)基，接種冬蟲夏草和蛹蟲草種子液進行發(fā)酵生產(chǎn)的方法，膨化藜麥與機械粉碎藜麥混合后進行發(fā)酵，一方面使得菌體可以快速利用膨化過程所產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)，另一方面機械粉碎藜麥相當于是固態(tài)發(fā)酵載體使發(fā)酵基質(zhì)保持疏松有利菌體生長，當菌體生長旺盛時菌體產(chǎn)生大量胞外酶又可以進一步分解利用機械粉碎藜麥。該過程無需添加其它物質(zhì)，保證發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量高度可控。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種綠色環(huán)保、健康對人無害的、適用于沉香結香內(nèi)生真菌分離和快繁的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基主要由天然原料馬鈴薯、藜麥配備其他輔料制備而成，制備簡便、經(jīng)濟實用。

具體的，本發(fā)明所述沉香結香內(nèi)生真菌分離與快繁用培養(yǎng)基，由包括以下重量份數(shù)比的原料組分制備而得：馬鈴薯100-200份、藜麥15-40份、葡萄糖15-25份、瓊脂0-20份、蒸餾水700-900份。

本發(fā)明同時提供了所述沉香結香內(nèi)生真菌分離與快繁用培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：

(1)將馬鈴薯削皮、切片后與水混合，打漿，漿渣分離，得馬鈴薯汁；或將馬鈴薯削皮、切塊后加水煮沸，漿渣分離，得馬鈴薯汁；

(2)將藜麥用水浸泡過夜，打漿，漿渣分離，得藜麥汁；

(3)將馬鈴薯汁和藜麥汁混合，加入葡糖糖、瓊脂(制備固體培養(yǎng)基時加入)和蒸餾水，混勻，調(diào)節(jié)ph為5.8-6.0,121℃滅菌20min，即得。

作為本發(fā)明沉香結香內(nèi)生真菌分離與快繁用培養(yǎng)基的制備方法的進一步說明，所述馬鈴薯與水的重量比為1:3-8；所述馬鈴薯削皮、切塊后加水煮沸時間為25-35min；所述藜麥用水浸泡時間為8-24h；所述藜麥與水的重量比為1:3-8。

本發(fā)明培養(yǎng)基中添加的藜麥，營養(yǎng)豐富全面，富含四十多種營養(yǎng)物質(zhì)，包括多種氨基酸、礦物質(zhì)、維生素及多種有益的化合物，能夠全面提供沉香內(nèi)生真菌生長和快速繁殖的需要。從試驗結果得知，本發(fā)明培養(yǎng)基分離到的沉香內(nèi)生真菌數(shù)量明顯增多，在液體搖菌培養(yǎng)中沉香內(nèi)生真菌在短時間內(nèi)能達到最大生長量，從而大大縮短了搖菌時間。而且這種培養(yǎng)基營養(yǎng)成分全部來自天然食材食材(馬鈴薯、藜麥)加葡萄糖，沒有任何其他添加劑，對做為入口治病藥材的沉香結香菌的培養(yǎng)尤為重要，綠色環(huán)保，且制備簡便經(jīng)濟實用。

具體實施方式

以下結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，本實施例僅是對本發(fā)明作更清楚的說明，而不是對本發(fā)明的限制。應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些均落在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

實施例中的沉香結香內(nèi)生真菌分離與快繁用培養(yǎng)基，由包括以下重量份數(shù)比的原料組分制備而得：馬鈴薯100-200份、藜麥15-40份、葡萄糖15-25份、瓊脂0-20份、蒸餾水700-900份。制備方法包括以下步驟：

(1)將馬鈴薯削皮、切片后與水按重量比為1:3-8混合，打漿，漿渣分離，得馬鈴薯汁；或將馬鈴薯削皮、切塊后加3-8倍重量的水煮沸25-35min，漿渣分離，得馬鈴薯汁；

(2)將藜麥用3-8倍重量的水浸泡8-24h，打漿，漿渣分離，得藜麥汁；

(3)將馬鈴薯汁和藜麥汁混合，加入葡糖糖、瓊脂(制備固體培養(yǎng)基時加入)和蒸餾水，混勻，調(diào)節(jié)ph為5.8-6.0,121℃滅菌20min，即得。

下面通過更具體實施例對本發(fā)明進行說明。

實施例1

一種沉香結香內(nèi)生真菌分離與快繁用培養(yǎng)基，制備方法包括以下步驟：

(1)將馬鈴薯削皮、切片，稱取200g與水按重量比為1:6混合，用細胞破壁機打漿，過濾分離漿渣，得馬鈴薯汁；

(2)稱取10g藜麥用6倍重量的水浸泡12h，再用細胞破壁機打漿，過濾分離漿渣，得藜麥汁；

(3)將馬鈴薯汁和藜麥汁混合，加入葡糖糖20g、瓊脂15g，充分溶解后用蒸餾水定容至1000ml，混勻，調(diào)節(jié)ph為5.8,121℃滅菌20min，即得。

實施例2

一種沉香結香內(nèi)生真菌分離與快繁用培養(yǎng)基，制備方法包括以下步驟：

(1)將馬鈴薯削皮、切塊，稱取200g加8倍水煮沸30min，然后用細胞破壁機打漿，過濾分離漿渣，得馬鈴薯汁；

(2)稱取20g藜麥用5倍重量的水浸泡16h，再用細胞破壁機打漿，過濾分離漿渣，得藜麥汁；

(3)將馬鈴薯汁和藜麥汁混合，加入葡糖糖20g、瓊脂10g，充分溶解后用蒸餾水定容至1000ml，混勻，調(diào)節(jié)ph為6.0,121℃滅菌20min，即得。

以下實施例3-8與上述實施例1、2的制備過程基本一致，不同之處僅在于原料組分用量的不同，因此，制備過程不再累述。

實施例3：馬鈴薯200g、藜麥30g、瓊脂15g、葡萄糖20g，蒸餾水補足至1000ml。

實施例4：馬鈴薯150g、藜麥15g、瓊脂15g、葡萄糖20g，蒸餾水補足至1000ml。

實施例5：馬鈴薯150g、藜麥25g、瓊脂20g、葡萄糖20g，蒸餾水補足至1000ml。

實施例6：馬鈴薯150g、藜麥35g、瓊脂15g、葡萄糖20g，蒸餾水補足至1000ml。

實施例7：馬鈴薯100g、藜麥30g、瓊脂15g、葡萄糖20g，蒸餾水補足至1000ml。

實施例8：馬鈴薯100g、藜麥40g、瓊脂20g、葡萄糖20g，蒸餾水補足至1000ml。

實施例1-8所制得的固體培養(yǎng)基作為分離培養(yǎng)基，以加瓊脂的固體pda培養(yǎng)基和sda瓊脂培養(yǎng)基作為對照培養(yǎng)基，采用組織分離法對沉香結香木材組織、健康白木組織和葉片的內(nèi)生真菌進行分離，將表面消毒過的木材組織在超凈工作臺上用無菌刀片去除外周表層木材組織，切成長寬為3cm×2cm的薄片狀，葉片消毒后切成長寬為2cm×2cm大小，放入上述培養(yǎng)基平板上，28℃避光培養(yǎng)，設置3個重復。對所分離的內(nèi)生真菌進行反復純化，對得到單一菌落進行統(tǒng)計，統(tǒng)計分離得到的內(nèi)生真菌數(shù)量，結果見表1。

表1實施例1-8培養(yǎng)基對沉香內(nèi)生真菌的分離效果

按實施例1-8制備過程、原料組分用量(除了不添加瓊脂)制得的液體培養(yǎng)基作為快繁培養(yǎng)基，對應實施例9-16。

隨機選取野生沉香樹結香木材組織內(nèi)分離到的內(nèi)生真菌3個作為供試菌種，每個菌種單獨平板劃線后挑取單菌落分別接種到實施例9-16培養(yǎng)基和兩個對照培養(yǎng)基中(液體pda培養(yǎng)基和sda培養(yǎng)基)，50ml帶蓋離心管裝20ml培養(yǎng)基(每份做兩個平行)，200轉28℃搖菌培養(yǎng)7天。用干重法測定其各自的生物量，具體做法：培養(yǎng)液用濾紙過濾后，留在紙上的菌絲體先用適量清水洗滌，80℃烘干稱重。本實驗進行三次重復，取平均值。結果見表2。

表2實施例9-16培養(yǎng)基對不同菌種的生長量比較

從表1可見實施例1-8培養(yǎng)基通過對3個不同部位內(nèi)生真菌分離純化培養(yǎng)，所測得的分離菌株總數(shù)明顯高于對照培養(yǎng)基，提高60％以上。從表2可見實施例9-16培養(yǎng)基通過3種不同真菌進行7天搖菌培養(yǎng)，所測得的菌體生長量明顯高于對照培養(yǎng)基，提高大約20-40％左右。