本發(fā)明涉及免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及氟樂靈半抗原及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
氟樂靈(trifluralin)是一種重要的選擇性芽前二硝基苯胺類(dinitroaniline)除草劑，廣泛用于大豆、大麥、蔬菜及水果等作物，防除一年生禾本科雜草及部分闊葉雜草。氟樂靈雖屬低毒農(nóng)藥，但長期暴露實(shí)驗(yàn)表明會(huì)對肝臟和腎臟造成損傷，在高劑量暴露下會(huì)造成胎兒的體重和身高偏低并增加流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。因氟樂靈農(nóng)藥的廣泛使用，使其在土壤和水體當(dāng)中的殘留普遍存在，特別是能夠在水產(chǎn)品(魚、蝦、蟹)體內(nèi)富集，從而對水產(chǎn)品的食用安全帶來巨大隱患。
為了避免氟樂靈除草劑的潛在危害，很多國家對其使用進(jìn)行了限制。歐盟2015年對氟樂靈制定新的限量標(biāo)準(zhǔn)，水果、蔬菜、谷物及動(dòng)物源食品中氟樂靈的最大殘留限量(mrls)為0.01mg/kg。日本對進(jìn)口水產(chǎn)品中氟樂靈最大殘留限量為0.001mg/kg。
目前農(nóng)產(chǎn)品中氟樂靈的檢測通常使用儀器分析的方法，如紫外光譜、高效液相色譜及液質(zhì)聯(lián)用、氣相色譜、毛細(xì)管電泳等。以上的分析方法具有準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)，但由于儀器昂貴、運(yùn)行成本高難以全面推廣。實(shí)踐證明，以快速檢測方法對大量樣品進(jìn)行初篩，然后對其中陽性樣品進(jìn)行儀器確證是提高檢測效率、降低成本的有效方式，符合我國國情。在現(xiàn)有快速檢測技術(shù)中，基于抗原-抗體特異性識別的免疫檢測技術(shù)由于具有靈敏、快速、準(zhǔn)確、成本低廉且可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測等優(yōu)勢，被認(rèn)為是21世紀(jì)最具競爭性和挑戰(zhàn)性的超微量檢測技術(shù)。
關(guān)于氟樂靈免疫檢測的文獻(xiàn)國外僅有數(shù)篇報(bào)道。bruceriggle于1991年第一嘗試構(gòu)建了針對氟樂靈的酶聯(lián)免疫分析方法，線性范圍0.1～1.0ppm(ng/ml)，同時(shí)可以檢測部分氟樂靈的代謝物。székácsetal2000年對氟樂靈免疫檢測進(jìn)行了再次嘗試并建立了elisa方法，檢測的線性的范圍有所提高(0.1～100ng/ml)，與其他結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率≤5％，并檢測了地表水和果汁中的氟樂靈含量。székács課題組于2003年又建立了基于免疫傳感器的光波介導(dǎo)的光譜檢測(opticalwaveguidelightmodespectroscopicdetection，owls)方法，雖然此方法大大提高了檢測靈敏度(2×10-7～3×10-5ng/ml)，但是此種方法因儀器條件問題難以在實(shí)際檢測中應(yīng)用。目前，國內(nèi)未見有關(guān)氟樂靈免疫檢測的相關(guān)報(bào)道。國內(nèi)檢測市場上更是缺少氟樂靈農(nóng)藥殘留免疫檢測試劑盒的產(chǎn)品。
現(xiàn)在大部分藥物、毒素、環(huán)境污染物分子質(zhì)量比較小，屬于半抗原，大部分半抗原需要與蛋白質(zhì)偶聯(lián)后才能產(chǎn)生免疫原性。目前制備半抗原抗體的常規(guī)方法是選擇具有毒理學(xué)意義的原形藥物作為待測物，通過設(shè)計(jì)合成保留待測物分子結(jié)構(gòu)特征或類似結(jié)構(gòu)特征并帶有活性基團(tuán)的半抗原，通過半抗原與大分子蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)，制備人工免疫原，同時(shí)經(jīng)動(dòng)物免疫制備針對半抗原的特異性抗體。而半抗原的提供是免疫化學(xué)分析中最為關(guān)鍵的步驟，合理的半抗原設(shè)計(jì)和制備將有利于抗體的質(zhì)量的提高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一系列可通用于氟樂靈檢測的半抗原，所述半抗原偶連載體蛋白后能使機(jī)體產(chǎn)生效價(jià)高，能識別氟樂靈農(nóng)藥共有結(jié)構(gòu)的特異性抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述半抗原的制備方法和應(yīng)用。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
一種氟樂靈半抗原，其特征在于，具有如下結(jié)構(gòu)式：
其中，r為-(ch2)n-，n＝1-4或-ch＝ch-或
本發(fā)明氟樂靈半抗原具體具有以下1c、2c、3c、4c、5c和6c所示的結(jié)構(gòu)式：
以下為本發(fā)明的半抗原分子的制備過程的描述。
1.本發(fā)明半抗原合成所涉及的反應(yīng)方程式表示如下：
1c：r＝-(ch2)-1
2c：r＝-(ch2)-2n＝1
3c：r＝-(ch2)-3n＝2
4c：r＝-(ch2)-4n＝3
5c：r＝-(ch＝ch)-
6c：
2.本發(fā)明所涉及的六種氟樂靈半抗原合成步驟如下：
(一)氟樂靈半抗原結(jié)構(gòu)為1c、2c、3c或4c時(shí)，其合成步驟包括：在催化劑存在下，將底物與烷基化試劑進(jìn)行烷基化反應(yīng)，純化后獲得仲胺中間體，仲胺中間體進(jìn)行水解反應(yīng)獲得第二中間體，第二中間體再與4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯混合反應(yīng)，經(jīng)純化后獲得目標(biāo)半抗原分子。
進(jìn)一步地，將丙烯酸乙酯溶于氯仿，加入正丙胺，其中，丙烯酸乙酯和正丙胺的摩爾比為1∶1.5，40℃油浴，攪拌反應(yīng)，獲得含酯基的仲胺中間體；將含酯基的仲胺中間體溶解于四氫呋喃，加入氫氧化鈉水溶液，室溫?cái)嚢柽M(jìn)行水解，獲得第二中間體；向上述第二中間體中加入4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯，室溫?cái)嚢?，反?yīng)結(jié)束后進(jìn)行酸堿倒萃取，合并有機(jī)相，用無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，獲得半抗原分子(1c)。
進(jìn)一步地，將2-吡咯烷酮溶于dmf，依次加入60％的氫化鈉溶液和正溴丙烷，其中，2-吡咯烷酮、氫化鈉和正溴丙烷的摩爾比為：1∶1.2∶1.3，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，70℃油浴，攪拌反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，萃取反應(yīng)混合液，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，獲得含酯基的仲胺中間體；向含酯基的仲胺中間體中加入4n氫氧化鈉水溶液，于100℃油浴攪拌過夜進(jìn)行水解，獲得第二中間體；將4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯溶解于四氫呋喃，加入上述第二中間體，4-氯-3，5-二硝基三氟甲苯與第二中間體的摩爾比為1∶1.5，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)；反應(yīng)完全后加水稀釋，加稀鹽酸酸化并用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，獲得半抗原分子(2c)。
進(jìn)一步地，將戊內(nèi)酰胺溶于dmf，依次加入60％的氫化鈉溶液和正溴丙烷，其中，戊內(nèi)酰胺、氫化鈉和正溴丙烷的摩爾比為：1∶1.2∶1.2，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，70℃油浴，攪拌反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后，加水稀釋，并加酸調(diào)節(jié)ph至2-3，出現(xiàn)沉淀物，用乙酸乙酯萃取，再用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，獲得含酯基的仲胺中間體；向含酯基的仲胺中間體中加入37％鹽酸和水，100℃油浴，冷凝回流進(jìn)行水解，獲得第二中間體；將4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯溶解于四氫呋喃，加入上述第二中間體、三乙胺和水，4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯與第二中間體的摩爾比為1:1.2，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)；反應(yīng)完全后加水稀釋，加稀鹽酸酸化并用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，獲得半抗原分子(3c)。
進(jìn)一步地，將己內(nèi)酰胺溶于dmf，依次加入60％的氫化鈉溶液和正溴丙烷，其中，戊內(nèi)酰胺、氫化鈉和正溴丙烷的摩爾比為：1:1.2:1.2，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，70℃油浴，攪拌反應(yīng)；反應(yīng)完全后加水稀釋，加稀鹽酸酸化并用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，獲得含酯基的仲胺中間體；向含酯基的仲胺中間體中加入37％鹽酸和水，100℃油浴，冷凝回流進(jìn)行水解，獲得第二中間體；將4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯溶解于四氫呋喃，加入上述第二中間體、三乙胺和水，4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯與第二中間體的摩爾比為1:3，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)；反應(yīng)完全后加水稀釋，加稀鹽酸酸化并用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，獲得半抗原分子(4c)。
本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過多方面研究嘗試發(fā)現(xiàn)，氟樂靈半抗原結(jié)構(gòu)為1c時(shí)，通過恰當(dāng)變量其制備工藝條件和參數(shù)，生成含酯基的仲胺中間體，保護(hù)羧基不與其他基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，此步驟大大提高了氟樂靈半抗原的純度和產(chǎn)率。氟樂靈半抗原結(jié)構(gòu)為2c、3c或4c時(shí)，發(fā)明人在眾多的底物和烷基化試劑中進(jìn)行選擇，通過恰當(dāng)變量其制備工藝條件和參數(shù)，大大提高了氟樂靈半抗原的純度和產(chǎn)率。
(二)氟樂靈半抗原結(jié)構(gòu)為5c或6c時(shí)，其合成步驟包括：底物與正丙胺通過酰基化反應(yīng)，生成含酯基的仲胺中間體，含酯基的仲胺中間體再與4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯反應(yīng)，經(jīng)純化后獲得第二中間體，第二中間體再進(jìn)行水解反應(yīng)。
進(jìn)一步地，將4-溴巴豆酸乙酯溶于乙酸乙酯，將反應(yīng)器置于冰-甲醇中降溫至-15℃，用注射器緩慢加入正丙胺，4-溴巴豆酸乙酯與正丙胺的摩爾比為1:3，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，乙酸乙酯萃取反應(yīng)混合液，再用飽和氯化鈉溶液洗滌，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，獲得含酯基的仲胺中間體；將含酯基的仲胺中間體溶于四氫呋喃中，加入4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯和三乙胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯與含酯基的仲胺中間體的摩爾比為1:1.5；反應(yīng)完全后加水稀釋，加稀鹽酸酸化并用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，殘余物經(jīng)柱層析分離純化，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑獲得半抗原分子(5c)。
進(jìn)一步地，將4-溴甲基苯甲酸甲酯溶于乙酸乙酯，將反應(yīng)器置于冰-甲醇中降溫至-15℃，用注射器緩慢加入正丙胺，4-溴甲基苯甲酸甲酯與正丙胺的摩爾比為1:2.5。反應(yīng)結(jié)束后，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)混合液，再用飽和氯化鈉溶液洗滌，有機(jī)相合并，無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，獲得含酯基的仲胺中間體；將含酯基的仲胺中間體溶于四氫呋喃中，加入4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯和三乙胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)，4-氯-3,5-二硝基三氟甲苯與含酯基的仲胺中間體的摩爾比為1:1.5；反應(yīng)完全后加水稀釋，加稀鹽酸酸化并用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，殘余物經(jīng)柱層析分離純化，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑獲得半抗原分子(6c)。
本發(fā)明還提供一種氟樂靈人工免疫原和包被原，其是將上述氟樂靈半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到。
本發(fā)明還提供一種氟樂靈抗體，所述氟樂靈抗體采用上述氟樂靈人工免疫原制備得到，所述氟樂靈抗體為多克隆抗體、單克隆抗體或基因工程抗體。
本發(fā)明具有如下有益效果：
(1)本發(fā)明的六種半抗原均是在氨基位點(diǎn)上衍生連接手臂，具有活性羧基，與載體蛋白偶聯(lián)后能使機(jī)體產(chǎn)生效價(jià)高，能識別氟樂靈農(nóng)藥共有結(jié)構(gòu)的特異抗體。
(2)本發(fā)明的半抗原化合物，不僅合成方法簡便、純度較高，而且能應(yīng)用于合成適于動(dòng)物免疫的抗原體系，彌補(bǔ)了國內(nèi)氟樂靈免疫學(xué)檢測方法技術(shù)領(lǐng)域的空白，為氟樂靈免疫檢測方法的進(jìn)一步發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。
(3)本發(fā)明對氟樂靈半抗原的制備方法進(jìn)行改進(jìn)，合成步驟簡單，所需的實(shí)驗(yàn)條件溫和，本發(fā)明制備方法簡便可行、成本較低，半抗原的純度和產(chǎn)率較高。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明，實(shí)施例僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，不是對本發(fā)明的限定。
實(shí)施例1：氟樂靈半抗原化合物1c的合成方法如下：
(1)丙烯酸乙酯(3600mg，36mmol)溶于30mmol的氯仿，加入正丙胺(3191.94mg，54mmol)油浴40℃攪拌12h，獲得含酯基的仲胺中間體1a。
(2)將1a(239mg，1.5mmol)溶解于6ml四氫呋喃，加入naoh水溶液(120mg，3mmol)，室溫?cái)嚢?，進(jìn)行水解，水解后獲得1b。
(3)直接往1b中加入3，5-二硝基-4-氯-三氟甲苯(270mg，1mmol)，常溫?cái)嚢?。用比例為正己?乙酸乙酯＝2:1的層析液進(jìn)行點(diǎn)板跟蹤，待反應(yīng)完成后進(jìn)行酸堿倒萃取，酸萃有機(jī)相合并，用無水硫酸鈉干燥。40℃旋干，用層析液為正己烷:乙酸乙酯:乙酸＝2:1:0.015上硅膠板分離，獲得目標(biāo)物1c，稱重，收率為75.6％。esi-msanalysis(negative):m/z366.2[m+h]—；1hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.03(s,2h)；3.29(t,j＝6.3hz,2h)；2.89–2.84(m,2h)；2.57–2.51(m,2h)；1.60–1.50(m,2h)；0.81(t,j＝7.4hz,3h)。
實(shí)施例2：氟樂靈半抗原化合物2c的合成方法如下：
(1)2-吡咯烷酮(1000mg，11mmol)溶于10mldmf，加入13.2mmolnah(60％)、正溴丙烷(1758.9mg，14.3mmol)，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，70℃油浴攪拌過夜。反應(yīng)液中加入70ml乙酸乙酯，50ml飽和氯化銨溶液進(jìn)行萃取，有機(jī)相合并，無水硫酸鈉干燥。40℃旋干，獲得含酯基的仲胺中間體2a。
(2)將2a(846mg，6mmol)加入13ml4nnaoh水溶液于100℃油浴攪拌過夜進(jìn)行水解，獲得2b。
(3)將3，5-二硝基-4-氯-三氟甲苯(270mg，1mmol)溶解于6ml四氫呋喃，加入2b(190.5mg，1.5mmol)，室溫?cái)嚢?。?0ml水進(jìn)行稀釋，加1m鹽酸調(diào)ph至2-3，沉淀物出現(xiàn)。用乙酸乙酯萃取兩次，每次乙酸乙酯用量為30ml，沉淀溶解，10ml飽和食鹽水進(jìn)行洗滌，有機(jī)相合并，用無水硫酸鈉干燥。40℃旋干，用層析液為正己烷:乙酸乙酯＝1:1上硅膠板進(jìn)行分離，獲得目標(biāo)物2c，稱重，收率為82.4％。esi-msanalysis(negative):m/z380.1[m+h]—；1hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.00(s,2h)；3.07–2.98(m,2h)；2.94–2.86(m,2h)；2.34(t,j＝7.2hz,2h)；1.89–1.79(m,2h)；1.55(dd,j＝14.9,7.5hz,2h)；0.81(t,j＝7.4hz,3h)。
實(shí)施例3：氟樂靈半抗原化合物3c的合成方法如下：
(1)戊內(nèi)酰胺(2180mg，20mmol)溶于10mldmf，加入24mmolnah(60％)、正溴丙烷(2950mg，24mmol),70℃油浴攪拌，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)4-5小時(shí)。用50ml水進(jìn)行稀釋，加1m鹽酸調(diào)ph至2-3，沉淀物出現(xiàn)。用乙酸乙酯萃取兩次，每次乙酸乙酯用量為50ml，沉淀溶解，15ml飽和食鹽水進(jìn)行洗滌，有機(jī)相合并，用無水硫酸鈉干燥。40℃旋干，獲得含酯基的仲胺3a，稱重，收率為55％。
(2)3a(846mg，6mmol)中加入2.5ml37％鹽酸、和2.5ml水，100℃油浴冷凝回流進(jìn)行水解4-5小時(shí)，獲得水解產(chǎn)物3b。
(3)將3，5-二硝基-4-氯-三氟甲苯(270mg，1mmol)溶解于6ml四氫呋喃，加入3b(235mg，1.2mmol)、三乙胺(404mg，4mmol)、和1ml水，常溫?cái)嚢柽^夜。用30ml水進(jìn)行稀釋，加1m鹽酸調(diào)ph至2-3，沉淀物出現(xiàn)。用乙酸乙酯萃取兩次，每次乙酸乙酯用量為30ml，沉淀溶解，用10ml飽和食鹽水進(jìn)行洗滌，有機(jī)相合并，用無水硫酸鈉干燥。40℃旋干，用層析液為正己烷：乙酸乙酯：乙酸＝4：1：0.02上硅膠板進(jìn)行分離，獲得目標(biāo)物3c，稱重72mg，收率為65.3％。esi-msanalysis(negative):m/z394.3[m+h]—；1hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.06(s,2h)；3.04(t,j＝6.9hz,2h)；3.01–2.94(m,2h)；2.36(t,j＝6.8hz,2h)；1.74–1.50(m,6h)；0.88(t,j＝7.4hz,3h)。
實(shí)施例4：氟樂靈半抗原化合物4c的合成方法如下：
(1)己內(nèi)酰胺(2260mg，20mmol)溶于10mldmf，加入24mmolnah(60％)、正溴丙烷(2950mg，24mmol)，70℃油浴攪拌，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)2h。用50ml水進(jìn)行稀釋，加1m鹽酸調(diào)ph至2-3，沉淀物出現(xiàn)。用乙酸乙酯萃取兩次，每次乙酸乙酯用量為50ml，沉淀溶解，用15ml飽和食鹽水進(jìn)行洗滌，有機(jī)相合并，用無水硫酸鈉干燥。40℃旋干，獲得含酯基的仲胺中間體4a，稱重，收率為55％。
(2)4a(930mg，6mmol)加入2.5ml37％鹽酸、和2.5ml水，100℃油浴冷凝回流進(jìn)行水解過夜，獲得水解產(chǎn)物4b。
(3)3，5-二硝基-4-氯-三氟甲苯(450mg，1.67mmol)溶解于15ml四氫呋喃，加入4b(1047.5mg，5mmol)、三乙胺(1686.7mg，16.7mmol)、和2ml水，常溫?cái)嚢柽^夜。用90ml水進(jìn)行稀釋，加1m鹽酸調(diào)ph至2-3，沉淀物出現(xiàn)。用乙酸乙酯萃取兩次，每次乙酸乙酯用量為90m，沉淀溶解，用30ml飽和食鹽水進(jìn)行洗滌，有機(jī)相合并，用無水硫酸鈉干燥。40℃旋干，用正己烷：乙酸乙酯＝20：1、10：1、5：1、4：1的層析液比例進(jìn)行柱層析分離，40℃旋干，獲得目標(biāo)物4c，稱重73.2mg，收率為58％。esi-msanalysis(negative)m/z408.3[m+h]—；1hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.06(s,2h)；3.1(t,j＝7.2hz,2h)；2.98-2.93(m,2h)；2.34(t,j＝7.2hz,2h)；1.64-1.57(m,6h)；1.37-1.29(m,2h)；0.88(t,j＝7.8hz,3h)。
實(shí)施例5：氟樂靈半抗原化合物5c的合成方法如下：
(1)4-溴巴豆酸乙酯(965mg，5mmol)溶于15ml乙酸乙酯，將反應(yīng)器置于冰-甲醇(預(yù)先冷凍)中降溫至-15℃，用注射器緩慢加入正丙胺(885mg，15mmol)，常溫?cái)嚢?-5小時(shí)。用80ml乙酸乙酯萃取，30ml水洗，10ml飽和氯化鈉溶液洗滌，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥。低于30℃旋干，獲得含酯基的仲胺中間體5a，稱重為874mg。
(2)5a(256.5mg，1.5mmol)溶于5ml四氫呋喃中，加入3，5-二硝基-4-氯-三氟甲苯(270mg，1mmol)、三乙胺(101mg，1mmol)，室溫?cái)嚢柽^夜。用層析液為正己烷：乙酸乙酯＝10：1進(jìn)行跟蹤，反應(yīng)完全后加入70ml水進(jìn)行稀釋，加1m鹽酸調(diào)ph至2-3，沉淀物出現(xiàn)。用乙酸乙酯萃取兩次，每次乙酸乙酯用量為70ml，沉淀溶解，用20ml飽和食鹽水進(jìn)行洗滌，有機(jī)相合并，用無水硫酸鈉干燥。40℃旋干，用正己烷:乙酸乙酯＝40:1、20:1、10:1的層析液比例進(jìn)行柱層析分離，40℃旋干，獲得中間體5b，稱重276.6mg，收率為68.29％。
(3)5b(352mg，0.87mmol)加入10ml四氫呋喃、13ml37％鹽酸于50℃油浴鍋攪拌過夜，用層析液為正己烷：乙酸乙酯：乙酸＝2:1:0.01進(jìn)行跟蹤，反應(yīng)完全后加入120ml水進(jìn)行稀釋，加1m鹽酸調(diào)ph至2-3，沉淀物出現(xiàn)。用120ml*2乙酸乙酯萃取，沉淀溶解，用40ml飽和食鹽水進(jìn)行洗滌，有機(jī)相合并，用無水硫酸鈉干燥。40℃旋干，用層析液為石油醚:乙酸乙酯:乙酸＝10:1:0.05、10:2:0.05、10:4:0.05的順序進(jìn)行柱層析分離，旋干，稱重122.9mg，收率為76.9％。esi-msanalysis(negative)m/z378.2[m+h]—；1hnmr(600mhz,cdcl3)δ8.10(s,2h)；7.12–6.72(m,1h)；6.03(d,j＝15.7hz,1h)；3.02–2.90(m,2h)；2.17(s,2h)；1.66–1.48(m,2h)；0.86(dd,j＝15.9,8.5hz,3h)。
實(shí)施例6：氟樂靈半抗原化合物6c的合成方法如下：
(1)4-溴甲基苯甲酸甲酯(916.28mg，4mmol)溶于12ml乙酸乙酯，將反應(yīng)器至于冰-甲醇中降溫至-15℃，用注射器緩慢加入正丙胺(591.1mg，10mmol)反應(yīng)4-5小時(shí)。用90ml乙酸乙酯萃取，30ml水洗，10ml飽和氯化鈉溶液洗滌，有機(jī)相合并，無水硫酸鈉干燥。低于30℃旋干，獲得含酯基的仲胺中間體6a，稱重725mg，收率為87.5％。
(2)6a(310.77mg，1.5mmol)溶于6ml四氫呋喃中，加入3，5-二硝基-4-氯-三氟甲苯(270mg，1mmol)、三乙胺(101mg，1mmol)，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)液加入80ml水進(jìn)行稀釋，加1m鹽酸調(diào)ph至2-3，沉淀物出現(xiàn)。用乙酸乙酯萃取兩次，每次乙酸乙酯用量為80ml，沉淀溶解，用30ml飽和食鹽水進(jìn)行洗滌，有機(jī)相合并，用無水硫酸鈉干燥。40℃旋干，用層析液為正己烷：乙酸乙酯＝40:1、20:1、10:1的順序進(jìn)行柱層析分離，旋干獲得6b，稱重為338.9mg，收率為76.9％。
(3)6b(150mg，0.34mmol)溶于7.5ml四氫呋喃、6.8ml1mol/l氫氧化鈉溶液，室溫?cái)嚢柽^夜，用層析液為正己烷：乙酸乙酯：乙酸＝2:1:0.01進(jìn)行跟蹤，反應(yīng)完成，進(jìn)行酸堿倒，酸萃有機(jī)相合并，40℃旋干，獲得粗產(chǎn)物118.8mg，進(jìn)行薄層層析分離，獲得目標(biāo)物6c，稱重105.8mg，收率為86％。esi-msanalysis(negative)m/z428.4[m+h]—；1hnmr(600mhzcdcl3)δ8.08(s,2h)；8.06(d,j＝8.4hz,2h)；4.28(s,2h)；2.93–2.88(m,2h)；0.87(d,j＝7.1hz,2h)；0.82(d,j＝7.2hz,3h)。
以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制，但凡采用等同替換或等效變換的形式所獲得的技術(shù)方案，均應(yīng)落在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。