本發(fā)明屬于醫(yī)藥材料生物工程領(lǐng)域，更具體地，涉及一種撞擊流輔助提取膠原蛋白的方法。

背景技術(shù)：

膠原蛋白是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多的纖維狀、大分子蛋白質(zhì)，占體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25％～30％，主要分布在哺乳動(dòng)物的結(jié)締組織中，對(duì)動(dòng)物和人體軟骨、皮膚和肌腱的形成都十分重要。典型的膠原分子是長(zhǎng)且堅(jiān)韌的三螺旋結(jié)構(gòu)。目前已發(fā)現(xiàn)有27種不同類(lèi)型的膠原，按照被發(fā)現(xiàn)的先后順序分別稱(chēng)為I型膠原、II型膠原、III型膠原等，用大寫(xiě)的羅馬數(shù)字來(lái)進(jìn)行命名。

膠原蛋白具有諸多優(yōu)異的生物學(xué)性質(zhì)：膠原分子結(jié)構(gòu)中的重復(fù)性單元大，免疫原性非常低，對(duì)機(jī)體無(wú)排異反應(yīng)；具有較高的生物相容性，一般生物機(jī)體不會(huì)對(duì)其產(chǎn)生慢性的排斥現(xiàn)象；具有非常高的生物活性、細(xì)胞適應(yīng)性和促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用；具有生物降解性能，在體內(nèi)膠原酶的作用下逐漸降解成低分子寡肽或氨基酸，被機(jī)體吸收或排出體外。因此膠原蛋白被廣泛應(yīng)用于制備止血敷料、人工皮膚、血管、神經(jīng)、軟骨、粘膜組織以及骨組織等領(lǐng)域的研究中，是一種應(yīng)用前景非常大的醫(yī)學(xué)生物高分子材料。

I型膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)含量最多的一類(lèi)膠原，是脊椎動(dòng)物結(jié)締組織中最重要和最常見(jiàn)的膠原類(lèi)型。I型膠原蛋白目前在組織工程中大量使用，使得從動(dòng)物組織中提取型膠原蛋白成為了近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。目前，用于提取膠原蛋白纖維的方法主要有酸提取法(中國(guó)專(zhuān)利，申請(qǐng)?zhí)朇N201510640370.6、CN200510047408.5)、酶提取法(中國(guó)專(zhuān)利，申請(qǐng)?zhí)朇N201410050681.2、CN201410050678.0)、超聲波輔助提取法(中國(guó)專(zhuān)利，申請(qǐng)?zhí)朇N201180063095.6、CN200810229068.1)等，這些方法提取出來(lái)的膠原蛋白或者生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，或者容易破壞膠原蛋白的天然三螺旋結(jié)構(gòu)導(dǎo)致提取的膠原蛋白純度比較低，而且某些提取方法還會(huì)出現(xiàn)端粒殘留的現(xiàn)象，導(dǎo)致免疫原性問(wèn)題，并且生物相容性較低，大大限制了其在醫(yī)學(xué)生物領(lǐng)域的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種提取膠原蛋白的方法，其目的在于通過(guò)將酸提取與酶提取結(jié)合起來(lái)，并借助于撞擊流輔助提取這一技術(shù)提取膠原蛋白，由此解決現(xiàn)有技術(shù)膠原蛋白提取方法生產(chǎn)周期長(zhǎng)、提取得到的膠原蛋白純度和生物活性低的技術(shù)問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種撞擊流輔助提取膠原蛋白的方法，包括以下步驟：

(1)堿處理牛跟腱：將牛跟腱除去筋膜和脂肪，切成塊狀，加入氫氧化鈉水溶液浸泡6～12小時(shí)，過(guò)濾，并用水洗滌牛跟腱至中性，得到預(yù)處理后的牛跟腱；

(2)撞擊流輔助提取膠原蛋白：將步驟(1)得到的預(yù)處理后的牛跟腱置于撞擊流裝置中，加入乙酸溶液和胃蛋白酶，得到所述牛跟腱、乙酸和胃蛋白酶的混合液，通過(guò)所述撞擊流裝置使混合液同軸相向撞擊，通過(guò)撞擊輔助提取,獲得提取液；

(3)膠原蛋白提取物的分離：將步驟(2)得到的提取液固液分離，保留上層清液，調(diào)節(jié)所述清液的pH值至中性，加入NaCl使膠原蛋白鹽析，收集沉淀物，洗滌、干燥獲得膠原蛋白提取物。

優(yōu)選地，步驟(1)所述切成塊狀的具體方法為：先沿所述牛跟腱的纖維方向切成厚度為1毫米的薄片，再切成1mm×1mm的塊狀。

優(yōu)選地，步驟(1)所述氫氧化鈉水溶液的濃度為0.1mol/L～2.0mol/L；步驟(1)所述牛跟腱與所述氫氧化鈉的質(zhì)量比為2:1～15:1。

優(yōu)選地，步驟(1)所述氫氧化鈉水溶液的濃度為0.2mol/L。

優(yōu)選地，步驟(2)所述乙酸溶液中乙酸的濃度為0.5～2mol/L；所述預(yù)處理后的牛跟腱與乙酸的質(zhì)量比為1:0.75～1:4。

優(yōu)選地，步驟(2)所述乙酸的濃度為1mol/L。

優(yōu)選地，步驟(2)所述胃蛋白酶的質(zhì)量與所述預(yù)處理后的牛跟腱的質(zhì)量比為1:5～1:20。

優(yōu)選地，步驟(2)所述胃蛋白酶的質(zhì)量與所述預(yù)處理后的牛跟腱的質(zhì)量比為1:10。

優(yōu)選地，步驟(2)所述撞擊流裝置為雙噴頭噴射撞擊反應(yīng)器，所述撞擊反應(yīng)器的噴嘴噴出的液體為環(huán)狀液膜相。

優(yōu)選地，步驟(2)所述撞擊流裝置的射流口直徑為0.1～5mm，所述噴嘴噴出液體的流速為0.5～20m/s。

優(yōu)選地，步驟(2)所述撞擊流裝置的射流口直徑為0.2～3mm。

優(yōu)選地，步驟(2)所述噴嘴噴出液體的流速為1～10m/s。

優(yōu)選地，步驟(2)所述撞擊輔助提取的溫度控制在0～32℃，時(shí)間控制在2～8h。

優(yōu)選地，步驟(3)所述加入NaCl使膠原蛋白鹽析，其中NaCl的濃度控制在1～5mol/L。

優(yōu)選地，步驟(3)所述干燥為冷凍干燥。

撞擊流最早是由蘇聯(lián)科學(xué)家Elperin在1961年提出。最初的構(gòu)想，是使兩股等量氣體充分加速固體顆粒后形成的氣-固兩相流同軸高速相向流動(dòng)并在兩加速管的中間即撞擊面上互相撞擊。兩股高速兩相流撞擊的結(jié)果，形成了一個(gè)高度湍動(dòng)、顆粒濃度最高的撞擊區(qū)，為強(qiáng)化熱、質(zhì)傳遞提供了極好的條件。本發(fā)明所使用的撞擊流是其最初構(gòu)想的一個(gè)延伸應(yīng)用，稱(chēng)之為液體連續(xù)相撞擊流。其原理為溶液通過(guò)反應(yīng)器內(nèi)部構(gòu)件的導(dǎo)流作用產(chǎn)生相向撞擊，在中間區(qū)域產(chǎn)生一個(gè)環(huán)狀液相膜，由于安裝在同一個(gè)軸上面的上、下兩個(gè)導(dǎo)流筒內(nèi)螺旋槳的方向相反，在環(huán)狀液相膜撞擊面提供各方向強(qiáng)勁的撕扯力，其力度隨射流口直徑的減小和流速的增大而增強(qiáng)，能夠加速膠原分子從穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)解螺旋為單螺旋結(jié)構(gòu)，從而加速膠原提取過(guò)程。目前，尚未見(jiàn)使用撞擊流輔助提取膠原蛋白方法的報(bào)道。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是在保證較高的提取產(chǎn)率、純度的基礎(chǔ)上縮短膠原蛋白的提取周期。該方法是在酸性條件下使用胃蛋白酶提取這一現(xiàn)有的技術(shù)之上，創(chuàng)造性的加入了撞擊流輔助這一方法，能明顯縮短提取周期并獲得較高純度的膠原蛋白產(chǎn)品。由于膠原蛋白的特性，本領(lǐng)域的技術(shù)人員一直在探索各種方法加速其解螺旋過(guò)程來(lái)提高提取效率和產(chǎn)率，如傳統(tǒng)的機(jī)械攪拌和超聲波輔助提取，但傳統(tǒng)的機(jī)械攪拌方法不能提供各向異性力，所需要的提取時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)；超聲波輔助提取法因局部超聲場(chǎng)強(qiáng)過(guò)大，容易打斷膠原分子鏈引起降解，從而使其純度降低并降低膠原蛋白的生物活性。而本發(fā)明提出來(lái)的撞擊流輔助提取方法可以說(shuō)是傳統(tǒng)的機(jī)械攪拌的升級(jí)版，能夠提供各向異性且更加強(qiáng)勁的機(jī)械力以加速膠原分子從穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)解螺旋為單螺旋結(jié)構(gòu)，而且其機(jī)械力度不足以打斷膠原分子鏈，不會(huì)引起膠原分子的降解。因此本發(fā)明所提出來(lái)的撞擊流輔助提取方法能夠兼顧機(jī)械攪拌和超聲波輔助提取的優(yōu)點(diǎn)并摒棄其缺點(diǎn)。

總體而言，通過(guò)本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠取得下列有益效果。

(1)本發(fā)明在酸性水溶液體系中、在胃蛋白酶和撞擊流輔助外力的作用下提取膠原蛋白，工藝流程簡(jiǎn)單，提高了膠原蛋白的提取率，縮短了生產(chǎn)周期，并保持了膠原蛋白的生物活性。

(2)本發(fā)明利用撞擊流反應(yīng)器在環(huán)狀液相膜撞擊面提供各方向強(qiáng)勁的撕扯力，加速膠原分子從穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)解螺旋為單螺旋結(jié)構(gòu)，從而加速膠原蛋白的提取過(guò)程。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中提取的大分子膠原蛋白SDS-PAGE電泳圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，結(jié)合以下實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個(gè)實(shí)施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。

本發(fā)明提供的撞擊流輔助提取膠原蛋白的方法，包括以下步驟：

(1)用堿處理牛跟腱：將牛跟腱除去筋膜、脂肪等雜物，洗凈，沿牛跟腱的纖維方向切成厚度為1毫米的薄片，再切成1mm×1mm的小塊，加入氫氧化鈉水溶液浸泡6～12小時(shí)，過(guò)濾，并用水洗滌牛跟腱至中性，得到預(yù)處理后的牛跟腱；其中氫氧化鈉水溶液的濃度為0.1mol/L～2.0mol/L，優(yōu)選為0.2mol/L；牛跟腱與氫氧化鈉的質(zhì)量比為2:1～15:1。

(2)撞擊流輔助提取膠原蛋白：將步驟(1)得到的預(yù)處理后的牛跟腱置于撞擊流裝置中，加入乙酸溶液和胃蛋白酶，得到牛跟腱、乙酸和胃蛋白酶的混合液，然后使混合液通過(guò)雙噴頭噴射撞擊反應(yīng)器的噴嘴高速?lài)姵霏h(huán)狀液膜相，在0～32℃同軸相向撞擊2～8h，優(yōu)選為4h，通過(guò)撞擊輔助提取獲得提取液；其中，撞擊流反應(yīng)器的射流口直徑為0.1～5mm，優(yōu)選0.2～3mm，噴嘴噴出液體的流速為0.5～20m/s，優(yōu)選為1～10m/s。

其中乙酸的濃度為0.5～2mol/L，優(yōu)選為1mol/L，所述預(yù)處理后的牛跟腱與乙酸的質(zhì)量比為1:0.75～1:4；胃蛋白酶的質(zhì)量與所述預(yù)處理后的牛跟腱的質(zhì)量比為1:5～1:20，優(yōu)選為1:10。

(3)膠原蛋白提取物的分離：將步驟(2)得到的提取液固液分離，除掉沉淀物，保留上層清液，調(diào)節(jié)清液的pH值至中性，加入NaCl，使體系中NaCl的濃度控制在1～5mol/L，優(yōu)選為3mol/L，使膠原蛋白鹽析，靜置12～24h以后，過(guò)濾收集沉淀物，洗滌、冷凍干燥獲得膠原蛋白提取物。

以下為實(shí)施例：

實(shí)施例1

將500g牛跟腱去除筋膜、脂肪等雜物，洗凈，切成1mm×1mm的小塊，加入5000毫升濃度為0.2mol/L的NaOH溶液，浸泡7h，過(guò)濾并用水洗滌至中性；取20g處理后的牛跟腱，加入500毫升濃度為0.5mol/L的乙酸和2g胃蛋白酶，然后通過(guò)射流口直徑為0.1mm、流速為20m/s的雙噴頭撞擊流裝置噴出環(huán)狀液膜相，使體系發(fā)生撞擊，反應(yīng)體系的溫度控制在4℃，撞擊反應(yīng)時(shí)間控制在2.5h，獲得提取液，過(guò)濾，保留上層清液，調(diào)節(jié)其pH值至中性，然后加入NaCl，使NaCl的濃度為1.5mol/L，靜置12h后，將其過(guò)濾收集沉淀物；將收集的沉淀物洗滌并凍干，即得到膠原蛋白提取物。

實(shí)施例2

取100g實(shí)施例1中經(jīng)過(guò)堿處理后的牛跟腱，加入3000毫升濃度為1.0mol/L的乙酸和20g胃蛋白酶，然后通過(guò)射流口直徑為3mm、流速為10m/s的雙噴頭撞擊流裝置噴出環(huán)狀液膜相，使體系發(fā)生撞擊，反應(yīng)體系的溫度控制在15℃，撞擊反應(yīng)時(shí)間控制在5h，獲得提取液，過(guò)濾，保留上層清液，調(diào)節(jié)其pH值至中性，然后加入NaCl，使NaCl的濃度為3mol/L，靜置16h后，將其過(guò)濾收集沉淀物；將收集的沉淀物洗滌并凍干，即得到膠原蛋白提取物。

實(shí)施例3

取200g實(shí)施例1中經(jīng)過(guò)堿處理后的牛跟腱，加入8000毫升濃度為1.5mol/L的乙酸和10g胃蛋白酶，然后通過(guò)射流口直徑為5mm、流速為0.5m/s的雙噴頭撞擊流裝置噴出環(huán)狀液膜相，使體系發(fā)生撞擊，反應(yīng)體系的溫度控制在30℃，撞擊反應(yīng)時(shí)間控制在8h，獲得提取液，過(guò)濾，保留上層清液，調(diào)節(jié)其pH值至中性，然后加入NaCl，使NaCl的濃度為5mol/L，靜置24h后，將其過(guò)濾收集沉淀物；將收集的沉淀物洗滌并凍干，即得到膠原蛋白提取物。

實(shí)施例4

將500g牛跟腱去除筋膜、脂肪等雜物，洗凈，切成1mm×1mm的小塊，加入15000毫升濃度為0.2mol/L的NaOH溶液，浸泡7h，過(guò)濾并用水洗滌至中性；取20g處理后的牛跟腱，加入500毫升濃度為0.5mol/L的乙酸和2g胃蛋白酶，然后通過(guò)射流口直徑為0.1mm、流速為20m/s的雙噴頭撞擊流裝置噴出環(huán)狀液膜相，使體系發(fā)生撞擊，反應(yīng)體系的溫度控制在4℃，撞擊反應(yīng)時(shí)間控制在2.5h，獲得提取液，過(guò)濾，保留上層清液，調(diào)節(jié)其pH值至中性，然后加入NaCl，使NaCl的濃度為1.5mol/L，靜置12h后，將其過(guò)濾收集沉淀物；將收集的沉淀物洗滌并凍干，即得到膠原蛋白提取物。

實(shí)施例5

取100g實(shí)施例4中經(jīng)過(guò)堿處理后的牛跟腱，加入3000毫升濃度為1.0mol/L的乙酸和20g胃蛋白酶，然后通過(guò)射流口直徑為3mm、流速為10m/s的雙噴頭撞擊流裝置噴出環(huán)狀液膜相，使體系發(fā)生撞擊，反應(yīng)體系的溫度控制在15℃，撞擊反應(yīng)時(shí)間控制在5h，獲得提取液，過(guò)濾，保留上層清液，調(diào)節(jié)其pH值至中性，然后加入NaCl，使NaCl的濃度為3mol/L，靜置16h后，將其過(guò)濾收集沉淀物；將收集的沉淀物洗滌并凍干，即得到膠原蛋白提取物。

實(shí)施例6

取200g實(shí)施例4中經(jīng)過(guò)堿處理后的牛跟腱，加入8000毫升濃度為1.5mol/L的乙酸和10g胃蛋白酶，然后通過(guò)射流口直徑為5mm、流速為0.5m/s的雙噴頭撞擊流裝置噴出環(huán)狀液膜相，使體系發(fā)生撞擊，反應(yīng)體系的溫度控制在30℃，撞擊反應(yīng)時(shí)間控制在8h，獲得提取液，過(guò)濾，保留上層清液，調(diào)節(jié)其pH值至中性，然后加入NaCl，使NaCl的濃度為5mol/L，靜置24h后，將其過(guò)濾收集沉淀物；將收集的沉淀物洗滌并凍干，即得到膠原蛋白提取物。

實(shí)施例7

將500g牛跟腱去除筋膜、脂肪等雜物，洗凈，切成1mm×1mm的小塊，加入25000毫升濃度為0.2mol/L的NaOH溶液，浸泡7h，過(guò)濾并用水洗滌至中性；取20g處理后的牛跟腱，加入500毫升濃度為0.5mol/L的乙酸和2g胃蛋白酶，然后通過(guò)射流口直徑為0.1mm、流速為20m/s的雙噴頭撞擊流裝置噴出環(huán)狀液膜相，使體系發(fā)生撞擊，反應(yīng)體系的溫度控制在4℃，撞擊反應(yīng)時(shí)間控制在2.5h，獲得提取液，過(guò)濾，保留上層清液，調(diào)節(jié)其pH值至中性，然后加入NaCl，使NaCl的濃度為1.5mol/L，靜置12h后，將其過(guò)濾收集沉淀物；將收集的沉淀物洗滌并凍干，即得到膠原蛋白提取物。

實(shí)施例8

取100g實(shí)施例7中經(jīng)過(guò)堿處理后的牛跟腱，加入3000毫升濃度為1.0mol/L的乙酸和20g胃蛋白酶，然后通過(guò)射流口直徑為3mm、流速為10m/s的雙噴頭撞擊流裝置噴出環(huán)狀液膜相，使體系發(fā)生撞擊，反應(yīng)體系的溫度控制在15℃，撞擊反應(yīng)時(shí)間控制在5h，獲得提取液，過(guò)濾，保留上層清液，調(diào)節(jié)其pH值至中性，然后加入NaCl，使NaCl的濃度為3mol/L，靜置16h后，將其過(guò)濾收集沉淀物；將收集的沉淀物洗滌并凍干，即得到膠原蛋白提取物。

實(shí)施例9

取200g實(shí)施例7中經(jīng)過(guò)堿處理后的牛跟腱，加入8000毫升濃度為1.5mol/L的乙酸和10g胃蛋白酶，然后通過(guò)射流口直徑為5mm、流速為0.5m/s的雙噴頭撞擊流裝置噴出環(huán)狀液膜相，使體系發(fā)生撞擊，反應(yīng)體系的溫度控制在30℃，撞擊反應(yīng)時(shí)間控制在8h，獲得提取液，過(guò)濾，保留上層清液，調(diào)節(jié)其pH值至中性，然后加入NaCl，使NaCl的濃度為5mol/L，靜置24h后，將其過(guò)濾收集沉淀物；將收集的沉淀物洗滌并凍干，即得到膠原蛋白提取物。

實(shí)施例10

將500g牛跟腱去除筋膜、脂肪等雜物，洗凈，切成1mm×1mm的小塊，加入20000毫升濃度為1mol/L的NaOH溶液，浸泡5h，過(guò)濾并用水洗滌至中性；取300g處理后的牛跟腱，加入10000毫升濃度為2mol/L的乙酸和30g胃蛋白酶，然后通過(guò)射流口直徑為2.5mm、流速為15m/s的雙噴頭撞擊流裝置噴出環(huán)狀液膜相，使體系發(fā)生撞擊，反應(yīng)體系的溫度控制在20℃，撞擊反應(yīng)時(shí)間控制在6h，獲得提取液，過(guò)濾，保留上層清液，調(diào)節(jié)其pH值至中性，然后加入NaCl，使NaCl的濃度為3mol/L，靜置24h后，將其過(guò)濾收集沉淀物；將收集的沉淀物洗滌并凍干，即得到膠原蛋白提取物。

本發(fā)明實(shí)施例1-10反應(yīng)條件以及膠原蛋白的得率見(jiàn)表1，膠原蛋白的提取率最高可達(dá)13.2～15.3％，其中各實(shí)施例中膠原蛋白得率的計(jì)算公式為：膠原蛋白提取物的質(zhì)量/未經(jīng)預(yù)處理的牛跟腱的質(zhì)量*100％。

表1實(shí)施例1-10反應(yīng)條件以及膠原蛋白的得率

本發(fā)明膠原蛋白的提取時(shí)間為2.5～8小時(shí)，而傳統(tǒng)的機(jī)械攪拌提取時(shí)間通常為12～72小時(shí)，超聲波提取時(shí)間雖然比較短，但是使用該方法提取的膠原純度較低，如圖1的SDS-PAGE膠圖中使用超生輔助提取的某公司樣品，含有較多的雜帶；同時(shí)由圖1也可以看出實(shí)施例中提取的膠原蛋白純度較高，因此本專(zhuān)利所述方法可以在保證膠原蛋白純度較高的條件下大大縮短膠原蛋白的生產(chǎn)周期。另外，經(jīng)分析，實(shí)施例1-10提取得到的膠原蛋白的主要分子量約為【10KDa】，而初始牛跟腱中膠原蛋白的分子量為【30KDa】，由此說(shuō)明，本發(fā)明的撞擊流輔助提取技術(shù)將膠原分子從穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)解螺旋為單螺旋結(jié)構(gòu)，而且其機(jī)械力度不足以打斷膠原分子鏈，不會(huì)引起膠原分子的降解。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。