本發(fā)明屬于化學(xué)合成領(lǐng)域，更具體的涉及一種25-O-葡萄糖基環(huán)黃芪醇的制備方法。

背景技術(shù)：

黃芪為補(bǔ)藥之首，屬于豆科黃芪屬植物。近年來隨著現(xiàn)代分離和鑒定技術(shù)的發(fā)展，從黃芪中分離出了大量三萜皂苷、黃酮類化合物以及多糖類成分。后期的生物生化實(shí)驗(yàn)表明黃芪的藥用功效主要通過黃芪皂苷表現(xiàn)出來。近期研究表明，黃芪皂苷在免疫調(diào)節(jié)，降糖，改善胰島素抵抗活性，抗腫瘤，對心血管系統(tǒng)調(diào)節(jié)以及抗病毒，抗氧化活性等方面都表現(xiàn)出了極為可喜的藥用前景。

盡管黃芪皂苷廣泛的應(yīng)用前景促使人們對其研究不斷深入，但目前用于活性測試的黃芪皂苷多為從黃芪中分離提取所得，由于黃芪中所含皂苷種類繁多，且結(jié)構(gòu)類似，這給分離提純帶來很大困難。還有一些黃芪皂苷為次生皂苷，在黃芪中的含量很低，要得到足夠量以供活性測試之用更是不易，這已成為制約黃芪皂苷活性研究深入的瓶頸，到目前為止幾乎沒有關(guān)于黃芪皂苷的化學(xué)合成研究報(bào)道。

化合物I(見式I)為25-O-葡萄糖基環(huán)黃芪醇，是一種黃芪皂苷。有文獻(xiàn)報(bào)道，雖然目前尚未從天然來源中分離出化合物I但在黃岑甲苷的微生物代謝物中可分離出化合物I，由此可推斷，化合物I存在于黃岑中，僅是因?yàn)楹窟^低，目前的研究手段無法通過分離得到。

化合物I的皂甙部分為環(huán)黃芪醇，由于環(huán)黃芪醇(化合物1)的3位，6位，16位及25位含有4個(gè)惰性O(shè)H，4個(gè)惰性O(shè)H相互之間的反應(yīng)活性難以區(qū)分，選擇性的糖苷化其中部分羥基非常困難。同時(shí)，25位羥基為叔羥基，活性低，糖苷化反應(yīng)本身就很困難。

環(huán)黃芪醇的羥基保護(hù)反應(yīng)進(jìn)行困難且產(chǎn)物復(fù)雜多變，有文獻(xiàn)報(bào)道，在過量乙?；噭┳饔孟拢?0℃，長達(dá)50天的反應(yīng)時(shí)間下，僅能得到56％收率的全乙?；沫h(huán)黃芪醇。縮短反應(yīng)時(shí)間或降低反應(yīng)溫度導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物十分復(fù)雜，為4個(gè)羥基中隨機(jī)的1或2個(gè)羥基被保護(hù)的環(huán)黃芪醇。

文獻(xiàn)中常用的對大位阻、惰性的羥基保護(hù)的方法在環(huán)黃芪醇保護(hù)中也不起作用，例如路易斯酸催化的乙酰化反應(yīng)得不到選擇性保護(hù)的環(huán)黃芪醇。

因此黃芪皂苷合成國內(nèi)外至今未見成功的報(bào)道，25-O-葡萄糖基環(huán)黃芪醇的合成也未見報(bào)道。人工合成25-O-葡萄糖基環(huán)黃芪醇，以獲得足夠量的該化合物，有助于進(jìn)一步推進(jìn)對其生物活性，藥理活性的研究，有很高的學(xué)術(shù)及社會經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：開發(fā)一種合成25-O-葡萄糖基環(huán)黃芪醇的方法，以獲得足夠量的該化合物，進(jìn)一步推進(jìn)對其生物活性，藥理活性的研究。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

一種合成25-O-葡萄糖基環(huán)黃芪醇的方法，包括以下步驟：

(1)環(huán)黃芪醇的選擇性羥基保護(hù)：0℃以下，將環(huán)黃芪醇和PPy溶于第一溶劑中，再加入酸酐和DIPEA，將反應(yīng)溫度緩慢升至室溫后再加熱到100～120℃，繼續(xù)反應(yīng)直到TLC跟蹤顯示環(huán)黃芪醇反應(yīng)完全，得到化合物2；

(2)糖苷化反應(yīng)：室溫下，將步驟(1)中得到的化合物2和糖基給體化合物3溶于第二溶劑中，加入干燥劑，攪拌后，加入催化劑，繼續(xù)在室溫下反應(yīng)直到TLC跟蹤顯示化合物2反應(yīng)完全，得到化合物4；

(3)最終脫保護(hù)反應(yīng)：將步驟(2)中得到的化合物4的所有保護(hù)基脫除即可；

其中R¹選自取代或非取代的C₂-C₆烷?；籖²選自取代或非取代C₁-C₆芳?；?；X選自取代或非取代的炔苯甲酰氧基。

優(yōu)選的，所述R¹選自乙酰基、丙?；?、丁?；?、異丙?；?；R²選自苯甲?；谆郊柞；?、鄰甲基苯甲酰基；X任選自以下基團(tuán)之一：

最優(yōu)選的，R¹為乙?；琑²為苯甲?；琗為

步驟(1)中，所述酸酐選自取代或非取代的C₂-C₆脂肪酸的酸酐，優(yōu)選為乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、異丙酸酐；最優(yōu)選為乙酸酐。

步驟(1)中，優(yōu)選的，反應(yīng)溫度為105～120℃。

步驟(1)中，所述化合物1、PPy、酸酐和DIPEA的摩爾比為1:1.5:8:12～1:2:15:20，優(yōu)選為1:2:10:15～1:2:15:20。

步驟(1)中，所述第一溶劑選自二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、1,2-二氯乙烷、DMF、甲苯、吡啶、四氫呋喃中的一種或多種，優(yōu)選為甲苯或1,2-二氯乙烷；所述化合物1在所述第一溶劑中的濃度為0.001～0.1mol/L，優(yōu)選為0.0185～0.037mol/L。

步驟(2)中，所述第二溶劑選自二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、DMF、甲苯、四氫呋喃、丙酮、DMSO或乙醚中的一種或多種，優(yōu)選為二氯甲烷；所述化合物2在第二溶劑中的濃度為0.001～1mol/L，優(yōu)選為0.01～0.05mol/L。

步驟(2)中，所述催化劑選自一價(jià)金的絡(luò)合物，優(yōu)選為PPh₃AuNTf₂或PPh₃AuOTf；所述干燥劑選自分子篩，優(yōu)選的為分子篩或酸洗的分子篩，更優(yōu)選的為4A分子篩，所述分子篩相對化合物2的加入量為100～300g/mol。

步驟(2)中，化合物2、糖基給體化合物3和所述催化劑的摩爾比為1:1:0.1～1:5:0.8，優(yōu)選為1:1:0.1～1:2.5:0.5。

所述保護(hù)基脫除的反應(yīng)包括以下步驟：將化合物4溶于第三溶劑中，再加入堿，室溫下反應(yīng)直到TLC跟蹤顯示化合物4反應(yīng)完全。

步驟(3)中，所述堿選自甲醇鈉、氫氧化鈉、碳酸鉀、氫氧化鉀；所述化合物4和所述堿的摩爾比為1:1～20，優(yōu)選為1:7～10。

所述第三溶劑選自DMF、二氧六環(huán)、吡啶、四氫呋喃、甲醇、乙醇、DMSO或乙醚中的一種或多種，優(yōu)選為甲醇；所述化合物4在第三溶劑中的濃度為0.001～1mol/L，優(yōu)選為0.001～0.0085mol/L。

步驟(1)～(3)中任一步，優(yōu)選的，在惰性氣體氣氛中反應(yīng)，所述惰性氣體選自氮?dú)?、氬氣或氦氣?/p>

優(yōu)選的，步驟(1～(3)中任一步，優(yōu)選的，使用的溶劑，使用前先干燥除水。

本發(fā)明中，R的上標(biāo)表示基團(tuán)的序號，下標(biāo)表示有幾個(gè)基團(tuán)，例如R¹₂表示兩個(gè)R¹基團(tuán)。

化合物I的皂甙部分為環(huán)黃芪醇，其3位，6位，16位及25位含有4個(gè)惰性O(shè)H，相互之間的反應(yīng)活性難以區(qū)分，本發(fā)明通過合理的保護(hù)基策略以及特殊的反應(yīng)條件，有效區(qū)分了25位OH和其他位置羥基的反應(yīng)活性，填補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)的空白。

皂苷的糖苷化反應(yīng)是本領(lǐng)域一大難題，收底物結(jié)構(gòu)，糖化反應(yīng)給受體的活性不同，不同結(jié)構(gòu)的甙元的糖苷化反應(yīng)結(jié)果差別巨大，反應(yīng)收率和反應(yīng)選擇性差別巨大，環(huán)黃芪醇25位OH為惰性羥基，通常情況下，難以反應(yīng)。本發(fā)明篩選出有效的糖基給體，高收率高選自性的實(shí)現(xiàn)環(huán)黃芪醇25位OH的糖苷化，填補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)的空白。

有益效果：本發(fā)明高效高立體選擇性高收率的制備了25-O-葡萄糖基環(huán)黃芪醇，填補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的空白，將大大推進(jìn)黃芪皂苷類化合物的活性機(jī)理研究及其藥物開發(fā)的進(jìn)程。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

本發(fā)明中PPy表示4-吡咯烷基吡啶(英文名：4-(1-pyrrolidino)-pyridine))，DIPEA表示N,N-二異丙基乙胺；以下每步反應(yīng)得到的產(chǎn)物純度較高，在400兆核磁共振氫譜中見不到雜質(zhì)峰。

Bz保護(hù)的葡萄糖化合物5按照本領(lǐng)域常規(guī)方法合成，參考文獻(xiàn)Chem.Sci.2013,4,3899-3905.，從化合物5合成化合物3。

化合物3的合成方法如下：

在氮?dú)獗Ｗo(hù)，將異頭位羥基裸露的全Bz葡萄糖(100mg,0.17mmol)溶于干燥的二氯甲烷(4mL)中，再向體系中加入鄰炔基苯甲酸(37.4mg,0.2mmol),DMAP(28.1mg,0.23mmol),EDCI(43.9mg,0.23mmol),DIPEA(74μL，0.45mmol)，室溫下攪拌過夜直到TLC跟蹤顯示原料反應(yīng)完全，將反應(yīng)體系用二氯甲烷萃取，并依次用1mol/l HCl、飽和碳酸氫鈉、飽和NaCl洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓濃縮粗產(chǎn)品，然后柱層析得到化合物3(121mg,93％，白色固體)：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.07(d,J＝7.5Hz,2H),7.92-7.87(m,6H),7.44-7.28(m,17H),6.94(d,J＝3.3Hz,1H),6.38(dd,J＝9.6,9.9Hz,1H),5.94(dd,J＝9.9,10.2Hz,1H),5.76(dd,J＝3.3,9.9Hz,1H),4.80-4.66(m,2H),4.54(dd,J＝3.3,6.0Hz,1H),1.56(m,1H),0.84(d,J＝6.6Hz,4H).

實(shí)施例1：環(huán)黃芪醇的選擇性羥基保護(hù)：得到化合物2；

在氮?dú)獗Ｗo(hù)，0℃條件下，環(huán)黃芪醇(180mg,0.37mmol)，PPy(108mg,0.74mmol)溶于干燥的甲苯(10mL)中，再向體系中加入乙酸酐(348μL,3.67mmol)，DIPEA(912μL,5.55mmol)，體系緩慢升至室溫然后在加熱到105℃，攪拌直到TLC跟蹤顯示原料反應(yīng)完全，將反應(yīng)體系用乙酸乙酯萃取，并依次用1mol/l HCl、飽和碳酸氫鈉、飽和NaCl洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓濃縮粗產(chǎn)品，然后柱層析得到白色固體化合物2(184mg,81.3％)：[α]_D²⁵＝73.5(c＝1,CHCl₃)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.44-5.39(m,1H),4.75(td,J＝4.4,9.2Hz,1H),4.60(dd,J＝4.4,11.2Hz,1H),3.72(dd,J＝6.8,8.4Hz,1H),2.50(d,J＝8.4Hz,1H),2.38(td,J＝5.2,11.6Hz,1H),2.17(dd,J＝8.0,13.6Hz,1H),2.05(s,3H),2.02(s,3H),1.99(s,3H),1.30(s,3H),1.29(s,3H),1.20(s,3H),1.09(s,3H),0.99(s,3H),0.98(s,3H),0.85(s,3H),0.61(d,J＝4.8Hz,1H),0.38(d,J＝4.8Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ170.8,170.6,170.4,85.6,81.9,79.5,75.6,70.9,70.2,57.1,49.7,46.2,46.1,45.3,45.0,40.1,36.5,32.9,32.5,31.4,29.7,29.2,28.4,27.8,27.7,26.6,26.0(2C),24.5,21.8,21.6,21.2,20.7,20.4,20.0,16.2；HRMS(ESI)calcd for C₃₆H₅₇O₈[M+H]⁺617.4048,found 617.4049.

實(shí)施例2：糖苷化反應(yīng)，得到化合物4；

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將化合物2(12mg,0.02mmol)和葡萄糖炔酯給體3(31mg,0.05mmol)溶于干燥的二氯甲烷(2mL)中，并加入4A分子篩(2mg)，在室溫下攪拌半個(gè)小時(shí)再加入催化劑Ph₃PAuNTf2(0.002mmol)，繼續(xù)在室溫下攪拌直到TLC跟蹤顯示原料反應(yīng)完全，減壓濃縮粗產(chǎn)品，然后柱層析得到白色固體化合物4(22mg,94.42％)：[α]_D²⁵＝72.6(c＝1,CHCl₃)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.00-7.95(m,4H),7.91(dd,J＝1.2,8.4Hz,2H),7.85(dd,J＝1.2,8.0Hz,2H),7.56-7.48(m,3H),7.44-7.33(m,7H),7.30-7.27(m,2H),5.92(t,J＝9.6Hz,1H),5.58(t,J＝10.0Hz,1H),5.50(dd,J＝8.0,10.0Hz,1H),5.29-5.26(m,1H),5.20(d,J＝8.0Hz,1H),4.74(td,J＝4.0,9.2Hz,1H),4.60-4.56(m,2H),4.47(dd,J＝6.8,12.0Hz,1H),4.16-4.11(m,1H),3.70(t,J＝7.2Hz,1H),2.41(d,J＝8.0Hz,1H),2.18(dd,J＝8.0,14.0Hz,1H),2.05(s,3H),2.00(s,3H),1.97(s,3H),1.30(s,3H),1.22(s,3H),1.16(s,3H),1.12(s,3H),0.98(s,3H),0.97(s,3H),0.86(s,3H),0.60(d,J＝4.8Hz,1H),0.38(d,J＝4.8Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ170.8,170.4,170.2,166.0,165.9,165.3,164.9,133.4,133.2,133.1,129.8(2C),129.7(2C),129.6,128.9(2C),128.4(2C),128.3,96.1,85.8,82.7,80.0,79.6,76.0,73.2,72.1,72.0,70.5,70.3,63.8,57.6,49.8,46.4,46.3,45.6,45.4,40.1,37.4,33.2,32.2,31.4,29.8,29.7,28.6,26.7,26.6(2C),25.9,23.2,22.2,21.8,21.5,21.2,20.6,20.4,20.1,16.3；HRMS(ESI)calcd for C₇₀H₈₂O₁₇Na[M+Na]⁺1217.5444,found 1217.5447.

實(shí)施例3：最終脫保護(hù)反應(yīng)：得到25-O-葡萄糖基環(huán)黃芪醇I；

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將化合物4(20mg,0.017mmol)溶于干燥的甲醇(2mL)中，再加入甲醇鈉(0.17mmol)，室溫下攪拌直到TLC跟蹤顯示原料反應(yīng)完全，先用酸性樹脂中和PH至中性偏酸性，抽濾，減壓濃縮粗產(chǎn)品，然后柱層析得到白色固體化合物25-O-葡萄糖基環(huán)黃芪醇I(9.2mg,84％)：[α]_D²⁵＝21.4(c＝1,CHCl₃)；¹H NMR(400MHz,C₅D₅N)δ5.10(d,J＝8.0Hz,1H),4.95-4.88(m,2H),4.47(dd,J＝2.8,11.6Hz,1H),4.34(dd,J＝4.8,11.6Hz,1H),4.25-4.16(m,2H),4.09(dd,J＝9.2,16.0Hz,1H),3.93-3.89(m,2H),3.83-3.77(td,J＝4.4,10.0Hz,1H),3.70(dd,J＝4.4,11.2Hz,1H),2.87-2.80(m,1H),2.47(d,J＝7.6Hz,1H),1.92(s,3H),1.68(s,3H),1.43(s,3H),1.38(s,6H),1.30(s,3H),0.96(s,3H),0.62(d,J＝4.8Hz,1H),0.34(d,J＝3.6Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,C₅D₅N)δ98.6,87.0,81.8,78.3,78.0,77.8,75.0,73.3,71.1,68.0,62.5,57.9,53.7,46.8,45.9,45.8,

44.9,42.2,38.5,34.8,33.2,32.5,31.2,30.7,29.6,29.2,27.6,26.0,25.7,25.4,22.8,21.4,20.6,19.9,15.9；HRMS(ESI)calcd for C₃₆H₆₁O₁₀[M+H]⁺653.4259,found 653.4260.

實(shí)施例4：環(huán)黃芪醇的選擇性羥基保護(hù)：得到化合物2；

在氮?dú)獗Ｗo(hù)，0℃條件下，環(huán)黃芪醇(180mg,0.37mmol)，PPy(108mg,0.74mmol)溶于干燥的甲苯(20mL)中，再向體系中加入乙酸酐(522μL,5.5mmol)，DIPEA(1216μL,7.4mmol)，體系緩慢升至室溫然后在加熱到120℃，攪拌直到TLC跟蹤顯示原料反應(yīng)完全，將反應(yīng)體系用乙酸乙酯萃取，并依次用1mol/l HCl、飽和碳酸氫鈉、飽和NaCl洗，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓濃縮粗產(chǎn)品，然后柱層析得到白色固體化合物2(181mg,80％)。

實(shí)施例5：糖苷化反應(yīng)，得到化合物4；

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將化合物2(12mg,0.02mmol)和葡萄糖炔酯給體3(12.4mg,0.02mmol)溶于干燥的二氯甲烷(0.4mL)中，并加入4A分子篩(6mg)，在室溫下攪拌半個(gè)小時(shí)再加入催化劑Ph₃PAuNTf2(0.01mmol)，繼續(xù)在室溫下攪拌直到TLC跟蹤顯示原料反應(yīng)完全，減壓濃縮粗產(chǎn)品，然后柱層析得到白色固體化合物4(20mg,85％).

實(shí)施例6：最終脫保護(hù)反應(yīng)：得到25-O-葡萄糖基環(huán)黃芪醇I；

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將化合物4(20mg,0.017mmol)溶于干燥的甲醇(17mL)中，再加入甲醇鈉(0.119mmol)，室溫下攪拌直到TLC跟蹤顯示原料反應(yīng)完全，先用酸性樹脂中和PH至中性偏酸性，抽濾，減壓濃縮粗產(chǎn)品，然后柱層析得到白色固體化合物25-O-葡萄糖基環(huán)黃芪醇I(8.8mg,80％)。.

對比例1：環(huán)黃芪醇的選擇性羥基保護(hù)，反應(yīng)步驟同實(shí)施例1，所不同的是化合物2的投料量為300mg，溶劑為為5ml，即化合物2的反應(yīng)濃度為0.122mol/L主要生成四個(gè)羥基都被乙酰基保護(hù)的化合物，說明濃度對反應(yīng)的影響很大。

對比例2：環(huán)黃芪醇的選擇性羥基保護(hù)，反應(yīng)步驟同實(shí)施例1，所不同的是向體系中加入的不是乙酸酐和DIPEA而是苯甲酰氯和吡啶，得到環(huán)黃芪醇的3、6位羥基被苯甲?；Ｗo(hù)的產(chǎn)物。

對比例3，環(huán)黃芪醇的選擇性羥基保護(hù)，反應(yīng)步驟同實(shí)施例1，以乙酸酐、TMSOTF、DCM作為反應(yīng)條件體系很亂，沒有明顯的主點(diǎn)。

對比例4：環(huán)黃芪醇的選擇性羥基保護(hù)，反應(yīng)步驟同實(shí)施例1，用乙酰氯、DBU、DCM作為反應(yīng)條件體系也較亂，沒有得到理想的產(chǎn)物。