本發(fā)明屬于生物化工技術領域，尤其涉及一種生產l-草銨膦的新工藝；具體地說，是一種利用兩種生物酶提高光學純l-草銨膦生產效率的新方法。

背景技術：

草銨膦，英文名為：phosphinothricin(簡稱ppt)，一般是指化合物2-氨基-4-[羥基(甲基)膦?；鵠-丁酸(ppo)或其與堿性化合物形成的鹽(如式(1)所示)。草銨膦是由赫斯特公司于80年代開發(fā)的(后歸屬于拜耳公司)廣譜觸殺型除草劑，屬于膦酸類除草劑，是谷氨酰胺合成抑制劑，在葉子內轉移，但不能轉移到別處，谷氨酰胺合成受抑制后，導致銨離子累積，葉綠體解體，從而使光合作用受抑制，最終導致植物死亡。

草銨膦有兩種光學異構體，分別為l-草銨膦(式2)和d-草銨膦(式3)。但只有l(wèi)型具有植物毒性，除草活性為外消旋混合物的2倍，且在土壤中易分解，對人類和動物的毒性較小，除草譜廣，對環(huán)境的破壞力小。

目前，市場上銷售的草銨膦一般都是外消旋混合物。如果草銨膦產品能以l-構型的純光學異構體形式使用，可使草銨膦的使用量降低50％，這對于提高原子經濟性、降低使用成本、減輕環(huán)境壓力都具有重要意義。

制備光學純l-草銨膦的方法主要有三種：不對稱合成法、手性拆分法以及生物酶催化法。

不對稱合成法也稱化學立體合成法，對于光學純l-草銨膦的制備，多見于實驗室研究中，如minowan等利用甘氨酸為起始原料合成l-草銨膦(hirayamam.asymmetricsynthesisof(+)-phosphinothricinandrelatedcompoundsbythemichaeladditionofglycineschiffbasestovinylcompounds[j].bulletinofthechemicalsocietyofjapan,1987,60:1761–1766.)，還有zeisshj等對l-草銨膦的不對稱合成做了很多嘗試(enantioselectivesynthesisofbothenantiomersofphosphinothricinviaasymmetrichydrogenationofα-acylamidoacrylates[j].journaloforg--anicchemistry,1991,56:1783–1788.)，(enantioselectivesynthesisofl-phosphinothricinfroml--methionineandl-glutamicacidvial-vinylglycine[j].tetrahedron,1992,48(38):8263–8270.)。由于不對稱合成法工藝步驟多、收率低，所用不對稱合成試劑大多比較昂貴，導致生產成本偏高，不利于大規(guī)模制備l-草銨膦。

手性拆分法是利用化學合成的外消旋dl-草銨膦或其衍生物，再加手性拆分試劑，進行d型和l型的分離，從而制得光學純的l-草銨膦。此工藝有兩大缺點，一是需要消耗手性拆分試劑，二是d-草銨膦需要重新消旋化再進行拆分，增加了工藝復雜度，降低了收率。

相比之下，生物酶催化法具有立體選擇性嚴格、反應條件溫和、收率高及產物易分離純化等優(yōu)點，是生產l-草銨膦的潛在方法。早在研究草銨膦在土壤微生物的體內代謝途徑時就已經發(fā)現(xiàn)，l-草銨膦在轉氨酶的作用下，發(fā)生轉氨作用被分解成一種α-酮酸-2-羰基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸(ppo)。轉氨作用是一個可逆反應，2-羰基-4-(羥基甲基膦酰基)丁酸(ppo)也可在轉氨酶的催化下通過逆反應生成l-草銨膦。正是利用轉氨酶的這個作用，l-草銨膦的生物催化生產可行性具有十分重要的產業(yè)化價值和顯著的社會效益。

國際上，schulza等人(stereospecificproductionoftheherbicidephosphinothricin(glufosinate)bytransamination:isolationandcharacterizationofaphosphinothricin-specifictransaminasefromescherichiacoli[j].appliedandenvironmentalmicrobiology,1990,56:1-6.)(美國專利us5221737)早在上世紀90年代就利用從e.colik-12中分離到的轉氨酶，以2-羰基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸為底物，l-谷氨酸作為氨基供體，利用轉氨作用生產l-草銨膦(圖1)。轉氨酶經固定化后安裝至生物反應器，反應器的產物最高濃度可達76.1g/l，最高產率為50g/(l·h)，l-草銨膦的ee值超過99.9％。但這個工藝有兩大缺陷，其一是原料ppo不能完全轉化為l-ppt，轉化率最高只有90％；其二是要使可逆反應向生成l-ppt的方向進行，需要4倍當量以上的l-谷氨酸作為氨基供體，過量的谷氨酸給分離帶來了很大的負擔。

解決這一問題的途徑之一就是利用l-天冬氨酸代替l-谷氨酸，l-天冬氨酸經轉氨作用后生成草酰乙酸，草酰乙酸在水溶液中不穩(wěn)定、易分解為丙酮酸，從而打破了轉氨反應的平衡。鑒于此，bartschk(美國專利us6335186b1)在上述單酶反應體系下，增加一個谷氨酸-草酰乙酸轉氨酶，組成雙轉氨酶偶聯(lián)反應體系(圖2)。然而，在偶聯(lián)反應中仍然需要使用谷氨酸，谷氨酸與酮戊二酸的在反應中形成平衡，其結構又與產品l-ppt極為類似，難以在分離純化中去除；此外還增加了兩種需要分離的雜質草酰乙酸和l-天冬氨酸，而且此工藝中ppo的轉化率也只有85％。

bartschk等隨后在中國申請的專利(中國專利cn1349561a)中又提出了一條新工藝(如圖3)，他們篩選得到了能夠特異性地轉化2-羰基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸的谷氨酸-草酰乙酸轉氨酶，直接利用l-天冬氨酸為氨基供體。但此工藝效率低下，當?shù)孜飌po的濃度為552mmol/l、在幾乎完全消耗大約700mmol/l的原料l-天冬氨酸的情況下，只生成251.9mmol/l的產物l-ppt，與此同時生成了大約234.5mmol/l的雜質丙氨酸。原料ppo反應轉化率只有52％。

楊立榮等在中國申請的專利(公開號cn105603015a)中又提出了一條新工藝(如圖4)，他們是以2-羰基-4-(羥基甲基膦酰基)丁酸(簡稱ppo)為原料，以l-丙氨酸或l-丙氨酸與堿性化合物所成的鹽為氨基供體，經過轉氨酶的轉氨基作用，生成l-ppt和副產物丙酮酸，實現(xiàn)ppo的100％轉化，但此工藝效率較低，耗時長，需消耗大量的丙氨酸。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有轉氨酶法生產l-ppt工藝存在的缺陷，提供了一種全新的利用轉氨酶和乙烯合成酶生產l-草銨膦的方法，該方法能夠將副產物α-酮戊二酸轉化為二氧化碳和乙烯，轉化率高達到100％。

本發(fā)明提供了一種利用轉氨酶和乙烯合成酶生產l-草銨膦的方法，以2-羰基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸或其鹽為原料，在谷氨酸或其鹽為氨基供體的條件下，經轉氨酶和乙烯合成酶催化反應，得到l-草銨膦。

以2-羰基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸(簡稱ppo)為原料，以l-谷氨酸或l-谷氨酸與堿性化合物所成的鹽為氨基供體，經過轉氨酶的轉氨基作用，生成l-ppt和副產物α-酮酸二酸，同時通過乙烯合成酶的催化將副產物α-酮酸二酸轉化為二氧化碳和乙烯。反應式如圖5所示。

作為優(yōu)選，所述轉氨酶和乙烯合成酶獨立地為離體酶、固定化酶或工程菌表達的酶。上述轉氨酶和乙烯合成酶均可以以離體酶、固定化酶或工程菌表達的酶的形式參與反應，且兩者的參與形式是相互獨立地；即轉氨酶和乙烯合成酶來源于微生物或其處理物，所述處理物為微生物進行機械破壞、超聲波處理、凍結融解處理、干燥處理、加壓或減壓處理、滲透壓處理、自身消化、表面活性劑處理或酶處理而得到的物質、或者通過上述處理所得到的含有轉氨酶酶活性或乙烯合成酶活性的固定化物，又或者所述微生物的固定化物。

所述轉氨酶可以來源于枯草桿菌、巨大芽孢桿菌、大腸桿菌、嗜熱桿菌或鏈霉菌；所述乙烯合成酶可以來源于丁香假單胞菌、青霉、粘球菌、銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌或肺炎克雷伯氏菌。

其中，作為優(yōu)選，所述轉氨酶來源于大腸桿菌；所述乙烯合成酶來源于丁香假單胞菌。

具體地，所述轉氨酶的轉氨酶genbank登錄號為cp012868.1；乙烯合成酶的genbank登錄號為d13182.1。

進一步地，本發(fā)明提供的一種利用轉氨酶和乙烯合成酶生產l-草銨膦的方法，具體步驟如下：

(1)向生物反應器中加入底物2-羰基-4-(羥基甲基膦酰基)丁酸，用堿調節(jié)ph；

(2)再依次加入l-谷氨酸、轉氨酶、乙烯合成酶、輔酶和輔助因子，進行反應，獲得l-草銨膦。

其中，所述堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、異丙胺或三乙胺。

作為優(yōu)選，反應體系中，所述轉氨酶和乙烯合成酶的活力比為0.8～1.2:1。

作為優(yōu)選，所述谷氨酸或其鹽與所述2-羰基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸或其鹽的用量比為0.8:1～4:1；進一步優(yōu)選，用量比為0.9:1～2:1。

作為優(yōu)選，以細胞干重計，所述工程菌的添加量為反應體系質量的1～15％；進一步優(yōu)選，所述細胞的添加量為反應體系質量的5～10％。

進一步地，反應體系中還包括輔助因子，所述輔助因子為l-精氨酸或其鹽和fe²⁺。所述fe²⁺為feso4或fecl2。

進一步地，反應體系中還包括輔酶，所述輔酶為維生素b6類型輔酶，即吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺或它們的衍生物；優(yōu)選，所述輔酶為磷酸吡哆醛。

所述反應的溫度為10～80℃；時間為8～32h。作為優(yōu)選，所述反應的溫度為15～60℃；更優(yōu)選，溫度為20～40℃。

作為優(yōu)選，控制反應的ph值為4～11；優(yōu)選，ph為5～10；更優(yōu)選，ph為6～9。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明以2-羰基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸或其鹽為底物，在谷氨酸或其鹽為氨基供體的條件下，經轉氨酶和乙烯合成酶共同催化，得到l-草銨膦，使得轉氨反應后的副產物α-酮酸二酸經乙烯合成酶催化全部轉化為二氧化碳和乙烯，在保證原料用量較少的情況下，顯著提高了原料轉化率，降低了原料成本。

(2)本發(fā)明方法以谷氨酸為氨基供體，反應過程基本完全被消耗，且副產物α-酮戊二酸也幾乎完全被轉化，分解產生的二氧化碳和乙烯均為氣體易于去除，因而反應結束后體系中僅剩下少量精氨酸以及乙烯合成酶催化的副反應生成的少量琥珀酸、胍、1-吡咯啉-5-羧酸(p5c)；這些雜質相對于其他氨基酸、α-酮酸雜質，與l-草銨膦的結構、性質等相差較大，易于分離，簡化了后續(xù)精制工藝，提高了產品總收率。

(3)本發(fā)明方法中谷氨酸或其鹽作為氨基供體，轉氨反應效率最高；乙烯合成酶的產物大部分為氣體，使得多酶反應過程較簡單，不會在反應體系中引入大量雜質而造成產物抑制。

附圖說明

圖1為以谷氨酸為氨基供體生產l-ppt的反應式。

圖2為雙轉氨酶體系生產l-ppt的反應式。

圖3為以天冬氨酸為氨基供體生產l-ppt的反應式。

圖4為以丙氨酸為氨基供體生產l-ppt的反應式。

圖5為本發(fā)明中以乙烯合成酶轉化α-酮戊二酸提高酶促轉氨反應生產l-ppt效率的反應式；

圖6為本發(fā)明涉及的反應物和產物(反應過程中)的高效液相檢測圖譜；

其中，1：保留時間2.5:l-arg；2：保留時間2.8:純化酶溶液中帶的雜質咪唑；3：保留時間3.1:谷氨酸；4：保留時間3.7:草銨膦；5：保留時間8.5:α-酮戊二酸；6：保留時間9.9:ppo；7：保留時間11.43:磷酸吡哆醛；其他如5.5min為原料ppo中引入的未知雜質。

圖7為本發(fā)明涉及的反應物和產物(opa衍生法)的高效液相檢測圖譜；

其中，1：保留時間10.4:谷氨酸；2：保留時間11.97:草銨膦；另外3.9min為未知雜質，可能為體系中其他組分在該檢測條件下于死時間出峰。

具體實施方式

以下結合具體實施例，對本發(fā)明做進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。

通過高效液相色譜(hplc)監(jiān)測反應的進行，并對各個反應物和產物進行分析。hplc分析方法為：液相色譜儀：agilent1100；色譜柱型號：aq-c18,5μm,4.6mm×250mm。流動相：50mm磷酸氫二氨水溶液(含0.1％四丁基氫氧化銨，并用磷酸調ph至3.6):乙腈＝92：8。檢測波長：205nm。流速：1.0ml/min。柱溫：40℃，各相關物質出峰情況見圖6-7。

為了增加氨基酸檢測的靈敏度，使用鄰苯二甲醛(opa)衍生法檢測生成的l-ppt的生成量及體系中剩余的l-glu的量，衍生劑為0.06gopa，加入100ul乙醇，800ulph10.4的硼酸-氫氧氫氧化鈉緩沖液，100ulβ-巰基乙醇；衍生時取100ul樣品，加入25ul衍生劑，30℃避光反應2min，用流動相稀釋10倍進樣，流動相：10mmph7.2磷酸鈉緩沖液(含0.3％四氫呋喃)：甲醇：乙腈＝200:35:15，檢測波長：338nm，流速：0.75ml/min，柱溫40℃。

實施例1

1.1表達轉氨酶的基因工程菌的構建

分別從枯草芽孢桿菌bacillussubtilis168、巨大芽孢桿菌bacillusmagateriumyybm1、大腸桿菌e.colik12w3110、嗜熱桿菌(bacillusstearothermophilus)以及鏈霉菌(streptomycessp.dsm40736)基因組中克隆轉氨酶基因，根據(jù)相應基因組dna序列(genbank登錄號分別為cp010052.1、cp001982.1、cp012868.1、ae016877.1和efl35314.1)設計相應的pcr上游引物和下游引物。

來源于bacillussubtilis的轉氨酶的引物：

bs-f序列：5’-cccgagctcatgagtcaaacaacagcaagcatca-3’(saci)

bs-r序列：5’-cccaagcttttaagctcgcaggcccgcct-3’(hindiii)

來源于bacillusmagaterium的轉氨酶的引物：

bm-f序列：5’-cgcggatccatgagtcaaacttttagcaa-3’(bamhi)

bm-r序列：5’-cccaagcttttacacttcaaccgtttgct-3’(hindiii)

來源于e.coli的轉氨酶的引物：

ec-f序列：5’-ccggaattcatgagcaacaatgaattccatc-3’(ecori)

ec-r序列：5’-ccgctcgagttaatcgctcagcgcatcc-3’(xholi)

來源于bacillusstearothermophilus的引物：

bt-f:5’-cgcggatccatgaacacaaaaaaatttgctaaag-3’(bamhi)

bt-r:5’-ccgctcgagttaaacgcgagcgatgtttg-3’(xholi)

來源于streptomycessp.的引物：

ss-f:cgcggatccatggggcttgcgccggggaa-3’(bamhi)

ss-r:cccaagcttttacggcgcgcacggagcgt-3’(hindiii)

在上、下游引物中分別加入限制性酶切位點，如下劃線所示，具體限制酶見引物序列括號內。

分別以枯草芽孢桿菌bacillussubtilis168以及巨大芽孢桿菌bacillusmagateriumyybm1、大腸桿菌e.colik12w3110、嗜熱桿菌(bacillusstearothermophilus)以及鏈霉菌(streptomycessp.dsm40736)基因組dna為模板，相應的上下游引物進行pcr擴增，pcr反應體系和反應條件如下：

pcr擴增體系：

pcr擴增條件：

1)預變性：95℃5min；

2)變性：98℃10s；退火：58℃15s；延伸：72℃10s；共循環(huán)30次；

3)延伸：72℃10min；

4)4℃保存5.0h。

pcr擴增結束后，擴增產物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳來檢測，結果顯示擴增產物為單一條帶，大小為1400bp左右。用dna回收純化試劑盒對擴增產物進行純化回收，具體步驟參照純化試劑盒說明書。

表達載體pet-28a(+)和pcr擴增產物分別用相應的限制性內切酶進行雙酶切。酶切完成后用dna純化試劑盒對酶切產物進行純化回收以去除限制性內切酶和酶切下來的核苷酸小片段。雙酶切后的pcr擴增產物用t4dna連接酶將其連接至具有相對應切口的表達載體pet-28a(+)上，連接體系如下表1所示：

表1pet-28a(+)-gabt重組表達質粒連接體系

將上述連接體系中的各試劑進行混合后，放于16℃金屬浴中連接12h。將酶連產物轉化至e.colidh5a感受態(tài)細胞中，涂平板、挑單菌落lb液體培養(yǎng)，pcr法鑒定構建成功的陽性轉化子，并由測序公司來驗證插入序列的正確性。再將重組表達載體轉入表達宿主e.colibl21(de3)中，用pcr法來驗證轉化的重組子，驗證后無誤的基因工程菌即為e.colibl21(de3)/pet-28a(+)-ta。

1.2表達乙烯合成酶的基因工程菌的構建

分別從丁香假單胞菌(pseudomonassyringae)、青霉(penicilliumdigitatum)、銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、熒光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)以及肺炎克雷伯氏菌(klebsiellapneumoniae)基因組中克隆乙烯合成酶基因，根據(jù)相應基因組dna序列(genbank登錄號分別為d13182.1、ekv19239、kgb85377.1、nc_016830.1和kxa26957.1)，具體的步驟參考1.1中轉氨酶的構建方法。相應的pcr上游引物和下游引物如下：

來源于丁香假單胞菌的乙烯合成酶的引物：

ps-f：5’-cgcggatccatgaccaacctacagacttt-3’(bamhi)

ps-r：5’-cccaagctttcatgagcctgtcgcgcggg-3’(hindiii)

來源于青霉的乙烯合成酶的引物：

pd-f：5’-cgcggatccatgacacacatacctttt-3’(bamhi)

pd-r：5’-cccaagctttcatgacgcgcgacatagg-3’(hindiii)

來源于銅綠假單胞菌的乙烯合成酶的引物：

pa-f：5’-cgcggatccatggaaaagaacatacctat-3’(bamhi)

pa-r：5’-ccgctcgagttagttgggttcaagttcac-3’(xholi)

來源于熒光假單胞菌的乙烯合成酶的引物：

pf-f：5’-cgcggatccatggaaaagaacatacctat-3’(bamhi)

pf-r：5’-ccgctcgagttagttgggttcaagttcac-3’(hindiii)

來源于肺炎克雷伯氏菌的乙烯合成酶的引物：

kp-f：5’-cgcggatccatgaccgccgtgaagcacgcttt-3’(bamhi)

kp-r：5’-cccaagcttttaggggtttttttgctgag-3’(hindiii)

實施例2

2.1微生物的培養(yǎng)

lb液體培養(yǎng)基組成：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l，用去離子水溶解后定容，121℃滅菌20min，待用。

將含有轉氨酶基因以及乙烯合成酶的基因工程菌e.colibl21(de3)接種至含50μg/ml卡那霉素的5mllb液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)12h。轉接至500ml同樣含50μg/mlkan的新鮮lb液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至od600達到0.8左右時，加入iptg至其濃度為0.1mm，18℃下誘導培養(yǎng)16h。培養(yǎng)結束后，將培養(yǎng)液10000rpm離心10min，棄上清，收集菌體細胞，放到-70℃超低溫冰箱中保存，待用。

2.2純酶的制備

將培養(yǎng)結束后收集到的菌體細胞，用20mmpbs(ph7.4，25mm咪唑)的緩沖液洗滌菌體兩次。之后將菌體重懸于pbs(20mm，ph7.4,25mm咪唑)緩沖液中，高壓勻漿破碎菌懸液，離心去除沉淀，得到的上清為上樣到事先使用水和pbs(20mm，ph7.4,25mm咪唑)緩沖液平衡的ni-nta填料填充柱上，靜置1h，再分別使用10倍柱體積的pbs(20mm，ph7.4,25mm咪唑)緩沖液和5倍柱體積的pbs(20mm，ph7.4,50mm咪唑)緩沖液洗雜，最后使用pbs(20mm，ph7.4,250mm咪唑)緩沖液洗脫柱子上的蛋白，經sds-page驗證條帶純度后，使用30kd的超濾管濃縮，并使用100mm磷酸鈉緩沖液(100mm，ph7.4)置換兩次，加入甘油使得甘油終濃度為10％，即可制備轉氨酶或乙烯合成酶的純酶。使用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，液氮速凍后置于-70℃超低溫冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3酶活力的測定

酶活定義：1961年國際酶學會議規(guī)定，1個酶活力單位是指在特定條件(25℃)下，在1分鐘內能轉化1微摩爾底物的酶量，或是轉化底物中1微摩爾的有關基團的酶量。

轉氨酶的酶活測定：取底物溶液(0.3m谷氨酸、0.1mppo溶液)250μl，加入0.1m的nh3·nh4cl緩沖溶液(ph＝7.5)200μl，加入10mmplp溶液25μl，置于金屬浴震蕩器中，25℃保溫10min；加入25μl酶液，迅速取出用手震蕩、迅速放回金屬浴震蕩器中，開始計時，25℃反應10min；反應10min后加入500μl5％的鹽酸，取出震蕩混勻，反應終止；12000rpm離心三分鐘，取上清液，用去離子水稀釋10倍，進hplc分析；根據(jù)hplc測得的l-草銨膦濃度數(shù)據(jù)，計算酶活。

乙烯合成酶酶活測定：取底物溶液(20mmα-酮戊二酸溶液)800μl，加入100mml-精氨酸溶液50μl，40mm的feso4溶液50μl，置于振蕩搖床中，25℃保溫10min；加入100μl酶液，迅速取出用手震蕩、迅速放回振蕩搖床中，開始計時，25℃反應10min；反應10min后加入500μl5％的鹽酸，取出震蕩混勻，反應終止；12000rpm離心三分鐘，取上清液，進hplc分析；根據(jù)hplc測得的20mmα-酮戊二酸溶液的濃度數(shù)據(jù)，計算其減少的量以計算酶活。

轉氨酶酶活測定結果：通過對5個轉氨酶的活力比較，發(fā)現(xiàn)來源于大腸桿菌的轉氨酶活力最高，約為30u/ml，其他的轉氨酶的活力均較低，來源于枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱桿菌和鏈霉菌的轉氨酶活力分別為大腸桿菌的28％、37％、15％和10％。

乙烯合成酶酶活測定結果：通過對克隆的乙烯合成酶的活力測定，結果表明，來源于丁香假單胞菌的乙烯合成酶活力最高，約為97u/l，其他的乙烯合成酶均表現(xiàn)較低的活力，其中青霉來源的活力為64％，其他來源的均低于15％。

為減少菌體或者酶的使用量，故具體實施過程使用來源于大腸桿菌的轉氨酶和來源于丁香假單胞菌的轉氨酶作為催化劑，考察轉氨酶和乙烯合成酶偶聯(lián)催化對草銨膦生產效率的影響。

實施例3對比轉氨酶和乙烯合成酶耦合的反應效果

3.1全細胞定性反應

配置底物溶液：定量稱取ppo和l-谷氨酸、l-精氨酸、feso4以及磷酸吡哆醛到燒杯中，用30％氨水調節(jié)ph＝8.5，加到容量瓶中，用去離子水定容，使ppo的終濃度為20mm，l-谷氨酸的終濃度為20mm、l-arg濃度為5mm、fe²⁺濃度為2mm以及磷酸吡哆醛1mm。

培養(yǎng)結束后，離心收集菌體，棄上清，清洗菌體后測定活力。將轉氨酶(來源于大腸桿菌，genbank登錄號為cp012868.1)和乙烯合成酶(來源于丁香假單胞菌，genbank登錄號為genbank登錄號為d13182.1)按照活力1:1的比例混合，其中轉氨酶取50μl發(fā)酵液離心得到的菌體，加入底物溶液2ml，重懸，置于試管(15mm*150mm)中于30℃恒溫振蕩反應器內反應24h。

反應結束后，hplc檢測，有ppt產生，但未發(fā)現(xiàn)明顯的α-酮戊二酸和ppo峰，衍生檢測無明顯谷氨酸的峰，說明ppo轉化率達到100％。

3.2純酶催化反應驗證乙烯合成酶的效果并對比谷氨酸加量對反應轉化率的影響

定量稱取ppo到圓底燒瓶中，用0.2m氫氧化鈉調節(jié)ph＝7.5，定量稱取l-谷氨酸鈉、l-精氨酸、硫酸亞鐵和磷酸吡哆醛，用去離子水定容，使得ppo濃度為50mm，l-谷氨酸分別為50mm、62.5mm、100mm、150mm、200mm，磷酸吡哆醛濃度為2mm、l-精氨酸濃度為10mm，fe²⁺濃度為4mm，取底物混合液2ml至于試管(15mm*150mm)中，根據(jù)純化后測得活力，按照轉氨酶：乙烯合成酶活力比1:1加入轉氨酶(來源于大腸桿菌，genbank登錄號為cp012868.1)和乙烯合成酶(來源于丁香假單胞菌，genbank登錄號為genbank登錄號為d13182.1)的酶液2ml，其中轉氨酶濃度為0.56g/l，最終反應體系4ml，于22℃恒溫振蕩器中反應24h，hplc檢測；同時，設置轉氨酶單酶反應的對照，結果如下：

表1不同l-谷氨酸添加量對產率、轉化率及副產物消耗的影響

標注：表格中底物加入比例表示底物谷氨酸和底物ppo的加入量的比例，谷氨酸和ppo同為轉氨酶催化反應的底物，該反應產生產物草銨膦，同時生成副產物α-酮戊二酸，副產物為乙烯合成酶反應的底物，且該反應需要l-精氨酸和亞鐵離子作為輔助因子，同時l-精氨酸也作為乙烯合成酶的輔助底物被消耗，其消耗量約為α-酮戊二酸的33％；轉化率代表了底物ppo的轉化比例。此外，檢測產物草銨膦的光學純度，發(fā)現(xiàn)其為l-草銨膦，且對映體過量值>99.9％。

上述結果表明：當轉氨反應偶聯(lián)乙烯合成酶時，能消耗體系中大部分α-酮戊二酸，從而促進反應向l-ppt方向移動，提高ppo的轉化率，特別是在glu和ppo的摩爾比較低時有非常明顯效果，而且，使用純酶進行反應，說明提高反應效率的關鍵是體系中的乙烯合成酶。且在反應結束后檢測發(fā)現(xiàn)l-精氨酸基本消耗，因而體系中雜質的量相比單轉氨酶反應減少了70％-80％，大大減輕了下游分離純化的壓力。

3.3提高底物濃度并比較全細胞反應偶聯(lián)反應的效果

分別定量稱取ppo到100ml三角瓶中，用0.2m氫氧化鈉調節(jié)ph＝8.0，定量稱取l-谷氨酸鈉、l-精氨酸、硫酸亞鐵和磷酸吡哆醛，用去離子水定容至10ml，使得ppo濃度為100mm，l-谷氨酸分別為100mm、125mm、150mm，磷酸吡哆醛濃度為2mm、l-精氨酸濃度為20mm，fe²⁺濃度為6mm；以4ml轉氨酶發(fā)酵液離心的菌體為基準，使得轉氨酶：乙烯合成酶活力比為1:1.2，并用100mmph7.5磷酸鈉緩沖液重懸并定容至10ml，加入反應物中，最終反應體積為20ml，于25℃恒溫振蕩器中反應，hplc檢測。同時，設置轉氨酶單酶反應的對照，反應10.5h。結果如下：

表2.不同底物加入量在全細胞催化高濃度ppo底物時對反應轉化率、副產物消耗的影響

標注：表格中底物加入比例表示底物谷氨酸和底物ppo的加入量的比例，谷氨酸和ppo同為轉氨酶催化反應的底物，該反應產生產物草銨膦，同時生成副產物α-酮戊二酸，副產物為乙烯合成酶反應的底物，且該反應需要l-精氨酸和亞鐵離子作為輔助因子，同時l-精氨酸也作為乙烯合成酶的輔助底物被消耗，其消耗量約為α-酮戊二酸的33％；轉化率代表了底物ppo的轉化比例，此外，檢測產物草銨膦的光學純度，發(fā)現(xiàn)其為l-草銨膦，且對映體過量值>99.9％。

上述結果表明：當轉氨反應偶聯(lián)乙烯合成酶時，能消耗體系中大部分α-酮戊二酸，從而促進反應向l-ppt方向移動，提高ppo的轉化率，而雖然體系中有過量的l-谷氨酸存在，但是細胞內的酶能將部分l-glu和α-酮戊二酸消耗，反應體系中l(wèi)-glu的剩余量較低。

綜上所述，本發(fā)明以谷氨酸或其鹽為氨基供體，以乙烯合成酶消耗副產物α-酮戊二酸生產l-草銨膦的方法，具有原料轉化率高、雜質少、生產成本低、分離簡單、收率高、環(huán)保壓力小、適合大規(guī)模工業(yè)化生產等優(yōu)點。

在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實施例做了描述。但是，很顯然仍可以做出各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書應被認為是說明性的而非限制性的。

sequencelisting

<110>浙江大學

<120>一種利用轉氨酶和乙烯合成酶生產l-草銨膦的方法

<130>

<160>20

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cccgagctcatgagtcaaacaacagcaagcatca34

<210>2

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cccaagcttttaagctcgcaggcccgcct29

<210>3

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cgcggatccatgagtcaaacttttagcaa29

<210>4

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cccaagcttttacacttcaaccgtttgct29

<210>5

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ccggaattcatgagcaacaatgaattccatc31

<210>6

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ccgctcgagttaatcgctcagcgcatcc28

<210>7

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

cgcggatccatgaacacaaaaaaatttgctaaag34

<210>8

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

ccgctcgagttaaacgcgagcgatgtttg29

<210>9

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

cgcggatccatggggcttgcgccggggaa29

<210>10

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

cccaagcttttacggcgcgcacggagcgt29

<210>11

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

cgcggatccatgaccaacctacagacttt29

<210>12

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

cccaagctttcatgagcctgtcgcgcggg29

<210>13

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

cgcggatccatgacacacatacctttt27

<210>14

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

cccaagctttcatgacgcgcgacatagg28

<210>15

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

cgcggatccatggaaaagaacatacctat29

<210>16

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

ccgctcgagttagttgggttcaagttcac29

<210>17

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

cgcggatccatggaaaagaacatacctat29

<210>18

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

ccgctcgagttagttgggttcaagttcac29

<210>19

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

cgcggatccatgaccgccgtgaagcacgcttt32

<210>20

<211>29

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

cccaagcttttaggggtttttttgctgag29