本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于檢測黃萎病菌的培養(yǎng)基（mnp-10）以及利用mnp-10對向日葵種子中攜帶的黃萎病菌進(jìn)行特異性的分離和鑒定的方法。

背景技術(shù)：

向日葵是一種起源于美洲的油料作物,廣泛分布于歐洲、亞洲、美洲等地，目前已經(jīng)成為世界第四大油料作物。近年來，由于國外向日葵育種材料和雜交種的大量引入，使得我國向日葵黃萎病呈現(xiàn)逐年加重的趨勢。因此，向日葵黃萎病的發(fā)生嚴(yán)重影響向日葵的產(chǎn)量和品質(zhì)，繼而影響著我國向日葵產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)步發(fā)展。

向日葵黃萎病是由大麗輪枝菌(verticilliumdahliaekleb.)引起的一種典型的土傳病害，可以侵染多種寄主作物，造成產(chǎn)量和品質(zhì)的嚴(yán)重下降。該病原菌寄主范圍廣，常以發(fā)病組織中殘留的厚垣孢子、微菌核等作為來年的初侵染來源。目前，由于大麗輪枝菌能夠侵染向日葵的花盤，從而使得種子可能成為攜帶黃萎病菌進(jìn)行遠(yuǎn)距離的傳播的載體。而這也可能是導(dǎo)致我國向日葵黃萎病發(fā)生面積不斷加大的主要原因之一。已有的研究結(jié)果表明可以利用pda培養(yǎng)基或?yàn)V紙法來分離種子上攜帶的黃萎病菌，但是由于上述的方法具有操作程序復(fù)雜、分離培養(yǎng)時間較長，在培養(yǎng)過程中很容易被雜菌污染等缺點(diǎn)，從而限制了它們的廣泛應(yīng)用。

2001年8月，楊家榮等在《置物病理學(xué)報》發(fā)表的《分離土壤棉花黃萎病菌選擇性培養(yǎng)基的篩選》一文中公開了一種培養(yǎng)基由土壤浸提液、k2hpo4、kh2po4、尿素酸鈉、果膠、山梨糖、dox鹽、tergitolnp-10，pcnb、瓊脂、蒸餾水以及抗生素組成。此培養(yǎng)基用于黃萎病菌選擇性培養(yǎng)以果膠和山梨糖作為復(fù)合碳源，尿酸鈉有利于棉花黃萎病微菌核黑色素形成，pcnb有利于抑制白色菌絲狀雜菌。本發(fā)明使用土壤浸提液，成分復(fù)雜難于控制體系成分。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種檢測黃萎病菌的培養(yǎng)基，含有多聚半乳糖醛酸（polygalacturonicacid，pga），所述培養(yǎng)基以pga作為唯一碳源，所述培養(yǎng)基由溶液i、溶液ii和抗生素組成，所述溶液i為pga的naoh溶液，所述溶液ii包括kno3、kh2po4、kcl、mgso4·7h2o、tergitolnp-10和瓊脂粉。本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基是篩選性培養(yǎng)基，與常規(guī)培養(yǎng)基相比缺少了大量碳源成分，有利于抑制其他微生物的生長。pga所提供的碳源是黃萎病菌生長擴(kuò)繁必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)。

優(yōu)選的是，每500ml溶液i中含有pga3g至10g和naoh4g，其余為水。naoh的加入有利于pga的溶解，增大溶液的ph。降低pga的濃度能夠明顯降低菌株培養(yǎng)效率，但高濃度的pga對菌株的培養(yǎng)效率沒有很明顯的影響。所述溶液i與溶液ii混合后形成的培養(yǎng)基的最終的ph為7至10，優(yōu)選為8至9，優(yōu)選為8.5。

上述任一項(xiàng)中優(yōu)選的是，每500ml溶液ii中含有kno31g、kh2po41g、kcl0.5g、mgso4·7h2o0.5g、tergitolnp-100.5ml至1ml和瓊脂粉15g，其余為水。kno3、kh2po4、kcl、mgso4·7h2o為黃萎病菌生長所必需的大量元素和微量元素。

上述任一項(xiàng)中優(yōu)選的是，所述溶液i經(jīng)過高壓滅菌，滅菌條件為121℃，15min。

上述任一項(xiàng)中優(yōu)選的是，所述溶液ii經(jīng)過高壓滅菌，滅菌條件為121℃，15min。

上述任一項(xiàng)中優(yōu)選的是，所述培養(yǎng)基是將溶液i和溶液ii按照1：1的體積比混合而成。

上述任一項(xiàng)中優(yōu)選的是，每500ml溶液i中含有pga5g。選用5gpga/500ml溶液i既為菌落生長提供了最合適濃度的碳源，又節(jié)約了昂貴的試劑成本。

上述任一項(xiàng)中優(yōu)選的是，每500ml溶液iitergitolnp-100.5ml。tergitol（np-10）是表面活性劑，是指具有固定的親水親油基團(tuán)，在溶液的表面能定向排列，并能使表面張力顯著下降的物質(zhì)。tergitol（np-10）的添加可以增加各試劑的溶解性。500ml溶液ii中tergitolnp-10優(yōu)選為0.5-1ml，能夠保證溶液ii中各試劑的溶解性，同時對于菌落的生長不會產(chǎn)生不利影響；進(jìn)一步的優(yōu)選為0.5ml能達(dá)到理想溶解效果，同時減少了昂貴的試劑的用量，節(jié)約成本。

上述任一項(xiàng)中優(yōu)選的是，所述抗生素為氯霉素、鏈霉素和金霉素。

上述任一項(xiàng)中優(yōu)選的是，所述培養(yǎng)基中所述氯霉素終濃度為50mg/l。

上述任一項(xiàng)中優(yōu)選的是，所述培養(yǎng)基中所述鏈霉素終濃度為50mg/l。

上述任一項(xiàng)中優(yōu)選的是，所述培養(yǎng)基中所述金霉素終濃度為50mg/l。

上述任一項(xiàng)所述的檢測黃萎病菌的培養(yǎng)基，優(yōu)選的是，適用于大麗輪枝菌的檢測和篩選。

本發(fā)明還提供了一種檢測向日葵種子攜帶黃萎病菌的方法，包括以下步驟：將上述任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，自然冷卻凝固后待用；將待測的向日葵種子去除外殼，取下種皮，接種凝固后的培養(yǎng)基上；黑暗培養(yǎng)；檢測菌落生長狀況。

優(yōu)選的是，所述黑暗培養(yǎng)的溫度為25℃。

上述任一方案中優(yōu)選的是，所述黑暗培養(yǎng)的時間為7天。

上述任一方案中優(yōu)選的是，還包括對所獲得菌落進(jìn)行鑒定的步驟，包括：將獲得的菌落進(jìn)行擴(kuò)繁；提取菌絲體的dna；利用黃萎病菌的特異引物對所述進(jìn)行pcr；對pcr產(chǎn)物進(jìn)行測序和序列比對。本發(fā)明所述的菌落擴(kuò)繁，菌絲dna的提取，pcr以及pcr產(chǎn)物的測序比對方法，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)技術(shù)手段，記載在《分子克隆》等技術(shù)手冊中，因此，在本申請文件中不進(jìn)行具體描述。

上述任一方案中優(yōu)選的是，所述黃萎病菌的特異引物對為vd1/2，所述引物對的序列為：

vd1(5’-catcagtctctctgtttataccaacg-3’)

vd2(5’-cgatgcgagctgtaactactacgcaa-3’)。

本發(fā)明的有益效果在于：提供了一種組成簡單的可用于黃萎病菌篩選的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基以pga作為唯一碳源，即不含有其他能夠提供碳源的成分。本發(fā)明所述培養(yǎng)基是用來篩選黃萎病菌（真菌），與現(xiàn)有技術(shù)中用于分離細(xì)菌的果膠培養(yǎng)基具有不同的作用并且組成不同。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基，更夠特異性的篩選黃萎病菌，相對于分子手段，既便捷又可直接分離到病原菌，能夠滿足快速鑒定和分離種子攜帶的黃萎病菌的要求，具有較強(qiáng)的實(shí)用性和推廣應(yīng)用價值。本發(fā)明還提供了一種在實(shí)驗(yàn)室條件下利用所述培養(yǎng)基對向日葵種子上攜帶的黃萎病菌進(jìn)行特異性篩選和鑒定的有效方法。該方法為后續(xù)鑒定向日葵種子攜帶黃萎病菌以及種子的帶菌率的檢測提供了便捷可靠的檢測手段。

附圖說明

圖1作為利用本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例2的一種檢測向日葵種子攜帶黃萎病菌的方法的檢測結(jié)果的菌落形態(tài)圖

圖2作為利用本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例2的一種檢測向日葵種子攜帶黃萎病菌的方法的檢測結(jié)果的pcr產(chǎn)物測序在genbank中的比對結(jié)果示意圖

圖3作為利用本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例3的一種檢測向日葵種子攜帶黃萎病菌的方法的檢測結(jié)果的共聚焦熒光顯微鏡和mnp-10培養(yǎng)基檢測向日葵花盤種皮帶菌情況綠色熒光分布圖

圖4作為利用本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例3的一種檢測向日葵種子攜帶黃萎病菌的方法的檢測結(jié)果的共聚焦熒光顯微鏡和mnp-10培養(yǎng)基檢測向日葵花盤種皮帶菌情況菌落形態(tài)圖

圖5作為利用本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例4的一種檢測向日葵種子攜帶黃萎病菌的方法的檢測結(jié)果的mnp-10培養(yǎng)基上1號樣本菌落形成圖

圖6作為利用本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例4的一種檢測向日葵種子攜帶黃萎病菌的方法的檢測結(jié)果的mnp-10培養(yǎng)基上2號樣本菌落形成圖

圖7作為利用本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例4的一種檢測向日葵種子攜帶黃萎病菌的方法的檢測結(jié)果的pcr方法檢測大田發(fā)病向日葵種皮帶菌情況pcr擴(kuò)增圖譜。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明的目的是提供一種特異性篩選黃萎病菌的培養(yǎng)基mnp-10的制備方法，本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基是篩選性培養(yǎng)基，與常規(guī)培養(yǎng)基相比缺少了大量碳源成分，有利于抑制其他微生物的生長。

本發(fā)明的另一目的是在實(shí)驗(yàn)室條件下利用培養(yǎng)基mnp-10對向日葵種子中攜帶的黃萎病菌進(jìn)行特異性的分離和鑒定。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了一種檢測黃萎病菌的培養(yǎng)基mnp-10，用來篩選黃萎病菌（真菌），與現(xiàn)有技術(shù)中用于分離細(xì)菌的果膠培養(yǎng)基具有不同的作用并且組成不同。其配制方法如下：

1、溶液ⅰ的配制：pga(p-3889；sigma)5g、naoh4g、定容至500ml。121℃高壓滅菌15min后，冷卻至50℃。

2、溶液ii的配制：kno31g、kh2po41g、kcl0.5g、mgso4·7h2o0.5g、tergitol（np-10；sigma）0.5ml、瓊脂粉15g、定容至500ml。121℃高壓滅菌15min后，冷卻至50℃。

抗生素：將500ml溶液ⅰ和500ml溶液ⅱ混合，并添加氯霉素（c-0378；sigma）、鏈霉素（s-6501；sigma）、金霉素（c-4881；sigma）各50mg/l。

其中，pga為黃萎病菌的生長提供了碳源，并且所述培養(yǎng)基中不包括其他碳源物質(zhì)，不包括其他碳源物質(zhì)有利于抑制其他微生物的生長；naoh的加入，有利于pga的溶解，增大溶液的ph。naoh的添加與pga無需按照特定比例；tergitol（np-10）是表面活性劑，是指具有固定的親水親油基團(tuán)，在溶液的表面能定向排列，并能使表面張力顯著下降的物質(zhì)，tergitol（np-10）的添加可以增加各試劑的溶解性；kno3、kh2po4、kcl、mgso4·7h2o提供了黃萎病菌生長所必需的大量元素和微量元素；氯霉素、鏈霉素、金霉素抑制細(xì)菌的生長。溶液i、溶液ii與抗生素混合后所形成的培養(yǎng)基的ph為7至10，優(yōu)選為8至9，尤其優(yōu)選8.5。

需要指出的是，本發(fā)明所使用到的藥品試劑并不局限于本實(shí)施例中所列出的生產(chǎn)廠家及貨號。其他生產(chǎn)廠家或其他貨號的相同試劑均適用于本發(fā)明。

實(shí)施例2

實(shí)施例2提供了一種利用實(shí)施例1中提供的mnp-10培養(yǎng)基檢測向日葵種子是否攜帶黃萎病菌的方法，包括以下步驟：

將上述培養(yǎng)基到入90mm培養(yǎng)皿中凝固后待用，將待測的向日葵種子去除外殼取下種皮接種到mnp-10培養(yǎng)基上，25℃下黑暗培養(yǎng)7天，如能長出菌落則證明該樣品攜帶黃萎病菌。

本發(fā)明提供的特殊培養(yǎng)基mnp-10，更夠特異性的篩選黃萎病菌，相對于分子手段，既便捷又可直接分離到病原菌，能夠滿足快速鑒定和分離種子攜帶的黃萎病菌的要求，具有較強(qiáng)的實(shí)用性和推廣應(yīng)用價值。

1、mnp-10培養(yǎng)基的配置

按照實(shí)施例1中所述的培養(yǎng)基配制方式，分別配制溶液ⅰ和溶液ⅱ，高壓滅菌冷卻至50℃時按1：1的體積比混合，并添加氯霉素、鏈霉素、金霉素各50mg/l。迅速倒入平皿中，凝固后待用。

2、利用mnp-10培養(yǎng)基檢測向日葵種子是否攜帶黃萎病菌

將向日葵雜交種ld5009的種子播種在裝有滅菌土的營養(yǎng)缽中，置于日光溫室中進(jìn)行生長。待向日葵幼苗長出2-4片真葉時，采用傷根法接種分生孢子液（接種孢子濃度為1.0×10⁷個/ml）于營養(yǎng)缽中，設(shè)置無菌水接種的幼苗作為空白對照。14周后，收獲新鮮的向日葵種子。將培養(yǎng)皿中mnp-10培養(yǎng)基從中間劃線分開，然后將接種植株種子的種殼和種皮分別取下后放置在mnp-10培養(yǎng)基一側(cè)，而將空白對照植株的種殼和種皮平鋪在同一mnp-10培養(yǎng)基的另外一側(cè)。24℃恒溫培養(yǎng)7d，觀察種殼和種皮周圍是否有菌落的形成。結(jié)果如圖1所示，在接種植株的部分種殼和種皮的周圍有菌落形成，而空白對照植株的種殼和種皮周圍未見有菌落生長，如圖1所示。

將上述的菌落在pda培養(yǎng)基上擴(kuò)繁后，提取菌絲體的dna，利用黃萎病菌的特異引物對vd1/2進(jìn)行pcr。對pcr產(chǎn)物進(jìn)行測序并在genbank進(jìn)行比對后，發(fā)現(xiàn)所擴(kuò)增的條帶和向日葵大麗輪枝菌（ku057923）有100%的同源性，如圖2所示。證明利用mnp-10培養(yǎng)得到的菌落就是向日葵黃萎病菌：大麗輪枝孢菌（v.dahliae）。因此，mnp-10培養(yǎng)基可以對向日葵籽粒中攜帶的黃萎病菌進(jìn)行特異性分離和鑒定。

需要說明的是，大麗輪枝菌為黃萎病菌的一種，引起向日葵黃萎病的病原菌大多數(shù)為大麗輪枝菌，但是本發(fā)明所涉及的檢測培養(yǎng)基和檢測方法并不局限于大麗輪枝菌，本發(fā)明提供的用于檢測黃萎病菌的培養(yǎng)基也適用于其他的黃萎病菌。目前鑒定出的能侵染向日葵的黃萎病菌包括大麗輪枝菌和黑白輪枝菌，絕大多數(shù)是大麗輪枝菌，極少數(shù)為黑白輪枝菌，本發(fā)明提供的檢測向日葵種子攜帶黃萎病菌的方法對于向日葵種子攜帶的其他黃萎病菌同樣適用，例如，常見的黃萎病菌除了大麗輪枝菌（v.dahliaekleb.）外還包括黑白輪枝菌（v.albo-atrumreinke&berthold）、三體輪枝菌（v.tricorpusisaac）、云狀輪枝菌（v.nubilumpethybr.）、鱷梨根腐病原菌（v.theobromaeturc.）、以及大麗輪枝菌長孢變種（v.dahliaevar.longisporumstark）、變黑輪枝菌（v.nigrescenspethybr.）等，均適用于本發(fā)明。

實(shí)施例3

實(shí)施例3提供了一種利用實(shí)施例1中提供的mnp-10培養(yǎng)基檢測向日葵種子是否攜帶黃萎病菌的方法，并利用gfp標(biāo)記的向日葵黃萎病菌驗(yàn)證mnp-10的鑒定結(jié)果

在實(shí)施例3中，為了進(jìn)一步確定mnp-10鑒定向日葵種子帶菌的準(zhǔn)確性，利用gfp標(biāo)記的大麗輪枝菌的分生孢子懸浮液接種向日葵雜交種ld5009幼苗的根部，以接種無菌水的幼苗作為空白對照。14周后，利用共聚焦熒光顯微鏡和mnp-10培養(yǎng)基檢測向日葵種皮是否攜帶gfp標(biāo)記的大麗輪枝菌。結(jié)果如圖3所示，為接種gfp標(biāo)記的大麗輪枝菌的分生孢子懸浮液和接種無菌水的空白對照組的向日葵的種皮在共聚焦熒光顯微鏡下觀察到的結(jié)果，觀察條件分別為藍(lán)色激發(fā)光下、混合場下和白色光場下。其中接種gfp標(biāo)記的大麗輪枝菌的分生孢子懸浮液的向日葵的種皮在藍(lán)色激發(fā)光下、混合場下和白色光場下均觀察到了gfp熒光信號，如圖3所示，其中藍(lán)色激發(fā)光和混合場下的綠色熒光在圖3中由曲線圈出，白色光場下的綠色熒光未在圖3中標(biāo)記；而空白對照植株上收獲種子的種皮上在藍(lán)色激發(fā)光下、混合場下和白色光場下均未見有熒光信號。如圖4所示，mnp-10培養(yǎng)基檢測的結(jié)果表明，接種的向日葵種子的種皮周圍有黃萎病菌菌落的形成，而空白對照植株種子的種皮未見有菌落的形成，如圖4接種組和空白對照組所示。挑取菌落在熒光顯微鏡下觀察可見gfp綠色熒光，表明mnp-10分離到的黃萎病菌就是接種用的帶有g(shù)fp標(biāo)記的黃萎病菌。因此，我們認(rèn)為mnp-10培養(yǎng)基能夠準(zhǔn)確鑒定向日葵種子攜帶的黃萎病菌。

實(shí)施例4

實(shí)施例4中，利用mnp-10培養(yǎng)基檢測大田向日葵植株上收獲的種子是否攜帶黃萎病菌。

已有的結(jié)果表明mnp-10培養(yǎng)基能夠作為一種快速檢測向日葵種子攜帶黃萎病菌的方法。因此，利用該方法檢測從大田隨機(jī)取回的14個向日葵花盤種子的種皮（每個花盤上取35粒種子進(jìn)行檢測）。在mnp-10上培養(yǎng)7天后，如圖5所示為1號樣本的部分檢測種子的種皮周圍有黃萎病菌菌落的形成，而與其對應(yīng)的黃萎病菌特異引物進(jìn)行pcr檢測結(jié)果中有兩份種皮樣本能擴(kuò)增出目的條帶，如圖7所示為pcr反應(yīng)結(jié)果；如圖6所示為2號樣本的種皮周圍均有黃萎病菌菌落的形成，其對應(yīng)的pcr檢測結(jié)果中全部種皮的樣本均能擴(kuò)增出目的條帶，如圖7所示為pcr反應(yīng)結(jié)果。

因此，在實(shí)驗(yàn)室條件下利用mnp-10培養(yǎng)基可以對向日葵種子上攜帶的黃萎病菌進(jìn)行特異性篩選和鑒定。該方法為后續(xù)鑒定向日葵種子攜帶黃萎病菌以及種子的帶菌率的檢測提供了便捷可靠的檢測手段。

實(shí)施例5

實(shí)施例5提供了一種檢測黃萎病菌的培養(yǎng)基。實(shí)施例5與實(shí)施例1相似，不同之處在于，溶液i和溶液ii的組成：

溶液ⅰ的配制：pga(p-3889；sigma)3g、naoh4g、定容至500ml。121℃高壓滅菌15min后，冷卻至50℃。

溶液ii的配制：kno31g、kh2po41g、kcl0.5g、mgso4·7h2o0.5g、tergitol（np-10；sigma）0.7ml、瓊脂粉15g、定容至500ml。

溶液i、溶液ii與抗生素混合后所形成的培養(yǎng)基的ph為7至10，優(yōu)選為8至9，尤其優(yōu)選8.5。

實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)施例5提供的培養(yǎng)基也能夠應(yīng)用于實(shí)施例2-4中，進(jìn)行向日葵黃萎病菌的篩選和鑒定。

實(shí)施例6

實(shí)施例6提供了一種檢測黃萎病菌的培養(yǎng)基。實(shí)施例5與實(shí)施例1相似，不同之處在于，溶液i和溶液ii的組成：

溶液ⅰ的配制：pga(p-3889；sigma)10g、naoh4g、定容至500ml。121℃高壓滅菌15min后，冷卻至50℃。

溶液ii的配制：kno31g、kh2po41g、kcl0.5g、mgso4·7h2o0.5g、tergitol（np-10；sigma）1ml、瓊脂粉15g、定容至500ml。

溶液i、溶液ii與抗生素混合后所形成的培養(yǎng)基的ph為7至10，優(yōu)選為8至9，尤其優(yōu)選8.5。

實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)施例6提供的培養(yǎng)基也能夠應(yīng)用于實(shí)施例2-4中，進(jìn)行黃萎病菌的篩選和鑒定。

實(shí)施例7

實(shí)施例7提供了一種檢測黃萎病菌的培養(yǎng)基。實(shí)施例5與實(shí)施例1相似，不同之處在于，溶液i和溶液ii的組成：

溶液ⅰ的配制：pga(p-3889；sigma)7g、naoh4g、定容至500ml。121℃高壓滅菌15min后，冷卻至50℃。

溶液ii的配制：kno31g、kh2po41g、kcl0.5g、mgso4·7h2o0.5g、tergitol（np-10；sigma）0.6ml、瓊脂粉15g、定容至500ml。

溶液i、溶液ii與抗生素混合后所形成的培養(yǎng)基的ph為7至10，優(yōu)選為8至9，尤其優(yōu)選8.5。

實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)施例7提供的培養(yǎng)基也能夠應(yīng)用于實(shí)施例2-4中，進(jìn)行黃萎病菌的篩選和鑒定。

因此，本發(fā)明提供的一種組成簡單的可用于黃萎病菌篩選的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基以pga作為唯一碳源，即不含有其他能夠提供碳源的成分。本發(fā)明所述培養(yǎng)基能夠有效的用來篩選黃萎病菌（真菌），與現(xiàn)有技術(shù)中用于分離細(xì)菌的果膠培養(yǎng)基具有不同的作用并且組成不同。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基，更夠特異性的篩選黃萎病菌，相對于分子手段，既便捷又可直接分離到病原菌，能夠滿足快速鑒定和分離種子攜帶的黃萎病菌的要求，具有較強(qiáng)的實(shí)用性和推廣應(yīng)用價值。

同時，本發(fā)明提供了一種在實(shí)驗(yàn)室條件下利用所述培養(yǎng)基對向日葵種子上攜帶的黃萎病菌進(jìn)行特異性篩選和鑒定的有效方法。該方法為后續(xù)鑒定向日葵種子攜帶黃萎病菌以及種子的帶菌率的檢測提供了便捷可靠的檢測手段。