本申請是申請?zhí)枮?01180031651.1(pct/us2011/023797)、申請日為2011年2月4日、發(fā)明名稱為“氯毒素變體、綴合物及其使用方法”的中國專利申請的分案申請。

相關(guān)申請的交叉參考

本申請要求2010年5月11日提交的美國申請?zhí)杣s61/333,556的利益，將該文獻(xiàn)的公開內(nèi)容引入本文參考。

本發(fā)明一般性涉及氯毒素，更具體地說，本發(fā)明涉及氯毒素變體、氯毒素變體綴合物、包含氯毒素變體或綴合物的組合物，以及使用氯毒素變體、綴合物和組合物的方法。

背景技術(shù)：

神經(jīng)外科醫(yī)師長期尋找闡明腦癌細(xì)胞以鑒定癌癥病灶并且在腫瘤切除操作過程中實(shí)時(shí)將癌癥與正常組織區(qū)分的方法。由氯毒素(ctx)即從leiurusquinquestriatus全蝎中發(fā)現(xiàn)的肽組成的生物綴合物和近紅外熒光(nirf)分子例如cy5.5,("腫瘤涂料")以高靈敏度清楚地鑒定了腫瘤病灶(m.veiseh等人,"tumorpaint:achlorotoxin:cy5.5bioconjugateforintra-operativevisualizationofcancerfoci,"cancerresearch67(14):6882-88,2007)。最初選擇ctx用于這些研究，因?yàn)榕c正常腦組織相比它優(yōu)先結(jié)合神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(l.soroceanu等人,"useofchlorotoxinfortargetingofprimarybraintumors,"cancerresearch58:4871-4879,1998)。因?yàn)閏tx靶標(biāo)顯示出為多種其他癌癥類型共有，所以ctx:cy5.5有效地指示出了前列腺、結(jié)腸、肉瘤、髓母細(xì)胞瘤和其他類型的實(shí)體瘤(m.veiseh2007)。

ctx是36個(gè)氨基酸的肽，它具有4個(gè)二硫鍵，這些二硫鍵賦予多肽高度三維結(jié)構(gòu)。ctx在15、23和27位具有3個(gè)賴氨酸殘基，它們用于綴合nhs-酯修飾的cy5.5和其他熒光分子。得到的生物綴合物是典型地75-85％在27位單-標(biāo)記的肽和少量與lys15和lys23綴合的二-和三-標(biāo)記的肽的混合物。盡管能夠具有foodanddrugadministration(fda)和另外類似管理部門批準(zhǔn)的混合物，但是商業(yè)化可能受到阻礙，因?yàn)樗嘿F且在未來難以匹配單-、二-和三-標(biāo)記批量的比例。

對具有氯毒素優(yōu)良特性并且具有用于綴合診斷劑或治療劑的單一賴氨酸殘基以提供單一均勻的新分子本體的多肽存在需求。本發(fā)明尋求滿足這一需求并且還提供相關(guān)的優(yōu)勢。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了氯毒素變體、由氯毒素變體構(gòu)成的綴合物、包含氯毒素變體或綴合物的組合物，以及使用氯毒素變體、綴合物和組合物的方法。

在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了具有單一賴氨酸殘基(lys27)的修飾的氯毒素肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的氯毒素肽具有被非賴氨酸的氨基酸取代的lys15和lys23的天然氯毒素。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的氯毒素肽具有seqidno:2中給出的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的氯毒素肽具有seqidno:3中給出的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的氯毒素肽具有seqidno:4中給出的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的氯毒素肽具有seqidno:5中給出的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的氯毒素肽具有seqidno:6中給出的氨基酸序列。

還提供了包含本發(fā)明修飾的氯毒素肽的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包含藥學(xué)可接受的載體。

在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了可通過給予氯毒素治療的疾病或病癥的治療方法，包括對有此需要的受試者給予有效量的本發(fā)明修飾的氯毒素肽。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了包含本發(fā)明修飾的氯毒素肽的氯毒素綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述氯毒素綴合物包含與一種或多種治療劑、診斷劑、成像劑或靶向劑或增加修飾的氯毒素肽的循環(huán)半衰期的基團(tuán)共價(jià)偶合的修飾的氯毒素肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療劑、診斷劑、成像劑或靶向劑或增加修飾的氯毒素肽的循環(huán)半衰期的基團(tuán)通過賴氨酸殘基與修飾的氯毒素共價(jià)偶合。適合的診斷劑或成像劑包括熒光標(biāo)記(例如量子點(diǎn)或聚合物點(diǎn))、放射性標(biāo)記和磁共振成像標(biāo)記(例如硼納米顆粒、硼和碳納米顆粒、碳化硼納米顆粒、含硼聚合物、含硼和碳的聚合物、碳化硼聚合物和還包含釓的任意的這些納米顆?；蚓酆衔?。適合的靶向劑包括抗體、多肽、多糖和核酸。適合的治療劑包括化療劑(例如甲氨蝶呤、多西他賽、順鉑和依托泊苷)和生物治療劑(例如cdna、sirna、shrna,和rnai)。適合的增加修飾的氯毒素肽的循環(huán)半衰期的基團(tuán)包括聚乙二醇基團(tuán)、糖基基團(tuán)和糖基聚乙二醇基團(tuán)。

在其他方面中，提供了使用氯毒素綴合物的方法。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使可通過氯毒素成像的組織成像的方法，包括使可通過氯毒素成像的組織接觸本發(fā)明的氯毒素綴合物，以使可通過氯毒素成像的組織成像。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測可通過氯毒素檢測的癌癥的方法，包括使可通過修飾的氯毒素成像的組織接觸本發(fā)明的修飾的氯毒素綴合物，以檢測可通過氯毒素檢測的癌癥。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測和摘除可通過氯毒素檢測的癌癥的方法，包括使組織接觸本發(fā)明的修飾的氯毒素綴合物，以檢測癌組織，并且摘除通過修飾的氯毒素綴合物檢測的癌組織。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療修飾的氯毒素綴合物靶向的癌癥的方法，包括使結(jié)合修飾的氯毒素的組織接觸本發(fā)明的修飾的氯毒素綴合物以治療癌癥。

附圖說明

本發(fā)明的上述方面和許多附加優(yōu)點(diǎn)易于理解，在參照如下詳細(xì)描述并且結(jié)合附圖考慮時(shí)其會(huì)得到更好的理解。

圖1比較了天然氯毒素(線性ctx)與本發(fā)明有代表性的修飾的氯毒素肽(k15a_k23actx；k15r_k23rctx)的序列。天然和具有4個(gè)二硫鍵的取代的ctx如黃線所示。

圖2是本發(fā)明有代表性的修飾的氯毒素肽和天然氯毒素的二級(jí)αh化學(xué)位移的比較。通過從實(shí)驗(yàn)αh位移中扣除隨機(jī)螺旋位移計(jì)算二級(jí)αh位移(d.s.wishart等人,¹h,¹³c和¹⁵nchemicalshiftreferencinginbiomolecularnmr,"journalofbiomolecularnmr6,135-140,1995)。天然ctx(深藍(lán)色)、線性ctx(藍(lán)色)、k15a_k23actx(紅色)和k15r_k23rctx(橙色)的棒形圖。兩個(gè)β-鏈如藍(lán)色箭頭所示，α–螺旋如紅色所示。取代的殘基和殘基d18如綠色星號(hào)所示。

圖3a和3b示例本發(fā)明有代表性的修飾的ctx:cy5.5生物綴合物的功能圖像(圖3a，k15a_k23actx:cy5.5；和圖3b,k15r_k23rctx:cy5.5)。通過尾靜脈給具有wt或nd2:smoa1腫瘤的小鼠注射50μl40μm修飾的生物綴合物。在注射后3天使用xenogen光譜取生物光子圖像。然后將腦冷凍在oct中，切成12μm切片，用h&e染色以確定腫瘤負(fù)荷。

發(fā)明詳述

本發(fā)明提供了氯毒素變體、由氯毒素變體構(gòu)成的綴合物、包含氯毒素變體或綴合物的組合物、以及使用氯毒素變體、綴合物和組合物的方法。

在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了氯毒素變體。本文所用的術(shù)語"氯毒素變體"與術(shù)語"修飾的氯毒素肽"可互換使用且指具有至少一些有用的天然氯毒素活性的非天然多肽。氯毒素是天然存在的包含36個(gè)氨基酸并且具有seqidno:1中給出的氨基酸序列的多肽。

術(shù)語"修飾的氯毒素肽"是指具有氨基酸序列的多肽，其中天然氯毒素的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被在該位置上非天然氯毒素的氨基酸殘基取代(即替代)。例如，天然氯毒素的殘基15和23是賴氨酸殘基；在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，提供了在15和23位上具有丙氨酸或精氨酸殘基的修飾的氯毒素肽。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了具有單一賴氨酸殘基(lys27)的修飾的氯毒素肽。在該實(shí)施方案中，修飾的氯毒素肽具有被非賴氨酸的氨基酸取代的lys15和lys23天然氨基酸，得到了具有單一賴氨酸殘基(lys27)的修飾的氯毒素。在該實(shí)施方案中，修飾的氯毒素肽具有seqidno:2中給出的氨基酸序列，其中l(wèi)ys15和lys23被獨(dú)立地選自天然存在和非天然氨基酸、氨基酸類似物和氨基酸模擬物的氨基酸取代。

天然存在的氨基酸是通常在天然存在的蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的20種l-氨基酸(ala或a、cys或c、asp或d,glu或e、phe或f,gly或g、his或h、ile或i、lys或k、leu或l、met或m、asn或n、pro或p、gln或q、arg或r、ser或s、thr或t,val或v、trp或w、tyr或y)。非天然氨基酸包括d-氨基酸。氨基酸類似物和氨基酸模擬物以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用。氨基酸類似物是指具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，僅作為實(shí)例，α-碳與氫、羧基、氨基和r基團(tuán)鍵合。這種類似物可以具有修飾的r基團(tuán)(作為實(shí)例正亮氨酸)或可以具有修飾的肽骨架，而仍然保留與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸類似物的非限制性實(shí)例包括高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。

在一個(gè)實(shí)施方案中，lys15和/或lys23獨(dú)立地被堿性氨基酸(即his、arg)、非天然氨基酸、氨基酸類似物或氨基酸模擬物替代。

在一個(gè)實(shí)施方案中，lys15和/或lys23獨(dú)立地被非極性(疏水性)氨基酸(即ala、phe、ile、leu、met、pro、val、trp)、相關(guān)的非天然氨基酸、氨基酸類似物或氨基酸模擬物替代。

在一個(gè)實(shí)施方案中，lys15和/或lys23獨(dú)立地被極性(不帶電荷的)氨基酸(即cys、gly、asn、gln、ser、thr、tyr)、非天然氨基酸、氨基酸類似物或氨基酸模擬物替代。

在一個(gè)實(shí)施方案中，lys15和/或lys23獨(dú)立地被酸性氨基酸(即glu、asp)、非天然氨基酸、氨基酸類似物或氨基酸模擬物替代。

在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的氯毒素肽具有被丙氨酸取代的lys15和lys23(k15a_k23actx)。在該實(shí)施方案中，修飾的氯毒素肽具有seqidno:3中給出的氨基酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的氯毒素肽具有被精氨酸取代的lys15和lys23(k15r_k23rctx)。在該實(shí)施方案中，修飾的氯毒素肽具有seqidno:4中給出的氨基酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的氯毒素肽具有被丙氨酸取代的lys15和被精氨酸取代的lys23(k15a_k23rctx)。在該實(shí)施方案中，修飾的氯毒素肽具有seqidno:5中給出的氨基酸序列。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的氯毒素肽具有被精氨酸取代的lys15和被丙氨酸取代的lys23(k15r_k23actx)。在該實(shí)施方案中，修飾的氯毒素肽具有seqidno:6中給出的氨基酸序列。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了包含修飾的氯毒素肽的組合物。該組合物可以包含用于遞送修飾的氯毒素肽的藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑。適合的藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑包括注射用鹽水或葡萄糖。

治療方法.在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了治療可通過給予氯毒素治療的疾病或病癥的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括對有此需要的受試者給予有效量的本發(fā)明修飾的氯毒素肽。

本文所用的術(shù)語"有效量"是指將所治療的疾病或病癥的一種或多種癥狀緩解至一定程度所給予的活性劑或化合物的足量。結(jié)果可以是疾病征兆、癥狀或原因減少和/或緩解，或生物系統(tǒng)的任意其他期望的改變。可以給予包含這種活性劑或化合物的組合物用于預(yù)防、增強(qiáng)和/或治療?？梢允褂美鐒┝窟f增研究這樣的技術(shù)測定任何個(gè)體情況中的適合的"有效"量。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療患者中表達(dá)氯毒素結(jié)合位點(diǎn)的癌癥的方法，包括對有此需要的患者給予有效量的本發(fā)明氯毒素變體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療表達(dá)氯毒素結(jié)合位點(diǎn)的癌癥的方法，包括對有此需要的患者給予有效量的藥物組合物，該藥物組合物包含本發(fā)明的氯毒素變體和藥學(xué)可接受的載體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療表達(dá)氯毒素結(jié)合位點(diǎn)的腫瘤的方法，包括對有此需要的患者給予有效量的本發(fā)明的氯毒素變體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于抑制表達(dá)氯毒素結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞侵害活性的方法，包括將有效量的氯毒素變體施用于表達(dá)氯毒素結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞。

本發(fā)明的治療方法可施用于有這種治療需要的人和動(dòng)物受試者。

實(shí)際上可以用本發(fā)明的氯毒素變體和綴合物治療表達(dá)氯毒素結(jié)合位點(diǎn)的每種類型的惡性癌癥。這些惡性癌癥可以包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、脈絡(luò)叢癌、室管膜瘤、腦膜瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)節(jié)瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤和轉(zhuǎn)移腦瘤、其他腦瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、頭頸癌、小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、腸癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、腎癌、皮膚癌、肉瘤(30個(gè)類型以上)、骨肉瘤、橫紋肌肉瘤、尤因肉瘤、癌、黑素瘤、卵巢癌、宮頸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、直腸癌癥、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌癥、生殖細(xì)胞腫瘤、喉癌、多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、胃癌、睪丸癌和維爾姆斯瘤。

氯毒素綴合物.在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了本發(fā)明修飾的氯毒素肽的綴合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該綴合物包含本發(fā)明修飾的氯毒素肽，其與增加修飾的氯毒素肽的循環(huán)半衰期的基團(tuán)共價(jià)偶合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該綴合物包含與治療劑、診斷劑、成像劑或靶向劑共價(jià)偶合的本發(fā)明修飾的氯毒素肽。在一些實(shí)施方案中，所述治療劑、診斷劑、成像劑或靶向劑或增加修飾的氯毒素肽的循環(huán)半衰期的基團(tuán)通過肽的賴氨酸殘基共價(jià)偶合。

增加修飾的氯毒素肽的循環(huán)半衰期的適合的基團(tuán)包括本領(lǐng)域公知用于增加多肽的循環(huán)半衰期的那些基團(tuán)(例如聚乙二醇化、糖基化、聚乙二醇糖基化)。用于聚乙二醇化的有代表性的基團(tuán)包括聚亞烷基氧化物(聚環(huán)氧化物，polyalkyleneoxides)(聚氧化乙烯、聚氧化丙烯以及聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的共聚物)。用于糖基化的有代表性的基團(tuán)包括寡糖類(例如碳水化合物，包括多唾液酸)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述綴合物是聚乙二醇化氯毒素且包含與一種或多種聚亞烷基氧化物(例如聚氧化乙烯)共價(jià)偶合的修飾的氯毒素肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述綴合物是糖基化氯毒素且包含與一種或多種寡糖類共價(jià)偶合的修飾的氯毒素肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述綴合物是聚乙二醇糖基化(glycopegylated)氯毒素且包含與一種或多種糖基化聚亞烷基氧化物(例如糖環(huán)氧乙烷)共價(jià)偶合的修飾的氯毒素肽。

適合的治療劑包括細(xì)胞毒性劑。有代表性的治療劑包括化療劑，例如甲氨蝶呤、多西他賽、順鉑和依托泊苷等；生物治療劑，例如核酸分子(例如dna，例如cdna；和rna，例如sirna、shrna、rnai)，包括轉(zhuǎn)錄和遷移抑制劑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)劑。

適合的診斷劑包括提供通過熒光法和非熒光成像的方法檢測的試劑。其他適合的診斷劑包括放射性標(biāo)記(例如放射性同位素標(biāo)記的化合物)，例如¹²⁵i、¹⁴c和³¹p等和磁共振成像劑。

適合的靶向劑包括抗體、多肽、多糖和核酸。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了包含修飾的氯毒素肽綴合物的組合物。該組合物可以包括用于遞送修飾的氯毒素肽綴合物的藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑。適合的藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑包括注射用鹽水或葡萄糖。

成像方法.在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了使用修飾的氯毒素肽綴合物的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使可用氯毒素成像的組織成像的方法。在該方法中，使可用氯毒素成像的組織接觸氯毒素綴合物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，成像方法是熒光成像法。用于制備和使用熒光氯毒素綴合物的有代表性的方法描述在美國專利申請公開號(hào)us20080279780a1中，發(fā)明名稱為熒光氯毒素綴合物和用于癌癥手術(shù)中顯影的方法，特別將該文獻(xiàn)完整地引入本文參考。

本發(fā)明提供了可通過熒光成像檢測的氯毒素綴合物，它能夠使癌組織手術(shù)中顯影；包含氯毒素綴合物的組合物；和使用氯毒素綴合物的方法。

在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了可通過熒光成像檢測的氯毒素綴合物，它能夠使癌組織手術(shù)中顯影。

氯毒素是使所述綴合物定向于所關(guān)注的組織的靶向劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的氯毒素綴合物包括與氯毒素共價(jià)偶合的一種或多種熒光基團(tuán)(例如紅外或近紅外發(fā)射熒光基團(tuán))。

本文所用的術(shù)語"紅外或近紅外發(fā)射熒光基團(tuán)"是指具有大于約600nm的熒光發(fā)射最大值的熒光基團(tuán)。具有較短波長(例如約500－約600nm)發(fā)射熒光基團(tuán)的熒光氯毒素綴合物用于組織化學(xué)成像。這些綴合物可能會(huì)較少用于人和動(dòng)物體內(nèi)成像，其中優(yōu)選較長波長(例如大于約600nm)發(fā)射熒光基團(tuán)。

在氯毒素綴合物的一些實(shí)施方案中，熒光基團(tuán)衍生自特征在于發(fā)射波長最大值大于約600nm以避免自體熒光的熒光化合物，自體熒光是通過幾毫米－1厘米組織/血液/流體傳播的發(fā)射、不被人或動(dòng)物組織中的血紅蛋白、其他血液成分或蛋白質(zhì)吸收的發(fā)射。

所述熒光基團(tuán)與氯毒素共價(jià)偶合，從而能夠通過熒光成像使所述綴合物顯影。所述熒光基團(tuán)衍生自熒光化合物。適合的熒光化合物是那些可以與氯毒素共價(jià)偶合、而基本上對氯毒素綴合物的靶向和結(jié)合功能沒有不良影響的化合物。類似地，適合的熒光化合物在與氯毒素綴合后保留其熒光特性。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的熒光基團(tuán)是酞菁基團(tuán)。酞菁化合物的特征在于其相對高的消光系數(shù)和有利的熒光量子產(chǎn)量。酞菁化合物的熒光發(fā)射波長最大值作為酞菁結(jié)構(gòu)的函數(shù)改變。根據(jù)具體酞菁化合物的不同，熒光發(fā)射波長最大值可以從綠色(約490nm)改變至近紅(約740nm)。在本發(fā)明方法的實(shí)施過程中，優(yōu)選具有遠(yuǎn)紅外(約650nm)至近紅外(約750nm)的熒光發(fā)射最大值的酞菁化合物。在這些發(fā)射波長下，來自局部環(huán)境的背景熒光是最小的且所關(guān)注的組織相對透明。由于在這些波長下所關(guān)注的組織的相對透明性，所以與使用在較短波長(小于600nm)具有發(fā)射的熒光化合物的其他綴合物相比，可以觀察到本發(fā)明綴合物激發(fā)和熒光發(fā)射顯影最大化且其靶向的組織的量相對更大。

適合的酞菁包括商購自gehealthcare的cydye熒光素，命名為cy2(506nm)、cy2(506nm)、cy3(570nm)、cy3b(572nm)、cy3.5(596nm)、cy5(670nm)、cy5.5(675nm)和cy7(694nm)(括號(hào)內(nèi)是發(fā)射最大值)。在一個(gè)實(shí)施方案中，酞菁化合物是cy5.5。

在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的熒光基團(tuán)是磺化呫噸基團(tuán)。適用于實(shí)施本發(fā)明的磺化呫噸化合物描述在美國專利us6,130,101中，特別將該文獻(xiàn)完整地引入本文參考，且該化合物商購自molecularprobes,inc.,eugene,or，命名為alexafluor。alexafluor是熒光團(tuán)家族的名稱，其特征在于其相對高的消光系數(shù)和有利的熒光量子產(chǎn)量?；腔瘏銍嵒衔锏臒晒獍l(fā)射波長最大值作為該化合物的結(jié)構(gòu)的函數(shù)改變。根據(jù)具體磺化呫噸化合物的不同，熒光發(fā)射波長最大值可以從綠色(約450nm)改變至近紅(約780nm)。在本發(fā)明方法的實(shí)施過程中，優(yōu)選具有遠(yuǎn)紅外(約650nm)至近紅外(約750nm)的熒光發(fā)射最大值的alexafluor化合物。

適合的磺化呫噸化合物包括alexafluors，例如alexafluor350(442nm)、alexafluor405(421nm)、alexafluor488(539nm)、alexafluor500(525nm)、alexafluor514(540nm)、alexafluor532(554nm)、alexafluor546(575nm),alexafluor555(565nm)、alexafluor568(603nm)、alexafluor594(617nm)、alexafluor610(628nm)、alexafluor633(647nm),alexafluor635(645nm)、alexafluor647(668nm)、alexafluor660(690nm)、alexafluor680(702nm)、alexafluor700(719nm)和alexafluor750(779nm)(括號(hào)內(nèi)是發(fā)射最大值)。在一個(gè)實(shí)施方案中，磺化呫噸是alexafluor680?？梢园凑张cthehandbook-aguidetofluorescentprobesandlabelingtechnologies,richardp.haugland(molecularprobes,inc.,asubsidiaryofinvitrogencorp.)中所述類似的方式制備有代表性的磺化呫噸-氯毒素綴合物。

用于本發(fā)明的其他適合的nir熒光團(tuán)包括dylight-680、dylight-750、vivotag-750、dylight-800、irdye-800、vivotag-680和吲哚菁綠。

本發(fā)明修飾的氯毒素肽還可以與量子點(diǎn)和聚合物點(diǎn)偶合。

適合的熒光化合物包括賦予該化合物對于氯毒素的化學(xué)反應(yīng)性的官能團(tuán)。適合的官能團(tuán)包括與胺基共價(jià)偶合的n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)基團(tuán)、與巰基共價(jià)偶合的馬來酰亞胺基團(tuán)和與醛基共價(jià)偶合的酰肼基團(tuán)。優(yōu)選用于制備本發(fā)明綴合物的熒光化合物包括單一反應(yīng)性官能團(tuán)(例如一-nhs酯)。可以理解，其他綴合化學(xué)品適合于制備本發(fā)明的氯毒素綴合物。

本發(fā)明適合的綴合物包括約1－約3個(gè)熒光基團(tuán)/氯毒素。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的綴合物包括約1個(gè)熒光基團(tuán)。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了包含氯毒素綴合物的組合物。該組合物適合于對人和動(dòng)物受試者給藥并且包含藥學(xué)可接受的載體。該組合物包含藥理學(xué)有效量的修飾的氯毒素綴合物。通?？梢酝ㄟ^建立的方法確定有效量。有效量是足以占據(jù)癌細(xì)胞中的氯毒素結(jié)合位點(diǎn)、但不足以將與非腫瘤組織的非特異性結(jié)合降至最低的用量。有效量優(yōu)化了手術(shù)中成像的信噪比。

本發(fā)明提供了使用氯毒素綴合物檢測組織的方法，本發(fā)明的氯毒素綴合物靶向氯毒素結(jié)合位點(diǎn)并且與之結(jié)合?？梢岳斫?，氯毒素結(jié)合位點(diǎn)可以采取兩種形式：結(jié)合氯毒素的位點(diǎn)和結(jié)合本發(fā)明氯毒素綴合物的位點(diǎn)?？梢岳斫饴榷舅亟Y(jié)合位點(diǎn)可以不同于氯毒素綴合物結(jié)合位點(diǎn)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了區(qū)分表達(dá)氯毒素結(jié)合位點(diǎn)的癌病灶的方法。該方法包括下列步驟：

(a)使所關(guān)注的組織接觸對表達(dá)氯毒素結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞具有親和力和特異性的氯毒素綴合物，其中氯毒素綴合物包含一種或多種與氯毒素共價(jià)偶合的紅外或近紅外發(fā)射熒光基團(tuán)；和

(b)測定氯毒素綴合物的結(jié)合水平，其中相對于正常組織，結(jié)合水平升高指示該組織是腫瘤。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了檢測表達(dá)氯毒素結(jié)合位點(diǎn)的癌癥的方法。該方法包括下列步驟：

(a)使所關(guān)注的組織接觸對表達(dá)氯毒素結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞具有親和力和特異性的氯毒素綴合物，其中氯毒素綴合物包含一種或多種與氯毒素共價(jià)偶合的紅外或近紅外發(fā)射熒光基團(tuán)；和

(b)測定氯毒素綴合物的結(jié)合水平，其中相對于正常組織，結(jié)合水平升高指示該組織是腫瘤。

在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了測定表達(dá)手術(shù)中患者氯毒素結(jié)合位點(diǎn)的癌細(xì)胞位置的方法。該方法包括下列步驟：

(a)對患者給予藥物組合物，其中該藥物組合物包含藥學(xué)可接受的載體和足以使表達(dá)體內(nèi)氯毒素結(jié)合位點(diǎn)的癌細(xì)胞成像的用量的氯毒素綴合物，其中氯毒素綴合物包含一種或多種與氯毒素共價(jià)偶合的紅外或近紅外發(fā)射熒光基團(tuán)；

(b)通過熒光成像測定氯毒素綴合物的結(jié)合水平以確定表達(dá)氯毒素結(jié)合位點(diǎn)的癌細(xì)胞的位置，其中相對于正常組織，結(jié)合水平升高指示存在表達(dá)氯毒素結(jié)合位點(diǎn)的癌細(xì)胞；和

(c)從患者中手術(shù)取出至少一些表達(dá)通過熒光成像定位的氯毒素結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞。

本發(fā)明用于檢測癌癥病灶的成像方法適用于小鼠和其他癌癥動(dòng)物模型和獸醫(yī)實(shí)踐。

本發(fā)明的熒光氯毒素綴合物可以包括其他有用的試劑。其他有用的試劑包括診斷劑和治療劑。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，成像方法是磁共振成像方法。磁共振成像中制備和使用氯毒素綴合物的有代表性的方法描述在美國專利申請公開號(hào)us200701254965a1中，發(fā)明名稱為氯毒素-標(biāo)記的納米顆粒組合物和靶向原發(fā)性腦腫瘤的方法，特別將該文獻(xiàn)完整地引入本文參考。

本發(fā)明提供了能夠靶向原發(fā)性腦腫瘤的氯毒素-標(biāo)記的納米顆粒、包括納米顆粒的組合物、使用所述納米顆粒使組織成像的方法和使用所述納米顆粒處理表達(dá)氯毒素結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞的方法。

在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了氯毒素-標(biāo)記的顆粒，其包含：

(a)具有表面的芯，該芯包含具有磁共振成像活性的材料；

(b)修飾的氯毒素肽；和

(c)使修飾的氯毒素肽與表面共價(jià)偶合的連接基。

所述的芯包括具有磁共振成像活性的材料。具有磁共振成像活性的適合的材料包括金屬氧化物，例如氧化亞鐵、氧化鐵、氧化硅、多晶硅氧化物、氧化鋁、氧化鍺、硒化鋅、二氧化錫、二氧化鈦、氧化銦錫和氧化釓?？梢允褂靡环N或多種金屬氧化物的混合物。

除磁性材料外，所述的芯還可以包括無磁性材料，例如氮化硅、不銹鋼、鈦、硼、碳化硼、硼和碳混合物和鎳鈦。還可以使用一種或多種無磁性材料的混合物。

本發(fā)明的顆粒包括約1－約100個(gè)修飾的氯毒素/顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的顆粒包括約10－約50個(gè)修飾的氯毒素/顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的顆粒包括約10個(gè)修飾的氯毒素/顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的顆粒包括約50-約100個(gè)修飾的氯毒素/顆粒。

如上所述，本發(fā)明的磁性納米顆粒包括用作靶向基團(tuán)的氯毒素，所述的靶向基團(tuán)有效地使所述納米顆粒定向于表達(dá)氯毒素結(jié)合位點(diǎn)的細(xì)胞，在那里結(jié)合所述納米顆粒。原發(fā)性腦瘤細(xì)胞(例如來源于神經(jīng)外胚層的腫瘤細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞)包括氯毒素結(jié)合位點(diǎn)。

氯毒素-標(biāo)記的納米顆粒還可以包括其他有用的試劑。其他有用的試劑包括診斷劑。

適合的診斷劑包括通過非磁共振成像的方法檢測納米顆粒的試劑。適合的診斷劑包括發(fā)射光的化合物(例如熒光團(tuán)、磷光體和發(fā)光體)。適合的熒光團(tuán)包括如上所述的那些。

在一個(gè)實(shí)施方案中，氯毒素-標(biāo)記的顆粒還包含熒光基團(tuán)。本發(fā)明的顆粒包括約1－約10個(gè)熒光基團(tuán)/顆粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述顆粒包括約1－約2個(gè)熒光基團(tuán)/顆粒。

在一個(gè)實(shí)施方案中，熒光基團(tuán)選自紅外和近紅外發(fā)射熒光基團(tuán)(即具有大于約600nm的發(fā)射最大值的熒光基團(tuán))。在一個(gè)實(shí)施方案中，熒光基團(tuán)是酞菁基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，熒光基團(tuán)是cy5.5基團(tuán)。

其他適合的診斷劑包括放射性標(biāo)記(例如放射性同位素標(biāo)記的化合物)，例如¹²⁵i、¹⁴c和³¹p等。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供了包括本發(fā)明顆粒的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物包含適合于對人或動(dòng)物受試者給藥的納米顆粒。該組合物可以包含可接受的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該組合物是藥學(xué)可接受的組合物并且包含藥學(xué)可接受的載體。本文所用的術(shù)語"載體"是指有利于遞送顆粒的稀釋劑(例如鹽水)。

在其他方面中，本發(fā)明提供了使用納米顆粒的方法。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使來源于神經(jīng)外胚層的腫瘤細(xì)胞與無腫瘤腦組織相區(qū)分的方法。在該方法中，區(qū)分來源于神經(jīng)外胚層的腫瘤細(xì)胞與無腫瘤腦組織的步驟在于：

(a)使所關(guān)注的組織接觸對來源于神經(jīng)外胚層的腫瘤細(xì)胞具有親和力和特異性的氯毒素-標(biāo)記的納米顆粒；和

(b)測定氯毒素-標(biāo)記的納米顆粒的結(jié)合水平，其中相對于正常組織，結(jié)合水平升高指示該組織是腫瘤。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了檢測來源于神經(jīng)外胚層的腫瘤細(xì)胞的方法。在該方法中，通過下列步驟檢測來源于神經(jīng)外胚層的腫瘤細(xì)胞：

(a)使所關(guān)注的組織接觸對來源于神經(jīng)外胚層的腫瘤細(xì)胞具有親和力和特異性的氯毒素-標(biāo)記的納米顆粒；和

(b)測定氯毒素-標(biāo)記的納米顆粒的結(jié)合水平，其中相對于正常組織，結(jié)合水平升高指示該組織是腫瘤。

上述方法用于區(qū)分和檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。

在上述方法中，測定氯毒素-標(biāo)記的納米顆粒的結(jié)合水平包括磁共振成像。

在上述方法的一些實(shí)施方案中，氯毒素-標(biāo)記的納米顆粒還包含熒光基團(tuán)。在這些實(shí)施方案中，測定氯毒素-標(biāo)記的納米顆粒的結(jié)合水平可以包括熒光成像。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在術(shù)前、手術(shù)中和術(shù)后測定患者神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞位置的方法。該方法包括下列步驟：

(a)對患者給予藥物組合物，其中該藥物組合物包含藥學(xué)可接受的載體和足以使體內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞成像的用量的熒光團(tuán)/氯毒素-標(biāo)記的納米顆粒；

(b)通過術(shù)前磁共振成像測定熒光團(tuán)/氯毒素-標(biāo)記的納米顆粒的結(jié)合水平，以確定神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的位置，其中相對于正常組織，結(jié)合水平升高指示存在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞；

(c)從患者中手術(shù)取出至少一些通過磁共振成像定位的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞；

(d)通過手術(shù)中熒光成像測定熒光團(tuán)/氯毒素-標(biāo)記的納米顆粒的結(jié)合水平，以確定殘留的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的位置，其中相對于正常組織，結(jié)合水平升高指示存在殘留的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞；

(e)從患者中手術(shù)取出至少一些通過熒光成像定位的殘留神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞；和

(f)通過術(shù)后磁共振成像測定熒光團(tuán)/氯毒素-標(biāo)記的納米顆粒的結(jié)合水平，以確定神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的位置，其中相對于正常組織，結(jié)合水平升高指示存在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞。

在該方法中，足以使體內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞成像的熒光團(tuán)/氯毒素-標(biāo)記的納米顆粒的用量約為1-20mgfe/kg體重("fe"是指存在于顆粒芯中的鐵)。

在上述方法中，可以重復(fù)步驟(d)和(e)。

上述方法包括術(shù)前、手術(shù)中和術(shù)后成像?？梢岳斫猓鲜龇椒ǖ淖兓问綄儆诒景l(fā)明的范圍。該方法的其他變化形式包括，例如(1)僅術(shù)前成像；(2)僅手術(shù)中成像；(3)僅術(shù)后成像；(4)僅術(shù)前和手術(shù)中成像；(5)僅術(shù)前和術(shù)后成像；和(6)僅手術(shù)中和術(shù)后成像。

本發(fā)明提供了使用納米顆粒處理組織的方法。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療患者中的神經(jīng)膠質(zhì)瘤的方法，包括對有此需要的患者給予有效量的藥物組合物，該藥物組合物包含氯毒素-標(biāo)記的納米顆粒和藥學(xué)可接受的載體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療神經(jīng)外胚葉瘤的方法，包括對有此需要的患者給予有效量的藥物組合物，該藥物組合物包含氯毒素-標(biāo)記的納米顆粒和藥學(xué)可接受的載體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了抑制腫瘤細(xì)胞的侵害活性的方法，包括對腫瘤細(xì)胞給予有效量的藥物組合物，該藥物組合物包含氯毒素-標(biāo)記的納米顆粒和藥學(xué)可接受的載體。

下文描述了本發(fā)明有代表性的修飾的氯毒素肽及其特性、肽的綴合物及其特性和所述綴合物在成像中的應(yīng)用。

修飾的氯毒素肽的制備.本發(fā)明的兩種有代表性的修飾的氯毒素(ctx)肽(丙氨酸取代的氯毒素,k15a_k23a-ctx；精氨酸取代的氯毒素,k15r_k23r-ctx)序列如圖1中所示。使用boc(叔-丁氧羰基)/hbtu[2-(1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽]進(jìn)行原位中和化學(xué)反應(yīng)合成肽。具有ph7.8的0.1mtris-hcl、0.2mnacl、5mm還原型谷胱甘肽/0.5mm氧化谷胱甘肽的緩沖溶液用于在室溫氧化取代的肽以及環(huán)化和氧化ctx過夜。rp-hplc用于純化肽且通過分析型rp-hplc和es-ms證實(shí)兩種ctx類似物k15a_k23a-ctx和k15r_k23r-ctx的純度和分子量。

nmr排布.將所述肽溶于90％h2o和10％d2o并且在600mhz在298°k記錄一維和二維tocsy和noesy光譜。使用充分建立的技術(shù)指定nmr光譜(k.wuthrich,"nmrofproteinsandnucleicacids",wiley-interscience,newyork,1986)。酰胺區(qū)中的化學(xué)位移充分分散，證實(shí)所述肽正確折疊，且每種肽的noesy光譜中的指紋區(qū)顯示αh–nh依次連接性的完整循環(huán)，除兩個(gè)脯氨酸殘基(pro4和pro31)以外。然而，正如預(yù)計(jì)的，從脯氨酸殘基及其在先殘基的δ質(zhì)子中觀察到noes。天然ctx和合成類似物的二級(jí)αh化學(xué)位移比較如圖2中所示。

取代的ctx生物綴合物的表征.使天然和修飾的肽與cy5.5綴合并且如下文實(shí)施例中所述純化。通過hplc和質(zhì)譜分析得到的生物綴合物。正如預(yù)計(jì)的，ala和arg取代僅產(chǎn)生單-標(biāo)記的ctx:cy5.5生物綴合物。

取代的ctx:cy5.5的功能評價(jià).取代的潛在有益性取決于肽的功能靶向活性是否與天然ctx生物綴合物可比擬。通過生物光子成像測定每種肽使cy5.5信號(hào)優(yōu)先于正常腦而靶向至髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的能力。在每種情況中，將50μl40μm生物綴合物注入顯示與晚期腦瘤具有一致性臨床征兆的小鼠的尾靜脈。3天后，處死小鼠，使用caliper/xenogen光譜生物光子成像系統(tǒng)使其腦成像。與正常腦相比，所有修飾的肽綴合物優(yōu)先使髓母細(xì)胞瘤癌組織發(fā)光(圖3a和3b)。在所有情況中將腫瘤中的信號(hào)與不具有髓母細(xì)胞瘤的注射的對照組動(dòng)物的小腦中的信號(hào)比較。與正常信號(hào)比較的腫瘤中的信號(hào)為：天然ctx:cy5.5，1.96+/-0.47(n＝10)；ala取代的，3.3+/-1.8(n＝8)；和arg取代的，2.6+/-0.85(n＝5)。在統(tǒng)計(jì)學(xué)上，所有修飾的肽生物綴合物都與天然ctx:cy5.5之間無顯著差異，顯示賴氨酸取代不會(huì)干擾ctx結(jié)合其靶標(biāo)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn).當(dāng)開發(fā)針對人臨床試驗(yàn)的新治療劑時(shí)，不僅要考慮到效力、藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)和毒理學(xué)，而且要考慮到實(shí)際問題，即可能損害管理許可或增加生產(chǎn)成本。腫瘤漆(tumorpaint)，即安全和有效地使小鼠模型中的實(shí)體瘤發(fā)光的生物綴合物，提出了與如下事實(shí)相關(guān)的生產(chǎn)挑戰(zhàn)：所述生物綴合物實(shí)際上是單-、二-和三-標(biāo)記的ctx的混合物。本發(fā)明提供了三種新的有代表性的化學(xué)體，它們在功能上與使nirf分子靶向至癌癥的ctx等效，而僅與單一nirf分子綴合。

使用精氨酸酶裂解偶合蛋白質(zhì)組分析對ctx:cy5.5中的ctx綴合位點(diǎn)作圖，并且顯示典型地>80％的產(chǎn)物在lys27上單標(biāo)記，且少量還在lys15或lys23綴合。在與4種其他nirf染料綴合的ctx的分析中，觀察到具有少量二-和三標(biāo)記的肽的單-標(biāo)記的肽占優(yōu)勢的類似模式，除dylight750以外，即僅生成單-標(biāo)記的種類的nirf染料。dylight750以單體方式結(jié)合未修飾的ctx的事實(shí)啟示其他兩個(gè)賴氨酸的利用是有限的。

顯然ctx中的賴氨酸殘基無一涉及ctx與癌細(xì)胞上其靶標(biāo)的主動(dòng)結(jié)合。這一結(jié)論基于如下觀察結(jié)果：盡管lys15或lys23被ala或arg取代，但是靶向結(jié)合得到保護(hù)，大量cy5.5或其他nirf染料添加到lys27上不會(huì)妨礙與活性位點(diǎn)結(jié)合。

實(shí)驗(yàn)方法

固相肽合成.采用手動(dòng)固相肽合成(spps)合成具有標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基(例如asn(xan)、asp(ochex)、arg(tos)、cys(mebzl)、lys(clz)、ser(bzl)、thr(bzl)和tyr(brz))的肽。將ala和arg取代的線性ctx組裝在不具有硫酯連接基的pam-arg樹脂上。在-5－0℃通過使用氟化氫(hf)與對-甲酚和對-硫代甲酚作為清除劑(9:0.8:0.2(vol/vol)hf:對-甲酚:對-硫代甲酚)將肽從樹脂上裂解，進(jìn)行1.5h。使用c18柱反相-高效液相色譜法(rp-hplc)、通過在215nm監(jiān)測吸收度、使用0-80％溶液b(溶液a:h2o/0.05％三氟乙酸；溶液b:90％ch3cn/10％h2o/0.045％三氟乙酸)梯度純化肽。電噴霧質(zhì)譜(es-ms)證實(shí)合成肽的純度和分子量。

折疊.在室溫用具有ph7.8的0.1mtris-hcl、0.2mnacl、5mm還原型谷胱甘肽/0.5mm氧化谷胱甘肽組成的緩沖水溶液將ala和arg取代的類似物氧化過夜。rp-hplc用于純化肽，并且通過分析型rp-hplc和es-ms證實(shí)純度和分子量。

nmr光譜法.600mhz¹hnmr光譜法用于監(jiān)測肽類似物的三維結(jié)構(gòu)。將肽樣品溶于90％h2o和10％d2o(v/v)。d2o(99.99％)獲自cambridgeisotopelaboratories,woburn,ma。二維nmr實(shí)驗(yàn)包括全相關(guān)光譜法(tocsy)，并且在298°k記錄核歐豪斯效應(yīng)分光光度(noesy)光譜。

血清穩(wěn)定性測定.使用20μm最終肽濃度，在100％人男性血清(sigma)中進(jìn)行血清穩(wěn)定性測定。以14000g將血清離心10min以除去脂質(zhì)成分，并且將上清液在37℃溫育15min，然后測定。在37℃在血清中溫育每種肽，并且在0、1、3、6、10、16和24h取出40μl一式三份等分試樣。用40μl6m脲使每一血清等分試樣猝滅，并且在4℃溫育10min。然后用40μl20％三氟乙酸使每一血清等分試樣猝滅，并且在4℃再溫育10min，以沉淀血清蛋白。以14000g將樣品離心10min并且用rp-hplc、使用溶液b線性梯度(0.3ml/min流速)分析100μl上清液。對照樣品在進(jìn)行相同處理過程的磷酸緩沖鹽水中包含等量的肽。通過在215nm積分檢測肽的回收百分比。

動(dòng)物模型.嚴(yán)格根據(jù)用于試驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和應(yīng)用的nationalinstitutesofhealthguide操作所有動(dòng)物。全部動(dòng)物研究根據(jù)fredhutchinsoncancerresearchcenter'sinstituteofanimalcareandusecommittee批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。使用c57b1/6作為背景的髓母細(xì)胞瘤nd2:smoa1自體小鼠模型(a.r.hallahan等人,"thesmoa1mousemodelrevealsthatnotchsignalingiscriticalforthegrowthandsurvivalofsonichedgehog-inducedmedulloblastomas,"cancerresearch64:7794-7800,2004.b.a.hatton等人"thesmo/smomodel:hedgehog-inducedmedulloblastomawith90％incidenceandleptomeningealspread,"cancerresearch68:1768-1776,2008)用于評價(jià)環(huán)化ctx:cy5.5、k15a_k23actx:cy5.5和k15r_k23rctx:cy5.5的特異性。選擇具有癥狀性髓母細(xì)胞瘤的半合子或純合(稱作nd2:smoa1)小鼠用于在這些研究中登記。使用開放場地籠評價(jià)檢測癥狀。癥狀包括頭傾斜、弓狀姿勢、共濟(jì)失調(diào)、頭蓋骨突出和體重減輕。

離體成像.通過尾靜脈給顯示髓母細(xì)胞瘤癥狀的nd2:smoa1動(dòng)物注射50μl40μmk15a_k23actx:cy5.5或k15r_k23rctx:cy5.5。注射后3天使用co2吸入對小鼠實(shí)施安樂死，并且使用xenogen光譜成像系統(tǒng)(caliper)得到其腦的離體生物光子圖像。然后將腦冷凍在tissue-tek最適切割溫度(oct)化合物(sakura)中，切成12μm切片，并且根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行蘇木精和伊紅(h&e)染色。

盡管示例和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是可以理解，可以在不脫離本發(fā)明精神和范圍的情況下進(jìn)行各種改變。

序列表

<110>弗雷德哈欽森癌癥研究中心

j.m.奧爾森

<120>氯毒素變體、綴合物及其使用方法

<130>fhcr136231

<150>us61/333,556

<151>2010-05-11

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<223>xaa可以為任何氨基酸

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