本發(fā)明涉及一種線粒體定位用于光動力療法的雙光子熒光探針庫及其應(yīng)用，具體涉及一種線粒體定位用于光動力療法的雙光子熒光探針庫的構(gòu)建及其在人類健康疾病檢測領(lǐng)域的應(yīng)用，屬于有機(jī)熒光探針領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

熒光探針是化學(xué)傳感技術(shù)領(lǐng)域在上個世紀(jì)八十年代的一項(xiàng)重大發(fā)現(xiàn)，目前己有愈來愈多的熒光探針應(yīng)用于分子水平上進(jìn)行實(shí)時檢測。熒光檢測技術(shù)由于靈敏度高，操作簡便，可視性強(qiáng)，且對細(xì)胞、生物體的損傷小，成為了用于臨床分析、環(huán)境監(jiān)測、生物分析及生命科學(xué)等領(lǐng)域不可缺少的檢測工具分子熒光探針的檢測對象包括各種離子，小分子，自由基，多肽，酶，甚至還包括溫度，極性，粘度等。低分子量的探針與靶標(biāo)分子相互作用時往往通過化學(xué)反應(yīng)，靜電作用及間接作用力等方式來達(dá)到檢測靶標(biāo)的目的。人們可以使用熒光顯微鏡，熒光光譜儀，流式細(xì)胞儀，熒光活體成像系統(tǒng)等儀器獲取熒光探針檢測的相關(guān)信息，借助熒光成像技術(shù)我們能夠?qū)崟r檢測活細(xì)胞內(nèi)分子或離子的濃度以及生物大分子結(jié)構(gòu)的變化過程，也可以獲得關(guān)于生物組織生理代謝過程的相關(guān)信息，還可以實(shí)現(xiàn)生物活體的熒光成像。

無論是各種疾病的診斷和治療，還是對疾病發(fā)病機(jī)理的研究，都必須要借助于靈敏度高特異性強(qiáng)的檢測手段。熒光檢測特別是有機(jī)小分子熒光探針一方面具有靈敏度高，操作簡便的優(yōu)點(diǎn)，另一方面研究者們能夠根據(jù)需要設(shè)計合成出滿足特定要求的探針分子，基于此，熒光探針和熒光檢測技術(shù)在生命科學(xué)的發(fā)展中起到舉足輕重的。

近年來，生命科學(xué)，環(huán)境科學(xué)，材料科學(xué)，生命醫(yī)學(xué)等學(xué)科的發(fā)展對熒光探針的性能提出了更高的要求。更高的靈敏度和選擇性，更低的檢測限，更高的準(zhǔn)確度和精密度，更完善可信的形態(tài)分析，更快的分析速度和自動化程度，更小的樣品量，更好的生物相容性，微損或無損分析，活體，實(shí)時分析，分析器件小型化，微型化和智能化等。因此，開發(fā)出性能更為優(yōu)良的熒光探針以便用于生物化學(xué)，分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的研究是一項(xiàng)緊迫而意義重大的工作。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的提出一種靈敏度高，操作簡便，可視性強(qiáng)，且對細(xì)胞、生物體的損傷小的線粒體定位用于光動力療法的雙光子熒光探針庫及其應(yīng)用。其具有高的線粒體靶向性，雙光子性能突出。該類熒光探針可以應(yīng)用于人類健康疾病的檢測中，可獲得高效的熒光成像圖。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案是：一種線粒體定位用于光動力療法的雙光子熒光探針庫，以熒光素衍生化合物為主體結(jié)構(gòu)，以多肽鏈基團(tuán)或三苯基膦基團(tuán)為線粒體靶向基團(tuán)，得到線粒體定位的雙光子熒光探針，具體為如下結(jié)構(gòu)中的一種：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的另一技術(shù)方案是：所述雙光子熒光探針庫的探針在波長為800nm的光照射有很強(qiáng)的雙光子信號，在375nm激發(fā)下檢測到單線態(tài)氧濃度增強(qiáng)的信號。

優(yōu)選的，線粒體定位的雙光子熒光探針的單光子激發(fā)波長為g1/g2450nm，r1/r2560nm，y2380nm。

優(yōu)選的，所述的熒光探針庫可應(yīng)用于靶向線粒體，并具有良好的雙光子性能，通過光動力療法使特定的線粒體受損。

有益效果：

線粒體是細(xì)胞的能量工廠，參與眾多生命活動。其中雙光子熒光顯微鏡在活細(xì)胞方面具有成像深度深、背景小和樣品光損傷小等優(yōu)勢。設(shè)計新型的雙光子熒光線粒體示蹤劑，并通過單雙光子熒光活細(xì)胞成像，研究了示蹤劑的活細(xì)胞線粒體成像效果，為進(jìn)一步開發(fā)新一代的雙光子熒光線粒體示蹤劑提供了科學(xué)參考。在激光激發(fā)下檢測到單線態(tài)氧的生成，可用于光動力療法。

本發(fā)明的熒光探針具有較好的線粒體靶向性、化學(xué)穩(wěn)定性和生物兼容性。激光共聚焦成像實(shí)驗(yàn)表明該探針具有較好的細(xì)胞通透性，對細(xì)胞和生物體無毒副作用。

本發(fā)明的熒光示蹤劑在可應(yīng)用于細(xì)胞體系精準(zhǔn)靶向線粒體且雙光子性能優(yōu)越，主要用的活細(xì)胞為hepg2細(xì)胞株。

激光共聚焦成像實(shí)驗(yàn)表明該探針具有較好的細(xì)胞通透性，對細(xì)胞和生物體無毒副作用,可以實(shí)現(xiàn)亞細(xì)胞水平活性氧水平的檢測，并進(jìn)一步應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病及癌癥的研究。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的作進(jìn)一步說明。

圖1為化合物g1,g2,r1,r2，y2在室溫下隨著探針濃度增加的熒光光譜。

圖2為化合物g1,g2,r1,r2，y2在hepg2細(xì)胞中成像圖。

圖3是化合物質(zhì)譜圖(圖中a是化合物g1,g2的質(zhì)譜圖，b是化合物r1,r2的質(zhì)譜圖)。

圖4是化合物g2,y2的光動力療法細(xì)胞成像圖。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明，下面通過具體的實(shí)施例來具體說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

實(shí)施例1:特異性靶向線粒體熒光探針。記為化合物g1，結(jié)構(gòu)式如下：

在25ml的圓底燒瓶中加入化合物4,4'-((1e，1'e)-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)嘧啶-4,6-二基)雙(乙烯-2,1-二基))雙，n-二乙基苯胺)(30μl,40mm)和疊氮化合物(r)-6-氨基-2-((r)-2-((s)-2-((r)-2-(4-疊氮基丁酰氨基)-3-環(huán)己基丙酰胺基)-5-胍基戊酰氨基)-3-環(huán)己基丙酰胺基)己酰胺(10μl,40mm)，將8μlcuso4·5h2o(32mm儲備液)和40μl三-[芐基三唑基甲基]-胺(tbta)(10mm儲備液)加入48μldmso/h2o(1:1)中。將所得溶液混合，將管加蓋并在室溫下?lián)u動2天。

實(shí)施例2：特異性靶向線粒體熒光探針。記為化合物r1，結(jié)構(gòu)式如下：

在25ml的圓底燒瓶中加入熒光素衍生化合物4,4'-((1e，1'e-(2-(丙-2-炔-1-基氧基)嘧啶-4,6-二基)雙(乙烯-2,1-二基))雙，n-二乙基苯胺)(10μl,10mmol)和疊氮化合物(r)-6-氨基-2-((r)-2-((s)-2-((r)-2-(4-疊氮基丁酰氨基)-3-環(huán)己基丙酰胺基)-5-胍基戊酰氨基)-3-環(huán)己基丙酰胺基)己酰胺(10μl,40mm)，將8μlcuso4·5h2o(4mm儲備液)和40μl三-[芐基三唑基甲基]-胺(tbta)(10mm儲備液)加入48μldmso/h2o(1:1)中。將所得溶液混合，將管加蓋并在室溫下?lián)u動2天。

實(shí)施例3:特異性靶向線粒體熒光探針。記為化合物g2，結(jié)構(gòu)式如下：

將熒光素衍生化合物(16μl,20mm)和4-疊氮丁基三苯基膦(8μl,20mm)依次加入到3ml的乙腈中，常溫攪拌8小時，冷卻抽濾，除去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純得到目標(biāo)產(chǎn)物。

實(shí)施例4:特異性靶向線粒體熒光探針。記為化合物r2，結(jié)構(gòu)式如下：

將熒光素衍生化合物(20μl,10mm)和4-疊氮丁基三苯基膦(10μl,40mm)依次加入到3ml的乙腈中，常溫攪拌8小時，冷卻抽濾，除去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純得到目標(biāo)產(chǎn)物。

實(shí)施例5：特異性靶向線粒體熒光探針。記為化合物y2，結(jié)構(gòu)式如下：

加入6-(二甲基氨基)萘并[2,3-c]呋喃-1,3-二酮100mg，溴丙胺200mg，4ml醋酸，在油浴120℃下回流10h。用硅膠柱進(jìn)行提純(洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯＝5:1)，得到(3-溴丙基)-6-(二甲基氨基)-1h-苯并[f]異吲哚-1,3(2h)-二酮。¹h-nmr(300mhz,(cd3)2so):δ＝8.222(1h,s),8.124(1h,s),7.991(1h,d,j＝9.3hz),7.359(1h,m),7.238(1h,s),3.718(2h,m),3.567(2h,m),3.088(6h,s),2.140(2h,m)；¹³c-nmr(75mhz,(cd3)2so):δ＝167.566,167.463,150.144,136.882,127.837,126.161,123.903,121.932,121.636,117.580,107.287,35.888,31.601,30.872,29.513,28.641.

分批加入三苯基膦，保證其過量；油浴120℃回流過夜。若反應(yīng)結(jié)束后，三苯基膦固體依舊很多，用甲醇洗滌，收集溶液。粗產(chǎn)物用硅膠柱進(jìn)行分離提純(洗脫劑為乙酸乙酯:甲醇＝5:1)。由于化合物y1003極性十分大，所以選用短硅膠柱過柱，硅膠選用細(xì)硅膠可以提高純度。¹h-nmr(300mhz,(cd3)2so):δ＝8.207(1h,s),8.114(1h,s),7.989(1h,d,j＝9.3hz),7.877(3h,m),7.342(1h,d,j＝11.1hz),7.236(1h,s),3.761(4h,m),3.079(6h,s),1.950(2h,m)；¹³c-nmr(75mhz,(cd3)2so):δ＝167.616,167.512,150.021,133.382,129.829,127.933,126.328,123.892,122.054,121.634,118.479,117.563,117.340,107.227,37.371,37.098,20.747,18.434,17.746.

實(shí)施例7：

1.化合物g1,g2,r1,r2，y2在室溫下隨著探針濃度增加的熒光光譜(圖1)：

用緩沖溶液配制1-10um的探針，用熒光分光光度法分別測試，并繪制g1,g2,r1,r2，y2不同濃度的熒光光譜圖。結(jié)果描述：探針的熒光強(qiáng)度隨著濃度的增加而增加，并不會因?yàn)樘结槤舛仍黾影l(fā)生淬滅。

2.化合物g1,g2,r1,r2，y2在hepg2細(xì)胞中成像圖(圖2)：

向含有hepg2細(xì)胞的培養(yǎng)皿中加含有探針的細(xì)胞培養(yǎng)液，探針在培養(yǎng)液中的濃度為1um，與細(xì)胞培養(yǎng)液混合均勻后，染色2個小時后，用ph＝7.35的緩沖溶液沖洗3次，將該培養(yǎng)皿在共聚焦顯微鏡下成像。結(jié)果描述：(1)/(7)是有細(xì)胞的明場圖，(2)/(8)是有細(xì)胞的加探針的單光子照射的暗場圖，(3)/(9)是有細(xì)胞的加探針的雙光子照射的暗場圖，(4)/(10)是有細(xì)胞的加商業(yè)線粒體探針的暗場圖，(5)/(11)是明場圖和單光子暗場圖的擬合重疊圖，從圖中可以發(fā)現(xiàn)探針成功進(jìn)入了細(xì)胞，(6)/(12)是雙光子暗場圖和商業(yè)線粒體探針暗場圖的擬合重疊圖，從圖中我們可以發(fā)現(xiàn)所設(shè)計的探針成功地靶向了線粒體，并具有優(yōu)秀的雙光子性能。

3.化合物g1,g2,r1,r2的質(zhì)譜圖(圖3)

4.化合物g2,y2的光動力療法細(xì)胞成像圖(圖4)：

向含有hepg2細(xì)胞的培養(yǎng)皿中加含有探針的細(xì)胞培養(yǎng)液，探針在培養(yǎng)液中的濃度為1um，與細(xì)胞培養(yǎng)液混合均勻后，染色2個小時后，用ph＝7.35的緩沖溶液沖洗3次，將該培養(yǎng)皿在共聚焦顯微鏡下成像。結(jié)果描述：圖(1)(3)(5)分別是在800nm照射前加了化合物g2，y2和dmso(參比)的明場圖，圖中右下角是同種情況下的單光子的暗場成像圖；圖(2)(4)(6)分別是在800nm照射后對應(yīng)的明場和暗場圖，可以看出加了化合物g2，y2的細(xì)胞在雙光子照射一段時間后的區(qū)域，呈現(xiàn)出很大程度的損傷，而未加示蹤劑的參比中的細(xì)胞完好無損。說明了示蹤劑g2，y2具有應(yīng)用于光動力療法的潛力。

本發(fā)明的不局限于上述實(shí)施例所述的具體技術(shù)方案，凡采用等同替換形成的技術(shù)方案均為本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。