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一種海洋軟體動物原代細胞分離與培養(yǎng)試劑盒及其用途的制作方法

文檔序號:12793910閱讀:591來源:國知局
一種海洋軟體動物原代細胞分離與培養(yǎng)試劑盒及其用途的制作方法與工藝

本發(fā)明涉及海洋軟體動物細胞培養(yǎng),尤其是涉及一種海洋軟體動物原代細胞分離與培養(yǎng)試劑盒及其用途。



背景技術:

細胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物工程技術中的重要技術與常用方法之一,廣泛應用于細胞代謝、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)表達、細胞環(huán)境應急與免疫機制、藥物篩選與生物藥物表達生產(chǎn)等研究領域。在植物、哺乳動物、魚類和昆蟲的研究中,細胞與組織培養(yǎng)已經(jīng)成為不可或缺的研究手段,特別是在相關基因表達調(diào)控機制、細胞信號轉(zhuǎn)導通路、細胞環(huán)境應激機制、以及遺傳與突變研究等方面,細胞培養(yǎng)已經(jīng)成為無法替代的手段,也是促進現(xiàn)代生物技術快速發(fā)展的重要技術。但是,在海洋軟體動物細胞培養(yǎng)領域,因為海洋軟體動物細胞形態(tài)、功能分化、結構與營養(yǎng)需求等方面的特殊性,至今仍然沒有建立起永生細胞系,原代細胞培養(yǎng)仍然是主要依托的方法([1]villenaaj.revfishbiolfish,2003,13:111;[2]李建軍,黃寶玉.海洋通報,2015(3):247-251)。然而,即使是原代細胞培養(yǎng),目前可選擇用于海洋軟體動物細胞分離與原代培養(yǎng)的試劑盒相關產(chǎn)品依然十分有限,嚴重影響了海洋軟體動物細胞學相關研究與應用技術的發(fā)展。

軟體動物因為應用廣泛,其細胞培養(yǎng)研究是無脊椎動物中開展的最早最廣泛的,培養(yǎng)對象包括一些養(yǎng)殖的經(jīng)濟貝類,組織細胞包括胚胎、鰓、外套膜、血細胞和心肌等多種組織來源。在20世紀70年代,hansen等([3]rinkevichb.jbiotechnol,1999,70:133)從淡水蝸牛成功建立了胚胎細胞系bge,這也是水生無脊椎動物中唯一細胞系。但是,幾十年過去了,海洋軟體動物至今還沒有成功建立一個細胞系,其細胞培養(yǎng)遭遇長期的失敗,大部分細胞培養(yǎng)的嘗試,通常在體外只能培養(yǎng)比較短的時間,同時微生物污染一直威脅著原代細胞培養(yǎng),也是最終培養(yǎng)失敗的主要原因之一。

至今,海洋軟體動物細胞培養(yǎng)主要集中在原代細胞培養(yǎng)條件的改進方面,特別是培養(yǎng)基的優(yōu)化。相對較為成功的例子包括,merwe等([4]vandermerwem,auzoux-bordenaves,nieslerc.cytotechnology,2010,62(3):265-277.)報道成果原代培養(yǎng)了鮑外套膜血淋巴等組織細胞。odintsova等([5]odintsovana,dyachukva,nezlinlp.cellandtissueresearch,2010,339(3):625-637)報道將mytilustrossulus的幼體細胞原代培養(yǎng)了70多天。

目前,研究人員普遍認識到海洋軟體動物細胞的營養(yǎng)需求和生長條件與脊椎動物差異顯著。海洋軟體動物原代細胞培養(yǎng)條件優(yōu)化多集中改善原代細胞培養(yǎng)的營養(yǎng)因子與細胞生長因子。l15基礎培養(yǎng)基是公認的相對比較適合軟體動物細胞培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)基,胎牛血清也普遍被用于海洋軟體動物的細胞培養(yǎng),小牛血清或者待培養(yǎng)動物的組織提取液或血淋巴液也被報道能促進原代細胞的生長與分裂,他們的使用量大多控制在5-20%([6]chensnetal.methodscellsci,1999,21:183)。

雖然研究者們對海洋軟體動物細胞培養(yǎng)開展了大量探索性的研究工作,但是目前仍然沒有適用于海洋軟體動物細胞培養(yǎng)的普適性方法、培養(yǎng)基以及試劑盒,海洋軟體動物細胞培養(yǎng)工作進展十分緩慢。多種海洋軟體動物是我國重要的海洋經(jīng)濟養(yǎng)殖種類,具有重要的食用價值和經(jīng)濟價值,有些還有很好的藥用價值,在基礎海洋水產(chǎn)生物的研究中也具有重要地位。因此,海洋軟體動物的基礎生物學、分子生物學、遺傳學、基因功能學、育種學等各領域的研究方興未艾,非常需要穩(wěn)定的細胞培養(yǎng)體系提供不可或缺的研究手段,在缺乏細胞系的情況下,發(fā)明可用于快速建立海洋軟體動物細胞分離與原代細胞培養(yǎng)的方法和相應的快捷試劑盒,具有重要意義。



技術實現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的在于提供一種海洋軟體動物原代細胞分離與培養(yǎng)試劑盒及其用途,

所述海洋軟體動物原代細胞分離與培養(yǎng)試劑盒設有包裝盒、洗液i瓶、洗液ii瓶、洗液iii瓶、溶液a瓶、溶液b瓶、溶液c瓶、使用說明書;

所述洗液i瓶、洗液ii瓶、洗液iii瓶、溶液a瓶、溶液b瓶、溶液c瓶、使用說明書設在包裝盒內(nèi);

所述洗液i瓶內(nèi)裝有洗液i,所述洗液i含有100μg/ml氨芐青霉素、100μg/ml鏈霉素、60μg/ml青霉素、8μg/ml制霉素、50μg/ml慶大霉素的無菌濾過海水;

所述洗液ii瓶內(nèi)裝有洗液ii,所述洗液ii含有200μg/ml氨芐青霉素、200μg/ml鏈霉素、120μg/ml青霉素、16μg制霉素、100μg/ml慶大霉素的無菌濾過海水;

所述洗液iii瓶內(nèi)裝有洗液iii,所述洗液iii用無菌超純水配制含20.8g/l葡萄糖、22.5g/l氯化鈉、3.36g/ledta-2na、8g/l枸鹽酸鈉ph=7.25的與海水等滲的螯合緩沖液;

所述溶液a瓶內(nèi)裝有溶液a,所述溶液a是用氯化鈉調(diào)節(jié)滲透壓摩爾濃度為1000mosmol/kg的胰蛋白酶消化液;

所述溶液b瓶內(nèi)裝有溶液b,所述溶液b是在l-15細胞培養(yǎng)液中添加氨芐青霉素100μg/ml、青霉素60μg/ml、鏈霉素100μg/ml、制霉素8μg/ml、慶大霉素50μg/ml、葡萄糖20.8g/l、氯化鈉20.2g/l、氯化鉀0.54g/l、氯化鎂3.9g/l、氯化鈣0.6g/l、硫酸鎂1g/l、人重組表皮生長因子10ng/ml、海綿吡咯醛烷烴100ng/ml、谷氨酰胺2mmol/l;

所述溶液c瓶內(nèi)裝有溶液c,所述溶液c是含透析fbs與透析血淋巴液體積比為2︰1的血清系統(tǒng)。

所述洗液i最好分裝入3瓶100ml無菌密封瓶,貼上標簽,-20~4℃保存。

所述洗液ii最好分裝入3支100ml無菌密封瓶,貼上標簽,-20~4℃保存。

所述洗液iii最好分裝入50ml無菌密封瓶,貼上標簽,-20~4℃保存。

所述溶液a最好分裝入15ml無菌密封瓶,貼上標簽,-20~4℃保存。

所述溶液b最好分裝入50ml無菌密封瓶,貼上標簽,-20~4℃保存。

所述溶液c最好分裝入10ml無菌密封瓶,貼上標簽,-20~4℃保存。

所述海洋軟體動物原代細胞分離與培養(yǎng)試劑盒可在多種海洋軟體動物多種體細胞的無菌分離與體外原代培養(yǎng)中應用,所述多種海洋軟體動物多種體細胞包括牡蠣、鮑、文蛤、扇貝、貽貝等軟體動物的鰓、外套膜、肌肉、血淋巴等多種組織細胞。

本發(fā)明通過對海洋軟體動物細胞分離和原代培養(yǎng)的條件進行優(yōu)化,獲得了適合海洋軟體動物細胞分離與原代培養(yǎng)適合條件,解決了現(xiàn)有技術無法實現(xiàn)的海洋軟體動物細胞快速分離與原代細胞無菌培養(yǎng)體系快速建立的問題,建立海洋軟體動物原代細胞快速分離與原代細胞無菌方法,給出海洋軟體動物原代細胞分離與培養(yǎng)試劑盒。

本發(fā)明的有益效果:使用本發(fā)明可以快速簡便地將海洋軟體動物細胞進行體外分離制備與培養(yǎng),培養(yǎng)的細胞存活率高,受微生物污染率低,細胞可傳代和繼代培養(yǎng)時間長達20~90天。本發(fā)明的主要技術原理是通過使用含有多種廣譜抗生素聯(lián)用的無菌濾過海水經(jīng)8次短(30s)時間劇烈震蕩,對海洋軟體動物組織進行清洗即可除去幾乎所有附著于組織上的微生物,大大減少微生物污染的概率;海水等滲的金屬離子螯合緩沖液和與海水等滲的胰蛋白酶消化液,都能夠保證在分離培養(yǎng)過程中,使海洋軟體動物細胞處于穩(wěn)定性滲透壓環(huán)境中;添加細胞生長因子及與細胞相近滲透壓和ph的細胞培養(yǎng)液為細胞提供了合適的生長條件,且培養(yǎng)過程僅用少量無菌離心管、無菌濾紙等常用耗材,使得細胞培養(yǎng)實驗易準備,使原本復雜的原代細胞制備和培養(yǎng)實驗,變得非常簡便,同時還能保障原代細胞的高活性和低污染率。

附圖說明

圖1是本發(fā)明中試劑盒包裝與內(nèi)含物示意圖。

圖2是用本發(fā)明制備的牡蠣鰓細胞體外原代培養(yǎng)1-7天細胞密度變化顯微圖。

圖3是使用本發(fā)明制備的牡蠣鰓細胞體外原代培養(yǎng)1-7天細胞密度變化趨勢圖。

圖4是用本發(fā)明分離牡蠣鰓細胞體外原代培養(yǎng)傳代21天細胞活力變化趨勢圖。

圖5是使用本發(fā)明分離雜色鮑鰓細胞體外連續(xù)原代培養(yǎng)30天細胞狀態(tài)顯微圖(100×)。在圖5中,a為剛分離并濾過的細胞;b為培養(yǎng)3天的細胞;c為培養(yǎng)6天的細胞;d為培養(yǎng)9天的細胞;e為培養(yǎng)15天的細胞;f為培養(yǎng)25天的細胞;g為培養(yǎng)30天的細胞。

圖6是使用本發(fā)明進行雜色鮑外套膜原代培養(yǎng)8天后產(chǎn)生的貼壁細胞克隆(200×)。

圖7是使用本發(fā)明制備的雜色鮑細胞體外原代培養(yǎng)培養(yǎng)20天后,用75%乙醇固定,pi染色,流式細胞儀分析其前散和側(cè)散熒光比例,對細胞類群進行分類。

圖8是使用本發(fā)明制備的使用本發(fā)明制備的雜色鮑細胞體外原代培養(yǎng)20天細胞類群分布與數(shù)量的流式分析。

圖9是使用本發(fā)明制備的雜色鮑細胞體外原代培養(yǎng)20天細胞類群周期分布的流式分析。

具體實施方式

本發(fā)明結合附圖和實施例作進一步的說明。

參見圖1,所述海洋軟體動物原代細胞分離與培養(yǎng)試劑盒實施例設有包裝盒1、3支洗液i瓶2、3支洗液ii瓶3、3支洗液iii瓶4、1支溶液a瓶5、1支溶液b瓶6、1支溶液c瓶7、使用說明書8。

所述、3支洗液i瓶2、3支洗液ii瓶3、3支洗液iii瓶4、1支溶液a瓶5、1支溶液b瓶6、1支溶液c瓶7、使用說明書8設在包裝盒1內(nèi)。

所述洗液i瓶內(nèi)裝有洗液i,所述洗液i含有100μg/ml氨芐青霉素、100μg/ml鏈霉素、60μg/ml青霉素、8μg/ml制霉素、50μg/ml慶大霉素的無菌濾過海水;

所述洗液ii瓶內(nèi)裝有洗液ii,所述洗液ii含有200μg/ml氨芐青霉素、200μg/ml鏈霉素、120μg/ml青霉素、16μg制霉素、100μg/ml慶大霉素的無菌濾過海水;

所述洗液iii瓶內(nèi)裝有洗液iii,所述洗液iii用無菌超純水配制含20.8g/l葡萄糖、22.5g/l氯化鈉、3.36g/ledta-2na、8g/l枸鹽酸鈉ph=7.25的與海水等滲的螯合緩沖液;

所述溶液a瓶內(nèi)裝有溶液a,所述溶液a是用氯化鈉調(diào)節(jié)滲透壓摩爾濃度為1000mosmol/kg的胰蛋白酶消化液;

所述溶液b瓶內(nèi)裝有溶液b,所述溶液b是在l-15細胞培養(yǎng)液中添加氨芐青霉素100μg/ml、青霉素60μg/ml、鏈霉素100μg/ml、制霉素8μg/ml、慶大霉素50μg/ml、葡萄糖20.8g/l、氯化鈉20.2g/l、氯化鉀0.54g/l、氯化鎂3.9g/l、氯化鈣0.6g/l、硫酸鎂1g/l、人重組表皮生長因子10ng/ml、海綿吡咯醛烷烴100ng/ml、谷氨酰胺2mmol/l;

所述溶液c瓶內(nèi)裝有溶液c,所述溶液c是含透析fbs與透析血淋巴液體積比為2︰1的血清系統(tǒng)。

以下給出具體實施例。

實施例1

所述海洋軟體動物原代細胞分離與培養(yǎng)試劑盒由包裝盒、3支100ml洗液i、3支100ml洗液ii、50ml洗液iii、15ml溶液a、50ml溶液b、10ml溶液c、使用說明書組成。

其中其中洗液i是含有100μg/ml氨芐青霉素、100μg/ml鏈霉素、60μg/ml青霉素、8μg/ml制霉素、50μg/ml慶大霉素的無菌濾過海水,分裝入3支100ml無菌密封瓶,貼上標簽,-20~4℃保存。

洗液ii是含有200μg/ml氨芐青霉素、200μg/ml鏈霉素、120μg/ml青霉素、16μg制霉素、100μg/ml慶大霉素的無菌濾過海水,分裝入3支100ml無菌密封瓶,貼上標簽,-20~4℃保存。

洗液iii是用無菌超純水配制含20.8g/l葡萄糖、22.5g/l氯化鈉、3.36g/ledta-2na、8g/l枸鹽酸鈉ph=7.25的與海水等滲的螯合緩沖液,分裝入50ml無菌密封瓶,貼上標簽,-20~4℃保存。

溶液a是用氯化鈉調(diào)節(jié)滲透壓為1200mosmol/kg的胰蛋白酶消化液,分裝入15ml無菌密封瓶,貼上標簽,-20~4℃保存。

溶液b是在l-15細胞培養(yǎng)液中添加氨芐青霉素100μg/ml、青霉素60μg/ml、鏈霉素100μg/ml、制霉素8μg/ml、慶大霉素50μg/ml、葡萄糖20.8g/l、氯化鈉20.2g/l、氯化鉀0.54g/l、氯化鎂3.9g/l、氯化鈣0.6g/l、硫酸鎂1g/l、人重組表皮生長因子10ng/ml、吡咯醛烷烴10ng/ml、2mmol/l谷氨酰胺,分裝入50ml無菌密封瓶,貼上標簽,-20~4℃保存。

溶液c是含透析fbs與透析血淋巴液比例為2:1的血清系統(tǒng),分裝入10無菌密封瓶,貼上標簽,-20~4℃保存。

需自準備材料:無菌50ml塑料清洗管6支、無菌15ml離心管2支)、直徑35/60mm無菌培養(yǎng)板1個,無菌鑷子和眼科剪各2把、20cm無菌鑷子1把,0.1/1ml移液槍及滅菌槍頭一套,50ml無菌試管、75%消毒酒精適量,15ml、50ml離心管架各一個,小型臺式渦旋震蕩器一臺。

實施例2

先在6支50ml無菌離心管中分別倒入洗液i和洗液ii15ml各3支,再將洗液iii倒入另外兩支15ml無菌離心管各5ml,將其按從洗液i到洗液iii的順序編號1、2、3、4、5、6、7、8,并立刻蓋上蓋子。

使用無菌眼科手術剪和鑷子從軟體動物上取下較為潔凈的組織塊約200mg,剪成1cm2大小,小心放入含10ml洗液i的無菌試管中,充分渦旋震蕩清洗30s,重復3次。

小心取出組織塊,放入含10ml洗液ii的無菌試管中,充分渦旋震蕩清洗30s,重復3次。

小心取出組織塊,夾入含5ml洗液iii的15ml無菌試管中,充分渦旋震蕩清洗10s,重復2次。

取出組織塊放入無菌消化盤中,用無菌眼科手術剪將組織塊盡量剪碎,加入1.5ml酶解液,在消化時使用1ml移液器(移液槍頭剪去尖端)反復吸打,約5~8min后,組織塊消化完全,消化液無明顯大顆粒即可。

消化液中加入基礎培養(yǎng)液5400μl,血清系統(tǒng)600μl,用移液器吸打混勻。

根據(jù)實驗需要對以上細胞混懸液用溶液c或培養(yǎng)基進行稀釋,分盤培養(yǎng),或進行過濾、計數(shù)等實驗。

實施例3

取牡蠣組織標本,操作步驟同實施例2,最終獲得懸浮圓球狀牡蠣鰓細胞。其連續(xù)原代培養(yǎng)、繼代、傳代21天的細胞密度、細胞活性變化趨勢、以及細胞顯微圖請見圖2~4。

利用本發(fā)明分離雜色鮑鰓細胞體外連續(xù)原代培養(yǎng)30天細胞活性變化如表1所示。

表1

使用本發(fā)明分離雜色鮑鰓細胞體外連續(xù)原代培養(yǎng)30天細胞狀態(tài)顯微圖(100×)參見圖5,使用本發(fā)明進行雜色鮑外套膜原代培養(yǎng)8天后產(chǎn)生的貼壁細胞克隆(200×)參見圖6。

使用本發(fā)明制備的雜色鮑細胞體外原代培養(yǎng)培養(yǎng)20天后,用75%乙醇固定,pi染色,流式細胞儀分析其前散和側(cè)散熒光比例,對細胞類群進行分類參見圖7,細胞經(jīng)75%乙醇固定過夜,pi染色30min,rna酶處理30min,流式細胞儀分析前散熒光(反應細胞大小)和側(cè)散熒光(反應細胞內(nèi)含顆粒大小與數(shù)量)比例,據(jù)此對細胞類群進行分類分析,表明培養(yǎng)的細胞屬于同一類群,同時有少量聚集和細胞碎片產(chǎn)生。

使用本發(fā)明制備的使用本發(fā)明制備的雜色鮑細胞體外原代培養(yǎng)20天細胞類群分布與數(shù)量的流式分析參見圖8,細胞經(jīng)75%乙醇固定過夜,pi染色30min,rna酶處理30min,流式細胞儀分析,fl3通道采集pi熒光信號強度,分析細胞染色體倍性,表明體外培養(yǎng)的細胞具有不同的染色體倍數(shù),處于不同的細胞周期(粉紅色為分裂后的單倍體細胞,綠色為處于染色體復制過程中的細胞,尚未到藍色所表示的染色體復制完成的二倍體階段,黃色可能為二聚體細胞)。據(jù)此進一步表明培養(yǎng)的細胞屬于同一類群,而且都在增殖生長中,保持較好的生長狀態(tài)。

使用本發(fā)明制備的雜色鮑細胞體外原代培養(yǎng)20天細胞類群周期分布的流式分析參見圖9,細胞經(jīng)75%乙醇固定過夜,pi染色30min,rna酶處理30min,流式細胞儀分析,細胞大部分處于g0g1期,部分處于亞g1期,并有少量細胞碎片,s期和m期的細胞較少,表明培養(yǎng)的細胞處于同一類群,同時生長節(jié)奏較為一致。

本發(fā)明克服了當前海洋軟體動物細胞制備培養(yǎng)過程費時、活性低、易污染的問題。本發(fā)明的海洋軟體動物原代細胞分離與培養(yǎng)試劑盒操作簡便,在短時間內(nèi)(30min)即可完成海洋軟體動物原代細胞的分離制備與體外培養(yǎng),極大程度地提高了原代細胞培養(yǎng)的存活率,受微生物污染的概率低,建立原代細胞培養(yǎng)體系成功率高。海洋軟體動物原代細胞分離與培養(yǎng)試劑盒適用于多種海洋軟體動物多種體細胞的培養(yǎng),包括牡蠣、鮑、文蛤、扇貝、貽貝等軟體動物的鰓、外套膜、肌肉、血淋巴等多種組織細胞的無菌分離與體外原代培養(yǎng)。

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