本發(fā)明屬于藥物化學領(lǐng)域，具體涉及一類水溶性的檸檬苦素衍生物，它們的制備方法，以及含有這些化合物的藥物組合物及其在治療疼痛和炎癥方面的用途。

背景技術(shù)：

疼痛已被現(xiàn)代醫(yī)學列為繼體溫、脈搏、呼吸、血壓之后的第五大生命體征。疼痛如不及時有效處理，將嚴重影響日常的生活質(zhì)量和社會安定。盡管鎮(zhèn)痛藥的研究有了長足的進步，但無論是用于輕、中度疼痛的非甾體解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，還是用于中、重度疼痛的止痛劑，都有著各自的副作用和局限性，有的還面臨潛在的濫用問題。

類風濕關(guān)節(jié)炎是一種常見的關(guān)節(jié)炎癥，發(fā)病原因還不是很明確，它是一種慢性病，是以炎性滑膜炎為主的系統(tǒng)性疾病。目前臨床治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的主要藥物包括非甾體抗炎藥、免疫抑制劑、生物制劑和小分子靶向藥。其中非甾體抗炎藥可緩解癥狀，但藥效較弱，胃腸道副作用大；免疫抑制劑如甲氨蝶呤藥效明確，作用持久，但起效緩慢，毒性大，不良反應多且難以耐受，需長期進行血藥濃度監(jiān)測；生物制劑如阿達木單抗療效明確，但價格昂貴，難以普及；小分子靶向藥如托法替尼2012年批準上市，但隨著臨床應用的深入和范圍擴大，眾多安全性問題逐漸顯現(xiàn)，產(chǎn)品標簽亦有安全黑框警告，主要為增加腫瘤、感染風險。因此，尋找安全、有效、副作用小的鎮(zhèn)痛和抗炎藥物具有重大的現(xiàn)實意義和社會意義。

檸檬苦素類似物是高度氧化的四環(huán)三萜類化合物，廣泛存在于柑橘類等蕓香科和楝科植物家族中。迄今已分離得到大約300多種檸檬苦素類似物，檸檬苦素(limonin)是這類化合物中的代表。研究發(fā)現(xiàn)檸檬苦素化合物在鎮(zhèn)痛、抗炎、抗癌、抗菌等方面具有作用，但是由于其作用不夠強，水溶性差，生物利用度低，影響了其臨床應用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明公開了通式i和ii的化合物，經(jīng)藥理實驗證明，本發(fā)明的化合物具有較好的鎮(zhèn)痛、抗炎活性。因此，本發(fā)明的通式i和ii的化合物可用于臨床緩解疼痛和消除炎癥的作用。

其中：

r代表

r¹代表h、ch3、ch2ch3、ch2oh或oh。

x代表ch2、o、nh、n-ch3或n-coch3。

r²、r³各自獨立地代表h或c1～c6的烷基。

r⁴代表h、ch3、f、cl或br。

m＝1～5。

r優(yōu)選代表r¹優(yōu)選代表h或ch3，x優(yōu)選代表ch2、o、nh或n-ch3，m優(yōu)選＝1～4。

r還優(yōu)選代表r²、r³優(yōu)選各自獨立地代表c1～c3的烷基，m＝1～4。

通式i和ii的化合物可與藥學上可接受的酸形成酸加成鹽，所述酸包括氯化氫、溴化氫、硫酸、磷酸、碳酸、草酸、檸檬酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、馬來酸、甲磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸或阿魏酸。

本發(fā)明通式i的化合物及其藥學上可接受的酸加成鹽(i.a)可用下列方法制備：

其中：

由化合物iii(檸檬苦素)經(jīng)酰化制備化合物iv的過程，所用的酰化劑為氯乙酰氯、3-氯丙酰氯、4-氯丁酰氯、5-氯戊酰氯或6-氯己酰氯，?；瘎┮部梢允且宜狒?、丙酸酐、丁酸酐、戊酸酐或己酸酐；催化劑為三氯化鋁或氯化鋅；溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯苯、硝基苯。

由化合物iv經(jīng)取代制備化合物i的過程，所用的胺為其中r¹選自h、ch3、ch2ch3、ch2oh或oh，x選自ch2、o、nh、n-ch3或n-coch3，r²、r³選自h或c1～c6的烷基，r⁴選自h、ch3、f、cl或br；縛酸劑為碳酸鉀、碳酸鈉、三乙胺或反應物胺本身；溶劑為四氫呋喃、乙腈、丙酮、乙酸乙酯，或任意兩者的混合溶劑。

由化合物i與酸a成鹽制備酸加成鹽i·a的過程，所用的酸a為氯化氫、溴化氫、硫酸、磷酸、碳酸、草酸、檸檬酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、馬來酸、甲磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸或阿魏酸；溶劑為乙酸乙酯、丙酮、四氫呋喃、二氯甲烷、乙醇、甲醇或異丙醇，或任意兩者的混合溶劑。

本發(fā)明通式ii的化合物及其藥學上可接受的酸加成鹽(ii.a)可用下列方法制備：

其中：

由化合物v(脫氧檸檬苦素，desoxylimonin)經(jīng)?；苽浠衔飗i的過程，所用的?；瘎槁纫阴Ｂ?、3-氯丙酰氯、4-氯丁酰氯、5-氯戊酰氯或6-氯己酰氯，?；瘎┮部梢允且宜狒⒈狒?、丁酸酐、戊酸酐或己酸酐；催化劑為三氯化鋁或氯化鋅；溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯苯、硝基苯。

由化合物vi經(jīng)取代制備化合物ii的過程，所用的胺為其中r¹選自h、ch3、ch2ch3、ch2oh或oh，x選自ch2、o、nh、n-ch3或n-coch3，r²、r³選自h或c1～c6的烷基，r⁴選自h、ch3、f、cl或br；縛酸劑為碳酸鉀、碳酸鈉、三乙胺或反應物胺本身；溶劑為四氫呋喃、乙腈、丙酮、乙酸乙酯，或任意兩者的混合溶劑。

由化合物ii與酸a成鹽制備酸加成鹽ii·a的過程，所用的酸a為氯化氫、溴化氫、硫酸、磷酸、碳酸、草酸、檸檬酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、馬來酸、甲磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸或阿魏酸；溶劑為乙酸乙酯、丙酮、四氫呋喃、二氯甲烷、乙醇、甲醇或異丙醇，或任意兩者的混合溶劑。

本發(fā)明在于提供一種藥物組合物，其包括本發(fā)明的化合物i或ii或其鹽i·a或ii·a和藥學上可接受的載體。

本發(fā)明所述的化合物或其鹽可以添加藥學上可接受的載體制成常見的藥用制劑，如片劑、膠囊、粉劑、糖漿、液劑、懸浮劑、凍干粉針、針劑，可以加入香料、甜味劑、液體或固體填料或稀釋劑等常用藥用輔料。

本發(fā)明所述的化合物在臨床上的給藥方式可以采用口服、注射、外用等方式。

本發(fā)明同時包括通式i或ii的化合物的立體異構(gòu)體、水合物、溶劑合物或結(jié)晶，它們與化合物具有同樣的藥理藥效。在制備治療疼痛或炎癥藥物中的應用。

本發(fā)明部分化合物如下：

下面是本發(fā)明部分化合物的藥理實驗及結(jié)果：

為了給藥方便，藥理實驗采用i和ii類化合物的鹽酸鹽。

藥效學實驗證明，本發(fā)明化合物具有抗炎和鎮(zhèn)痛效果。下面是部分藥效學試驗及結(jié)果：(1)小鼠醋酸扭體實驗

試驗方法：

icr小鼠，雌雄各半，18～22g，隨機分為模型組、阿司匹林組、檸檬苦素組、脫氧檸檬苦素組、本發(fā)明化合物組，每組8只。各組灌胃給藥1小時后腹腔注射0.7％乙酸0.1ml/10g，模型組腹腔注射0.7％乙酸0.1ml/10g，立即觀察并記錄15分鐘內(nèi)小鼠扭體次數(shù)。結(jié)果見表1和表2。

扭體次數(shù)抑制率＝(模型組扭體次數(shù)均值-給藥組扭體次數(shù)均值)/模型組扭體次數(shù)均值*100％

表1檸檬苦素衍生物對小鼠醋酸扭體次數(shù)的影響

注：^*p<0.05，^**p<0.01vs模型組。

表2脫氧檸檬苦素衍生物對小鼠醋酸扭體次數(shù)的影響

注：^*p<0.05，^**p<0.01vs模型組。

小鼠醋酸扭體實驗結(jié)果表明，腹腔注射0.7％醋酸0.1ml/10g后可引起小鼠的腹腔疼痛，出現(xiàn)扭體反應，本發(fā)明部分化合物對小鼠的扭體反應具有明顯抑制作用。改造后的化合物的鎮(zhèn)痛活性較檸檬苦素或脫氧檸檬苦素均有所提高，總體是檸檬苦素系列衍生物活性高于脫氧檸檬苦素系列衍生物，且在檸檬苦素系列衍生物中碳鏈長的化合物活性優(yōu)于碳鏈短的化合物，其中化合物i-5·hcl、i-6·hcl、i-7·hcl鎮(zhèn)痛活性遠高于檸檬苦素。

(2)小鼠縮尾實驗

試驗方法：

icr雄性小鼠，18～22g，隨機分為模型組、阿司匹林組、檸檬苦素組、脫氧檸檬苦素組、本發(fā)明化合物各受試藥組，每組8只。將小鼠尾尖端3cm浸入48℃恒溫水浴鍋中，以縮尾反射(鼠尾回縮出水面)為痛反應指標，記錄鼠尾放入水浴至受熱引起縮尾反射的時間(秒)作為痛反應閾值。給藥前測兩次縮尾反射時間取其平均值作為基礎痛域。各給藥組分別灌胃后，測定各組灌胃后30分鐘，60分鐘，90分鐘，120分鐘小鼠的縮尾潛伏期的變化，超過25秒無反應者，痛閾按25秒計。結(jié)果如圖1、圖2和圖3。

小鼠縮尾實驗結(jié)果顯示在測試的時間點內(nèi)本發(fā)明的部分化合物能提升小鼠縮尾反應中的痛域，表現(xiàn)出一定的鎮(zhèn)痛活性。總體上檸檬苦素系列化合物的作用強于脫氧檸檬苦素系列，且化合物中碳鏈長度為4個碳時活性較高，與小鼠醋酸扭體實驗中所得結(jié)論基本一致。

(3)小鼠耳腫脹實驗

實驗方法：

icr雄性小鼠，18～22g，隨機分成模型組、萘普生組、檸檬苦素組、本發(fā)明化合物組，每組8只。各組灌胃給藥90分鐘后在小鼠右耳涂二甲苯25ul致炎，30分鐘后拉頸處死，用8mm打孔器對雙耳打孔，取耳稱重，計算腫脹率(％)和腫脹抑制率(％)。結(jié)果見表3和表4。

腫脹率(％)＝(右耳重量-左耳重量)/左耳重量*100％

腫脹抑制率(％)＝(模型組腫脹率-受試藥組腫脹率)/模型組腫脹率*100％

表3檸檬苦素衍生物對小鼠耳腫脹的影響

注：^*p<0.05，^**p<0.01vs模型組。

表4脫氧檸檬苦素衍生物對小鼠耳腫脹的影響

注：^*p<0.05，^**p<0.01vs模型組。

小鼠耳腫脹實驗結(jié)果顯示本發(fā)明的化合物對小鼠耳腫脹具有顯著的抑制作用。構(gòu)效關(guān)系與小鼠醋酸扭體實驗及小鼠熱縮尾實驗結(jié)果基本一致。其中化合物i-5·hcl、i-6·hcl表現(xiàn)出較強的抗炎活性，且高于陽性對照萘普生和檸檬苦素。

(4)大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎實驗

根據(jù)小鼠醋酸扭體實驗，小鼠熱水縮尾實驗及小鼠耳腫脹實驗結(jié)果，我們選擇化合物i-5·hcl和i-6·hcl進行了大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎實驗，對化合物活性進行進一步驗證與研究。

實驗方法：

雄性wistar大鼠90只，適應性飼養(yǎng)3天后，隨機分為9組，每組10只，即空白組、模型組、i-5·hcl200mg/kg組、i-5·hcl100mg/kg組、i-5·hcl50mg/kg組、i-6·hcl200mg/kg組、i-6·hcl100mg/kg組、i-6·hcl50mg/kg組、托法替尼5mg/kg組。造模前，滅活卡介苗與不完全弗氏佐劑充分混合，配成含滅活卡介苗10mg/ml的完全弗氏佐劑(cfa)。除空白組外其余組各只大鼠右后足足趾注射0.1mlcfa致炎。造模第21天開始各組大鼠灌胃給藥，連續(xù)給藥14天。每隔一段時間，對各大鼠的右足踝測腫脹情況及體重變化，第15天各組大鼠眼眶采血，用于檢測tnf-α和il-6。結(jié)果如下：

①足趾腫脹抑制率

各組大鼠給予受試化合物后每三天測量一次其右足踝腫脹情況，計算腫脹抑制率，結(jié)果見表5。

腫脹抑制百分率＝(給藥前平均腫脹率-給藥后平均腫脹率)/模型組平均腫脹率×100％

表5i-5·hcl和i-6·hcl對大鼠原發(fā)側(cè)足趾腫脹的影響(n＝8)

從足趾腫脹抑制率結(jié)果看出，兩個化合物對大鼠原發(fā)側(cè)足腫均具有抑制活性，且隨劑量的升高，抑制活性也升高，表明其具有一定的劑量依賴性。從結(jié)果也可以看出化合物i-6·hcl的活性略高于化合物i-5·hcl。

②對大鼠體重的影響

給予受試化合物后每隔兩天測量一次大鼠體重，觀察大鼠體重的變化，結(jié)果如圖4。

從圖中可以看出，大鼠在給藥前期時體重變化較小，從第五天往后體重均呈上升趨勢，說明在化合物起效后大鼠的身體狀況好轉(zhuǎn)，進一步驗證了化合物具有緩解炎癥疼痛的效果。

③對大鼠臨床評分的影響

在本實驗中化合物對大鼠臨床評分影響主要是通過大鼠全身評分及大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)來表現(xiàn)，評分或指數(shù)越高說明臨床狀態(tài)越差，結(jié)果如圖5和圖6。

圖中顯示在給予受試化合物后大鼠的全身評分及關(guān)節(jié)炎指數(shù)均有所下降，說明大鼠臨床狀態(tài)好轉(zhuǎn)，進一步驗證本發(fā)明化合物具有鎮(zhèn)痛抗炎活性。

④血清中tnf-α和il-6含量測定

給予受試化合物第15天各組大鼠眼眶采血，檢測tnf-α和il-6，結(jié)果如表6。

表6血清中tnf-α和il-6含量測定

注：^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001vs模型組，^△p<0.05，^△△p<0.01，^△△△p<0.001vs空白組

從結(jié)果中看出在給藥后大鼠血清中的tnf-α和il-6含量均有下降，提示這兩個炎癥因子可能是化合物發(fā)揮鎮(zhèn)痛抗炎活性的重要介質(zhì)。具體機制有待進一步研究。

(5)小鼠熱板實驗

利用小鼠熱板實驗考察同種化合物以不同方式給藥時鎮(zhèn)痛活性的差異。

實驗方法：

icr雌性小鼠90只，將恒溫水浴箱加熱到55(±0.5)℃，將雌性小鼠置于熱板上，以其足部接觸熱板到開始舔后足的時間為熱板法痛閾(hppt)，剔除hppt大于30s或小于5s的動物，選擇符合標準的70只雌性小鼠按體重隨機分為7組，分別為模型對照組、檸檬苦素100mg/kg劑量組、i-5·hcl灌胃給藥100mg/kg劑量組、i-5·hcl靜脈給藥10mg/kg劑量組、i-6·hcl灌胃給藥100mg/kg劑量組、i-6·hcl靜脈給藥10mg/kg劑量組。以給藥前三次熱板法hppt的平均值為基礎痛閾，對超過60s無反應者則中止刺激，以60s痛反應計時，給藥后30min開始記錄痛閾時間。痛閾提高率(％)＝(給藥后痛閾-基礎痛閾)/基礎痛閾×100％，結(jié)果如表7。

表7i-5·hcl和i-6·hcl小鼠熱板鎮(zhèn)痛實驗

注：^*p<0.05，^**p<0.01vs模型組，^△p<0.05，^△△p<0.01vs組內(nèi)基礎痛閾，^◇p<0.05，^◇◇p<0.01vs萘普生組

本實驗中，我們采取了灌胃與靜脈注射兩種給藥方式，從實驗結(jié)果可以看出，靜脈給藥10mg/kg劑量的鎮(zhèn)痛活性強于相應的口服100mg/kg劑量的鎮(zhèn)痛活性。

檸檬苦素不溶水，而本發(fā)明的化合物加酸成鹽后可溶于水中。

附圖說明

圖1是本發(fā)明檸檬苦素衍生物i-1～i-6鹽酸鹽對小鼠縮尾的作用

圖2是本發(fā)明檸檬苦素衍生物i-7～i-9、i-12～i-13鹽酸鹽對小鼠的縮尾作用

圖3是本發(fā)明脫氧檸檬苦素衍生物ii-2～ii-3、ii-5～ii-6鹽酸鹽對小鼠的縮尾作用

圖4是本發(fā)明化合物i-5·hcl和i-6·hcl對大鼠體重的影響

圖5是本發(fā)明化合物i-5·hcl和i-6·hcl對大鼠全身評分的影響

圖6是本發(fā)明化合物i-5·hcl和i-6·hcl對大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響

具體實施方式

實施例1

23-(2-(哌啶-1-基)乙酰基)檸檬苦素(i-1)的制備

23-氯乙?；鶛幟士嗨?iv-1)

250ml三頸瓶中加入檸檬苦素(8g,17mmol)和二氯甲烷(125ml)，攪拌下降溫至0℃，分批加入三氯化鋁(10.2g,76.5mmol)，加畢，保溫攪拌20分鐘，滴加氯乙酰氯(2.2g,19.5mmol)與二氯甲烷(5ml)的混合溶液，滴畢，保持0～-5℃反應1小時，再于室溫繼續(xù)攪拌反應3小時，停止反應，將反應液慢慢倒入100ml冰水中，分取二氯甲烷層，水層用二氯甲烷萃取兩次(100ml×2)，合并有機層，用1mol/l氫氧化鈉水溶液洗三次(100ml×3)，飽和食鹽水洗滌兩次(100ml×2)，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸除溶劑。粗品用柱層析(二氯甲烷:甲醇＝180:1)純化，得淺綠色固體(iv-1)2.8g，收率30.2％，m.p.>200℃。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.62(s,1h),7.24(s,1h),5.50(s,1h),4.77(d,j＝13.1hz,1h),4.55(s,2h),4.46(d,j＝13.0hz,1h),4.03(s,2h),2.99(dd,j＝17.0,3.7hz,1h),2.93–2.79(m,1h),2.68(d,j＝15.7hz,1h),2.58–2.40(m,2h),2.22(d,j＝13.0hz,1h),1.98–1.75(m,3h),1.59–1.51(m,1h),1.29(s,3h),1.18(s,3h),1.14(s,3h),1.08(s,3h).esi-ms(m/z):569.2[m+na]⁺

23-(2-(哌啶-1-基)乙?；?檸檬苦素(i-1)

100ml三頸瓶中加入四氫呋喃(30ml)、碳酸鉀(0.66g,4.78mmol)、碘化鉀(0.03g,0.18mmol)、哌啶(0.92g,10.8mmol)，室溫攪拌20分鐘，滴加iv-1(1.97g,3.6mmol)溶于四氫呋喃(30ml)的溶液，滴畢，室溫繼續(xù)反應5小時，tlc檢測(二氯甲烷:甲醇＝25:1)反應完全，減壓蒸除溶劑。殘留物加入20ml水，析出固體，抽濾，粗品用柱層析(二氯甲烷:甲醇＝80:1)純化，得淡黃色固體(i-1)1.1g，收率51.3％,128℃(炭化)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.57(s,1h),7.31(s,1h),5.49(s,1h),4.78(d,j＝13.4hz,1h),4.47(d,j＝13.2hz,1h),4.03(s,2h),3.63(s,2h),2.99(dd,j＝16.8,3.5hz,1h),2.94–2.82(m,1h),2.69(d,j＝16.4hz,1h),2.63–2.36(m,6h),2.23(d,j＝13.0hz,1h),1.94–1.78(m,3h),1.69–1.41(m,7h),1.30(s,3h),1.19(s,3h),1.16(s,3h),1.08(s,3h).esi-ms(m/z):596.3[m+h]⁺

將i-1(1.0g,1.68mmol)溶解在乙酸乙酯(40ml)中，冰浴攪拌下緩慢滴加飽和hcl的乙酸乙酯溶液至ph2左右，析出淡黃色固體，繼續(xù)攪拌1小時，抽濾，所得固體用20ml乙酸乙酯打漿，抽濾，干燥得淡黃色固體(i-1·hcl)0.9g，收率85％，m.p.>200℃。¹hnmr(300mhz,dmso)δ10.04(s,1h),8.20(s,1h),7.69(s,1h),5.58(s,1h),4.91(d,j＝12.9hz,1h),4.74(s,2h),4.48(d,j＝13.1hz,1h),4.16(s,1h),4.08(s,1h),3.43–3.29(m,4h),3.17–3.05(m,1h),2.75(d,j＝16.6hz,1h),2.65–2.51(m,2h),2.45–2.38(m,1h),2.27(d,j＝12.1hz,1h),1.99–1.57(m,9h),1.45–1.32(m,1h),1.17(s,3h),1.08(s,3h),1.00(s,6h).

實施例2

23-(2-(嗎啉-4-基)乙?；?檸檬苦素(i-2)的制備

以化合物iv-1(2.0g,3.65mmol)和嗎啉(0.95g,10.90mmol)為原料，操作過程同i-1，粗品用柱層析(二氯甲烷:甲醇＝90:1)純化，得淺黃色固體(i-2)1.2g，收率54.9％，146℃(炭化)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.59(s,1h),7.26(s,1h),5.51(s,1h),4.79(d,j＝13.1hz,1h),4.49(d,j＝13.2hz,1h),4.06(s,2h),3.85–3.73(m,4h),3.70(s,2h),3.00(dd,j＝16.8,3.7hz,1h),2.95–2.79(m,1h),2.78–2.57(m,5h),2.57–2.42(m,2h),2.24(dd,j＝15.8,3.1hz,1h),1.91–1.78(m,3h),1.62–1.46(m,1h),1.32(s,3h),1.20(s,3h),1.17(s,3h),1.10(s,3h).esi-ms(m/z):598.3[m+h]⁺

以化合物i-2(1.0g,1.67mmol)為原料，操作過程同i-1·hcl，得淺黃色固體(i-2·hcl)0.87g，收率83％，m.p.>200℃。

實施例3

23-(2-(哌嗪-1-基)乙?；?檸檬苦素(i-3)的制備

以化合物iv-1(2.0g,3.65mmol)和n-叔丁氧羰基哌嗪(2.73g,14.6mmol)為原料，操作過程同i-1，粗品用柱層析(二氯甲烷:甲醇＝150:1)純化，得1.46g淡黃色中間體。將該中間體溶于甲醇(20ml)，冰浴攪拌下滴加飽和hcl的甲醇溶液(20ml)，滴畢，室溫反應2小時，tlc檢測(展開劑：二氯甲烷:甲醇＝25:1)反應完全，0～5℃放置1小時，抽濾得淡黃色固體(i-3)0.9g，兩步合計收率41.2％，140℃(炭化)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.57(s,1h),7.25(s,1h),5.49(s,1h),4.77(d,j＝12.7hz,1h),4.47(d,j＝13.4hz,1h),4.03(s,2h),3.68(s,2h),3.06(s,4h),2.97(dd,j＝16.8,3.9hz,1h),2.93–2.81(m,1h),2.78–2.62(m,4h),2.60–2.41(m,3h),2.23(d,j＝12.4hz,1h),2.03–1.76(m,3h),1.62–1.45(m,1h),1.29(s,3h),1.18(s,3h),1.15(s,3h),1.08(s,3h),0.90–0.82(m,1h).esi-ms(m/z):597.3[m+h]⁺

以化合物i-3(0.8g,1.34mmol)為原料，操作過程同i-1·hcl，得淺黃色固體(i-3·hcl)0.69g，收率81.4％，m.p.>200℃。

實施例4

23-(2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙酰基)檸檬苦素(i-4)的制備

以化合物iv-1(2.0g,3.65mmol)和n-甲基哌嗪(1.64g,16.42mmol)為原料，操作過程同i-1，粗品用柱層析(二氯甲烷:甲醇＝100:1)純化，得黃色固體(i-4)0.85g，收率38.2％，180℃(炭化)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.56(s,1h),7.23(s,1h),5.48(s,1h),4.77(d,j＝12.9hz,1h),4.46(d,j＝13.3hz,1h),4.02(s,2h),3.67(s,2h),2.98(d,j＝16.0hz,1h),2.92–2.80(m,1h),2.75–2.41(m,9h),2.32(s,3h),2.26–2.04(m,3h),1.97–1.75(m,3h),1.61–1.44(m,1h),1.29(s,3h),1.17(s,3h),1.14(s,3h),1.07(s,3h).esi-ms(m/z):611.3[m+h]⁺

以化合物i-4(0.8g,1.31mmol)為原料，操作過程同i-1·hcl，得淺黃色固體(i-4·hcl)0.68g，收率80.3％，m.p.>200℃。

實施例5

23-(4-(哌啶-1-基)丁?；?檸檬苦素(i-5)的制備

23-(4-氯丁酰基)檸檬苦素(iv-2)

1000ml三頸瓶中加入檸檬苦素(40.0g,85.01mmol)和二氯甲烷(500ml)，攪拌下降溫至0℃，分批加入三氯化鋁(51.0g,382.5mmol)，加畢，保溫攪拌20min，滴加4-氯丁酰氯(14.4g,102.0mmol)與二氯甲烷(15ml)的混合溶液，滴畢，保持0～-5℃反應1小時，再于室溫繼續(xù)攪拌反應2小時，停止反應，將反應液慢慢倒入500ml冰水中，分取二氯甲烷層，水層用二氯甲烷萃取兩次(300ml×2)，合并有機層，用1mol/l氫氧化鈉水溶液洗三次(300ml×3)，飽和食鹽水洗滌兩次(300ml×2)，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸除溶劑。粗品用柱層析(二氯甲烷:甲醇＝160:1)純化，得淺綠色固體(iv-2)20.5g，收率42％，m.p.160～163℃。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.58(s,1h),7.13(s,1h),5.50(s,1h),4.78(d,j＝12.9hz,1h),4.47(d,j＝13.1hz,1h),4.03(s,2h),3.65(t,j＝6.2hz,2h),3.03(t,j＝7.0hz,2h),2.99–2.80(m,2h),2.68(d,j＝16.7hz,1h),2.59–2.42(m,2h),2.30–2.11(m,3h),1.97–1.76(m,3h),1.54(s,1h),1.30(s,3h),1.19(s,3h),1.15(s,3h),1.08(s,3h).esi-ms(m/z):597.2[m+na]⁺

23-(4-(哌啶-1-基)丁?；?檸檬苦素(i-5)

100ml三頸瓶中加入iv-2(2g,3.48mmol)，乙腈(50ml)，哌啶(1.78g,20.88mmol)和碘化鉀(0.1g,0.6mmol)，加熱回流反應48h，tlc(二氯甲烷:甲醇＝25:1)檢測反應完全，減壓蒸除溶劑。殘留物加入50ml水，析出黃色固體，抽濾，粗品用柱層析(二氯甲烷:甲醇＝60:1)純化，得淺褐色固體(i-5)0.74g，收率34％，150℃(炭化)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.56(s,1h),7.13(s,1h),5.47(s,1h),4.76(d,j＝13.1hz,1h),4.46(d,j＝13.1hz,1h),4.03(d,j＝9.1hz,2h),3.08–2.96(m,2h),2.95–2.80(m,3h),2.78–2.56(m,6h),2.52(d,j＝11.2hz,1h),2.44(d,j＝14.5hz,1h),2.22(d,j＝13.5hz,1h),2.11–1.98(m,2h),1.96–1.76(m,3h),1.76–1.63(m,4h),1.61–1.42(m,3h),1.28(s,3h),1.16(s,3h),1.13(s,3h),1.06(s,3h).esi-ms(m/z):624.3[m+h]⁺

以化合物i-5(0.65g,1.04mmol)為原料，操作過程同i-1·hcl，得白色固體(i-5·hcl)0.51g，收率74％，m.p.190～193℃。¹hnmr(300mhz,dmso)δ9.94(s,1h),8.05(s,1h),7.49(s,1h),5.54(s,1h),4.92(d,j＝12.6hz,1h),4.48(d,j＝13.1hz,1h),4.14(s,1h),4.08(s,1h),3.38–3.30(m,2h),3.20–3.05(m,1h),3.05–2.91(m,4h),2.90–2.79(m,2h),2.76(d,j＝16.7hz,1h),2.66–2.52(m,2h),2.45–2.39(m,1h),2.27(d,j＝14.4hz,1h),2.04–1.91(m,2h),1.87–1.61(m,9h),1.43–1.32(m,1h),1.17(s,3h),1.09(s,3h),1.00(d,j＝3.3hz,6h).

實施例6

23-(4-(嗎啉-4-基)丁酰基)檸檬苦素(i-6)的制備

以化合物iv-2(2.0g,3.48mmol)和嗎啉(1.52g,17.4mmol)為原料，操作過程同i-5，粗品用柱層析(二氯甲烷:甲醇＝80:1)純化，得淺褐色固體(i-6)1.43g，收率66％，144℃(炭化)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.55(s,1h),7.08(s,1h),5.49(s,1h),4.77(d,j＝13.0hz,1h),4.46(d,j＝13.2hz,1h),4.03(d,j＝7.7hz,2h),3.68–3.52(m,4h),2.98(dd,j＝16.7,3.6hz,1h),2.93–2.86(m,1h),2.82(t,j＝6.9hz,2h),2.68(d,j＝17.2hz,1h),2.57–2.47(m,2h),2.47–2.35(m,6h),2.26–2.18(m,1h),1.97–1.77(m,5h),1.58–1.48(m,1h),1.29(s,3h),1.18(s,3h),1.14(s,3h),1.07(s,3h).esi-ms(m/z):626.3[m+h]⁺

以化合物i-6(1.3g,2.08mmol)為原料，操作過程同i-1·hcl，得白色固體(i-6·hcl)1.18g，收率86％，200℃(炭化)。¹hnmr(300mhz,dmso)δ10.71(s,1h),8.05(s,1h),7.49(s,1h),5.54(s,1h),4.92(d,j＝13.5hz,1h),4.48(d,j＝12.9hz,1h),4.14(s,1h),4.08(s,1h),3.98–3.88(m,2h),3.82–3.70(m,2h),3.49–3.40(m,2h),3.15–3.02(m,4h),3.01–2.92(m,3h),2.75(d,j＝16.5hz,1h),2.65–2.52(m,2h),2.45–2.40(m,1h),2.27(d,j＝11.7hz,1h),2.04–1.91(m,2h),1.85–1.63(m,3h),1.31–1.22(m,1h),1.17(s,3h),1.09(s,3h),1.00(d,j＝3.4hz,6h).

實施例7

23-(4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁?；?檸檬苦素(i-7)的制備

以化合物iv-2(2.0g,3.48mmol)和n-甲基哌嗪(1.74g,17.4mmol)為原料，操作過程同i-5，粗品用柱層析(二氯甲烷:甲醇＝80:1)純化，得淺褐色固體(i-7)1.0g，收率45％，146℃(炭化)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.55(s,1h),7.08(s,1h),5.49(s,1h),4.77(d,j＝13.1hz,1h),4.46(d,j＝13.0hz,1h),4.03(d,j＝4.5hz,2h),2.99(dd,j＝16.8,3.7hz,1h),2.93–2.85(m,1h),2.82(t,j＝7.0hz,2h),2.75–2.63(m,2h),2.62–2.35(m,10h),2.31(s,3h),2.27–2.16(m,2h),1.98–1.74(m,5h),1.60–1.47(m,1h),1.30(s,3h),1.18(s,3h),1.15(s,3h),1.07(s,3h).esi-ms(m/z):639.3[m+h]⁺

以化合物i-7(0.9g,1.4mmol)為原料，操作過程同i-1·hcl，得白色固體(i-7·hcl)0.69g，收率73.1％，m.p.>200℃。

實施例8

23-(4-(吡咯-1-基)丁?；?檸檬苦素(i-8)的制備

以化合物iv-2(2.0g,3.48mmol)和吡咯烷(1.24g,17.4mmol)為原料，操作過程同i-5，粗品用柱層析(二氯甲烷:甲醇＝60:1)純化，得褐色固體(i-8)0.91g，收率42.9％，m.p.154～156℃。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.59(s,1h),7.21(s,1h),5.49(s,1h),4.77(d,j＝13.1hz,1h),4.46(d,j＝13.1hz,1h),4.04(d,j＝9.2hz,2h),3.11–2.78(m,10h),2.69(d,j＝16.0hz,1h),2.56–2.42(m,2h),2.27–2.10(m,3h),2.06–1.96(m,4h),1.91–1.79(m,3h),1.61(s,1h),1.29(s,3h),1.18(s,3h),1.14(s,3h),1.06(s,3h).esi-ms(m/z):610.4[m+h]⁺

以化合物i-8(0.8g,1.31mmol)為原料，操作過程同i-1·hcl，得淺黃色固體(i-8·hcl)0.55g，收率64.9％，190℃(炭化)。

實施例9

23-(4-(哌嗪-1-基)丁?；?檸檬苦素(i-9)的制備

以化合物iv-2(2g,3.48mmol)和n-叔丁氧羰基哌嗪(5.21g,27.86mmol)為原料，操作過程同i-5，粗品用柱層析(二氯甲烷:甲醇＝100:1)純化，得黃色中間體0.92g。將該黃色中間體溶于甲醇(10ml)和二氯甲烷(10ml)的混合溶劑中，冰浴攪拌下滴加飽和hcl的甲醇溶液(10ml)，滴畢，室溫反應5小時，tlc檢測(二氯甲烷:甲醇＝20:1)反應完全，停止反應，調(diào)ph至中性，減壓蒸除溶劑，用二氯甲烷(30ml)溶解殘留物，加水(20ml)，分取二氯甲烷層，水層用二氯甲烷萃取兩次(20ml×2)，合并有機層，飽和食鹽水洗滌兩次(20ml×2)，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸除溶劑。粗品用柱層析(二氯甲烷:甲醇＝60:1)純化，得黃色固體(i-9)0.33g，兩步合計收率15.2％，162℃(炭化)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.56(s,1h),7.08(s,1h),5.49(s,1h),4.77(d,j＝13.6hz,1h),4.47(d,j＝11.6hz,1h),4.07(d,j＝34.5hz,2h),3.07–2.56(m,9h),2.55–2.30(m,8h),2.29–2.25(m,1h),2.01–1.79(m,5h),1.64–1.51(m,1h),1.30(s,3h),1.18(s,3h),1.15(s,3h),1.07(s,3h),0.88(brs,1h).esi-ms(m/z):625.2[m+h]⁺

以化合物i-9(0.25g,0.4mmol)為原料，操作過程同i-1·hcl，得淺黃色固體(i-9·hcl)0.23g，收率87.1％，m.p.>200℃。

實施例10

23-(4-(二正丙氨基)丁酰基)檸檬苦素(i-12)的制備

以化合物iv-2(2.0g,3.48mmol)和二正丙胺(2.11g,20.85mmol)為原料，操作過程同i-5，粗品用柱層析(二氯甲烷:甲醇＝40:1)純化，得淺黃色固體(i-12)0.36g，收率16.2％，148℃(炭化)。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.55(s,1h),7.10(s,1h),5.48(s,1h),4.77(d,j＝13.1hz,1h),4.46(d,j＝13.1hz,1h),4.03(s,2h),2.98(dd,j＝16.8,3.7hz,1h),2.93–2.79(m,3h),2.68(d,j＝16.6hz,1h),2.61–2.39(m,8h),2.26–2.18(m,1h),2.02–1.77(m,5h),1.58–1.41(m,5h),1.29(s,3h),1.17(s,3h),1.14(s,3h),1.07(s,3h),0.87(t,j＝7.3hz,6h).esi-ms(m/z):640.3[m+h]⁺

以化合物i-12(0.3g,0.47mmol)為原料，操作過程同i-1·hcl，得淺黃色固體(i-12·hcl)0.28g，收率88.5％，m.p.174～176℃。

實施例11

23-(4-(咪唑-1-基)丁酰基)檸檬苦素(i-13)的制備

以化合物iv-2(2.0g,3.48mmol)和咪唑(1.18g,17.3mmol)為原料，操作過程同i-5，粗品用柱層析(二氯甲烷:甲醇＝50:1)純化，得灰色固體(i-13)0.27g，收率12.8％，150℃(炭化)。¹hnmr(300mhz,dmso)δ8.02(s,1h),7.93(s,1h),7.44(s,1h),7.36(s,1h),6.97(s,1h),5.52(s,1h),4.91(d,j＝13.2hz,1h),4.47(d,j＝12.4hz,1h),4.11(s,2h),4.09–4.02(m,2h),3.19–3.05(m,1h),2.85–2.77(m,2h),2.76–2.70(m,1h),2.66–2.51(m,2h),2.45–2.39(m,1h),2.27(d,j＝11.7hz,1h),2.09–1.95(m,2h),1.90–1.65(m,3h),1.28–1.22(m,1h),1.17(s,3h),1.08(s,3h),1.00(d,j＝4.3hz,6h).esi-ms(m/z):607.3[m+h]⁺

以化合物i-13(0.2g,0.33mmol)為原料，操作過程同i-1·hcl，得灰白色固體(i-13·hcl)0.18g，收率85.1％，196℃(炭化)。

實施例13

23-(4-(哌啶-1-基)丁?；?脫氧檸檬苦素(ii-2)的制備

23-(4-氯丁酰基)脫氧檸檬苦素(vi)

250ml茄形瓶中加入脫氧檸檬苦素v(10g,22.02mmol)和二氯甲烷(140ml)，

攪拌下降溫至-5℃，分批加入三氯化鋁(14.69g,110.1mmol)，加畢，保溫攪拌30min，滴加4-氯丁酰氯(4.04g,28.65mmol)，滴畢，保持0～-5℃反應1小時，于室溫繼續(xù)攪拌反應12小時，停止反應，將反應液慢慢倒入150ml冰水中，分取二氯甲烷層，水層用二氯甲烷萃取兩次(100ml×2)，合并有機層，用1mol/l氫氧化鈉水溶液洗三次(100ml×3)，飽和食鹽水洗滌兩次(100ml×2)，無水硫酸鈉干燥，抽濾，減壓蒸除溶劑。粗品用柱層析(石油醚:乙酸乙酯＝1:1)純化，得白色固體(vi)6.48g，收率52.7％，m.p.136-139℃。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.65(s,1h),7.19(s,1h),6.86(s,1h),5.03(s,1h),4.68(d,j＝13.3hz,1h),4.57(d,j＝13.3hz,1h),4.11(s,1h),3.65(t,j＝6.2hz,2h),3.04(t,j＝7.1hz,2h),2.97(dd,j＝12.6,4.1hz,1h),2.90–2.76(m,1h),2.67–2.49(m,3h),2.31(d,j＝15.6hz,1h),2.25–2.15(m,2h),2.15–2.06(m,1h),1.92–1.80(m,1h),1.61–1.50(m,2h),1.41(s,3h),1.30(s,3h),1.22(s,3h),1.19(s,3h).esi-msm/z:557.2[m-h]^-

23-(4-(哌啶-1-基)丁?；?脫氧檸檬苦素(ii-2)

以化合物vi(2.0g,3.58mmol)和哌啶(1.83g,21.5mmol)為原料，操作過程同i-5，粗品用柱層析(二氯甲烷:甲醇＝60:1)純化，得黃色固體(ii-2)0.88g，收率40.5％，m.p.139～142℃。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.62(s,1h),7.13(s,1h),6.85(s,1h),5.02(s,1h),4.67(d,j＝13.4hz,1h),4.56(d,j＝13.2hz,1h),4.11(s,1h),2.95(d,j＝16.3hz,1h),2.89–2.74(m,3h),2.70–2.46(m,3h),2.45–2.30(m,6h),2.30–2.19(m,1h),2.17–2.02(m,1h),1.99–1.90(m,2h),1.89–1.78(m,1h),1.72–1.55(m,2h),1.55–1.45(m,4h),1.40(s,5h),1.28(s,3h),1.20(s,3h),1.17(s,3h).esi-msm/z:608.4[m+h]⁺

以化合物ii-2(0.8g,1.32mmol)為原料，操作過程同i-1·hcl，得淺黃色固體(ii-2·hcl)0.64g，收率75.5％，178℃(炭化)。

實施例14

23-(4-(嗎啉-4-基)丁?；?脫氧檸檬苦素(ii-3)

以化合物vi(2.0g,3.58mmol)和嗎啉(1.87g,21.5mmol)為原料，操作過程同i-5，粗品用柱層析(二氯甲烷:甲醇＝60:1)純化，得淺黃色固體(ii-3)0.8g，收率36.7％，m.p.141～144℃。1hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.62(s,1h),7.13(s,1h),6.84(s,1h),5.02(s,1h),4.67(d,j＝13.3hz,1h),4.56(d,j＝13.3hz,1h),4.11(s,1h),3.58(s,4h),3.03–2.86(m,2h),2.86–2.76(m,2h),2.69–2.52(m,3h),2.52–2.35(m,6h),2.34–2.24(m,1h),2.17–2.02(m,1h),2.00–1.89(m,2h),1.88–1.78(m,1h),1.66–1.48(m,2h),1.39(s,3h),1.28(s,3h),1.20(s,3h),1.17(s,3h).esi-msm/z:632.3[m+na]⁺

以化合物ii-3(0.7g,1.15mmol)為原料，操作過程同i-1·hcl，得淺黃色固體(ii-3·hcl)0.62g，收率83.5％，198℃(炭化)。

實施例15

23-(4-(二正丙氨基)丁?；?脫氧檸檬苦素(ii-5)的制備

以化合物vi(2.0g,3.58mmol)和二正丙胺(2.17g,21.44mmol)為原料，操作過程同i-5，粗品用柱層析(二氯甲烷:甲醇＝60:1)純化，得灰褐色固體(ii-5)0.44g，收率19.7％，m.p.126～128℃。¹hnmr(300mhz,cdcl3)δ7.64(s,1h),7.18(s,1h),6.84(s,1h),5.02(s,1h),4.67(d,j＝12.3hz,1h),4.57(d,j＝12.4hz,1h),4.11(s,1h),3.08–2.74(m,4h),2.72–2.41(m,9h),2.30(d,j＝15.2hz,1h),2.20–2.06(m,1h),2.04–1.81(m,3h),1.71–1.46(m,6h),1.40(s,3h),1.28(s,3h),1.20(s,3h),1.17(s,3h),0.95–0.84(m,6h).esi-msm/z:624.4[m+h]⁺

以化合物ii-5(0.35g,0.56mmol)為原料，操作過程同i-1·hcl，得灰色固體(ii-5·hcl)0.27g，收率72.9％，172℃(炭化)。

實施例16

23-(4-(咪唑-1-基)丁?；?脫氧檸檬苦素(ii-6)的制備

以化合物vi(2.0g,3.58mmol)和咪唑(1.22g,17.92mmol)為原料，操作過程同i-5，粗品用柱層析(二氯甲烷:甲醇＝60:1)純化，得黃色固體(ii-6)0.26g，收率12.3％，m.p.132～135℃。¹hnmr(300mhz,dmso)δ8.04(s,1h),7.62(s,1h),7.45(s,1h),7.18(s,1h),6.88(s,1h),6.63(s,1h),5.19(s,1h),4.82(d,j＝11.7hz,1h),4.61(d,j＝11.7hz,1h),4.11(s,1h),4.06–3.89(m,2h),3.22–3.06(m,1h),2.89–2.73(m,2h),2.71–2.52(m,3h),2.44–2.25(m,2h),2.22–1.90(m,3h),1.87–1.43(m,3h),1.28(s,3h),1.16(s,3h),1.13(s,3h),1.00(s,3h).esi-msm/z:591.3[m+h]⁺

以化合物ii-6(0.2g,0.34mmol)為原料，操作過程同i-1·hcl，得灰色固體(ii-6·hcl)0.18g，收率84.8％，176℃(炭化)。