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預(yù)測甲氨蝶呤療效及不良反應(yīng)的熒光探針組和檢測試劑的制作方法

文檔序號:11703473閱讀:466來源:國知局

本發(fā)明涉及一種用于預(yù)測治療效果的引物組和檢測試劑,特別涉及預(yù)測甲氨蝶呤療效及不良反應(yīng)的探針組和檢測試劑。



背景技術(shù):

風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(ra)是一種以慢性破壞性關(guān)節(jié)病變?yōu)樘卣鞯南到y(tǒng)性自身免疫性疾病。2006年進行的第二次全國殘疾人抽樣調(diào)查中,關(guān)節(jié)病在導(dǎo)致肢體殘疾的21類病因中排第2位(20.1%),僅次于腦血管?。?0.6%),而遠高于外傷、交通事故等原因造成的殘疾。而且,在女性致殘者,關(guān)節(jié)病是首要的致殘疾病,占總?cè)藬?shù)的27%。在這些致殘性關(guān)節(jié)病中,79.4%為ra致殘。因此,ra是我國的臨床主要致殘性疾病之一,并由此造成了嚴(yán)重的家庭及社會負擔(dān)。提高ra診治水平,最大限度降低病人致殘率是國家亟待解決的重大健康問題。

ra的發(fā)病過程可以分為三個階段:(1)自身免疫啟動環(huán)節(jié),即在遺傳背景下自身抗原對病人致病性免疫反應(yīng)的驅(qū)動;(2)異常免疫應(yīng)答階段,即自身反應(yīng)性t、b細胞及一系列免疫細胞在抗原刺激下活化,引起致病性免疫反應(yīng)的過程;炎癥及組織破壞階段,即免疫細胞活化后通過一系列炎性細胞因子、自身抗體及炎癥介質(zhì)等致炎因子的作用,導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜炎癥、軟骨和骨破壞的過程。盡管國內(nèi)外學(xué)者針對這一發(fā)病過程已經(jīng)進行了大量研究,但目前仍有一系列與本病的發(fā)病機制及干預(yù)策略相關(guān)的重要問題未得到解決,因此,ra的治療尚缺乏特異性的治療方法,免疫抑制劑和生物制劑為主的慢作用藥物(dmards)仍然是目前治療ra的主要藥物。而近二十年的臨床實踐表明,在這些dmards中,甲氨蝶呤(mtx)是治療ra的最有效藥物,被認為是ra的基本治療藥物,mtx通過抑制葉酸、腺苷和從頭生成的核苷酸合成途徑而產(chǎn)生療效。不論是單用或與其它dmards藥聯(lián)合使用,即使新的生物制劑治療的出現(xiàn),mtx仍以它的低價、廣泛使用和聯(lián)合用藥而發(fā)揮著中心作用。然而,僅有約45%-65%的病人有良好的臨床反應(yīng),約30%的病人因不良反應(yīng)而中斷了治療。mtx的副作用臨床上主要表現(xiàn)為胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制、藥物性肝炎、腎臟損害、脫發(fā)及皮炎等,不良反應(yīng)只能在相關(guān)的癥狀出現(xiàn)后或者通過相關(guān)的血液尿液檢查才能得出結(jié)論,指標(biāo)包括白細胞下降、alt升高、蛋白尿等,但陽性結(jié)果也意味著病人機體因用藥而造成了不可逆損傷。因此,如何更加精準(zhǔn)地使用mtx,以獲得更好的療效和更小的不良反應(yīng),是目前風(fēng)濕病學(xué)界亟需解決的緊迫課題。

個體基因遺傳差異是藥物療效和不良反應(yīng)的重要原因,基因多態(tài)性會對藥物代謝產(chǎn)生很明顯的影響,與藥物效應(yīng)及個體易感性緊密聯(lián)系。通過對病人的基因位點進行檢測,能進一步確定對特定藥物具有很強敏感性或抵抗性的患病人群,從而指導(dǎo)臨床針對不同個體實施個性化方案,使病人既能獲得最佳治療效果,又能避免藥物的不良反應(yīng),達到個體化用藥的目的。近十多年來的大量研究發(fā)現(xiàn),位于mtx細胞內(nèi)作用途徑的基因單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms,snp)可用于預(yù)測mtx的療效和副作用。目前已發(fā)現(xiàn)近20種與mtx療效和不良反應(yīng)相關(guān)的snp,如slc19a1、rfc180a、abcb1、slco1b1、comtval158met、ggh、ampd134c、fpgs、slc46a1、dhfr、atict675c、mthfr、tyms1494、tyms、fpgsrs10106、atic、abcb1、il-6、fcgr3a等均與mtx的毒性與療效相關(guān)。因此,通過檢測相關(guān)基因的snp對臨床上更合理地使用mtx具有重要的臨床價值和意義。

目前國外有不同的實驗室通過文獻報道以上單一基因與mtx療效或毒性顯著相關(guān),檢測方法為傳統(tǒng)的pcr-rflp及第一代測序,每次只能檢測一個基因的一個多態(tài)位點,國內(nèi)尚無此類mtx療效或毒性文獻報道,更無相關(guān)商品試劑盒面世。

現(xiàn)有檢測snp效果最佳的方法為基因測序法,經(jīng)典的dna測序平臺目前主要為sanger測序,原理是雙脫氧鏈終止法,它可以把一段長約1000bp的基因序列的每個堿基都測定出來,被公認為檢測snp或突變的金標(biāo)準(zhǔn),方法準(zhǔn)確,但缺點是效率比較低、耗時,一次只能檢測一個基因位點,檢測時間需12小時左右。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的在于提供預(yù)測甲氨蝶呤療效及不良反應(yīng)的探針組和檢測試劑。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:

用于預(yù)測甲氨蝶呤療效及不良反應(yīng)的探針組,包括毒性基因探針組、增強療效基因探針組和降低療效基因探針組,其中:

毒性基因探針組包括識別slc19a1-rs1131596、ggh-rs1800909、atic-rs2372536的探針;

增強療效基因探針組包括識別abcb1rs1045642、tyms-rs2853542、atic-rs4673993的探針;

降低療效基因探針組包括識別fpgs-rs1054774、dhfr-rs408626、mthfr-rs1801131的探針。

作為上述探針組的進一步改進,識別slc19a1-rs1131596、ggh-rs1800909、atic-rs2372536的探針序列分別為:

slc19a1-rs1131596:cttccaggcacagtgtcaccttcgtccc(seqidno:1);

ggh-rs1800909:ccagtccgggctgcctgctgtgcgt(seqidno:2);

atic-rs2372536:tccaggtgtaagtgttgaggaggc(seqidno:3)。

作為上述探針組的進一步改進,識別abcb1、tyms-rs16430、atic-rs4673993的探針序列分別為:

abcb1rs1045642:cacaggaagagattgtgagggcagc(seqidno:4);

tyms-rs2853542:gcgccacttggcctgcctccgtc(seqidno:5);

atic-rs4673993:ctcagttttttattcaggagcagg(seqidno:6);

作為上述探針組的進一步改進,識別fpgs-rs1054774、dhfr-rs408626、mthfr-rs1801131的探針序列分別為:

fpgs-rs1054774:ttgagcatatttattaggtgtgtc(seqidno:7);

dhfr-rs408626:atcagtaagactcttcgaccacc(seqidno:8);

mthfr-rs1801131:agctgaccagtgaagcaagtgtctttg(seqidno:9)。

作為上述探針組的進一步改進,內(nèi)標(biāo)基因為gapdh,對應(yīng)的探針序列為gapdh:ttcctagattattctctggtaaatca(seqidno:10)。

一種用于預(yù)測甲氨蝶呤療效及不良反應(yīng)的試劑盒,包括質(zhì)控品、針對相同基因的核酸擴增劑和多色熒光檢測劑,多色熒光檢測劑使用的熒光探針如上所述。

作為上述試劑盒的進一步改進,核酸擴增劑的引物對分別為:

1)slc19a1-rs1131596:

上游引物:ggggtagggaggcctgcagaccat(seqidno:11);

下游引物:gggcaccatcctgctcaggcca(seqidno:12);

2)ggh-rs1800909:

上游引物:ttgaaaggcggcgggaggcgg(seqidno:13);

下游引物:gtctagacagctcgaggctc(seqidno:14);

3)atic-rs2372536:

上游引物:caatctctatccctttgtaaag(seqidno:15);

下游引物:ttctgacttaccaatgtcaa(seqidno:16);

4)abcb1rs1045642:

上游引物:acattgcctatggagacaac(seqidno:17);

下游引物:tcgatgaaggcatgtatgttg(seqidno:18);

5)tyms-rs2853542:

上游引物:accgcgccacttggcctgcc(seqidno:19);

下游引物:ggacggaggcaggcgaagt(seqidno:20);

6)atic-rs4673993:

上游引物:atactagatggtcttctgaag(seqidno:21);

下游:gcctcactcttcaatgacac(seqidno:22);

7)fpgs-rs1054774:

上游引物:cactgcaatttcgatggtct(seqidno:23);

下游引物:cagctgtattaagtcccgaa(seqidno:24);

8)dhfr-rs408626:

上游引物:tcttctagtcacccaatccag(seqidno:25);

下游引物:tgcgtcttttaacctccatcc(seqidno:26);

9)mthfr-rs1801131:

上游引物:aaggaggagctgctgaagatg(seqidno:27);

下游引物:gttctcccgagaggtaaaga(seqidno:28);

10)gapdh:

上游引物:gctagctggcccgatttctc(seqidno:29);

下游引物:cacagccaccacacctctg(seqidno:30)。

作為上述試劑盒的進一步改進,不同的探針上標(biāo)記有不同的熒光基團。

作為上述試劑盒的進一步改進,多色熒光檢測劑由毒性基因檢測池、增強療效基因檢測池和降低療效基因檢測池組成。

作為上述試劑盒的進一步改進,毒性基因檢測池、增強療效基因檢測池和降低療效基因檢測池中探針的熒光標(biāo)記組合分別為如下組合中的一個:

a:fam、vic、tet、rox、bhq-1五種熒光,bhq-1標(biāo)記在探針的3’端,其余的分別標(biāo)記在探針的5’端;;

b:rec、hex、texasred、cy5、bhq-2五種熒光,bhq-2標(biāo)記在探針的3’端,其余的分別標(biāo)記在探針的5’端;

c:fam、rec、hex、rox、bhq-1五種熒光,bhq-1標(biāo)記在探針的3’端,其余的分別標(biāo)記在探針的5’端。

本發(fā)明的有益效果是:

本發(fā)明的探針組和試劑盒可在用藥前通過基因檢測,判斷出病人大致的mtx用藥類型,在臨床中根據(jù)基因檢測結(jié)果調(diào)整劑量或更換藥物,在提高療效的同時盡可能地降低藥物的毒性損傷。

發(fā)明人選擇了50個類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人,其中預(yù)測毒性基因與增強療效基因均出現(xiàn)snp陽性的病人為8例,在用藥過程中劑量減少30%至50%不等,用藥三個月后證明療效明顯且只有1例出現(xiàn)少量蛋白尿,有效地規(guī)避了不良反應(yīng);其中預(yù)測毒性基因snp陰性但降低療效基因陽性的病人11例,在用藥過程中劑量增加30%至50%不等,用藥三個月后證明療效明顯且只有2例出現(xiàn)輕度的腹瀉和惡心、1例出現(xiàn)白細胞下降。說明本發(fā)明的探針組可以有效地指導(dǎo)臨床用藥,對病人進行個性化用藥,減少毒副作用。

本發(fā)明通過精心選擇三大類與mtx治療關(guān)系明確的基因類型,每種基因類型包含三個基因,根據(jù)基因序列設(shè)計特異性引物及探針,探針通過多色熒光標(biāo)記,組成三組基因檢測池,共包含九個基因位點,檢測在1個半小時內(nèi)結(jié)束,通過熒光擴增曲線完成精確測定。

本發(fā)明創(chuàng)新性設(shè)計三個檢測池,可在1個半小時內(nèi)得到9個基因snp結(jié)果,精確度和準(zhǔn)確度都完全能滿足臨床要求,同時成本較低,每個臨床樣品檢測的試劑成本可控制在30元以內(nèi)。

具體實施方式

用于預(yù)測甲氨蝶呤療效及不良反應(yīng)的探針組,包括毒性基因探針組、增強療效基因探針組和降低療效基因探針組,其中:

毒性基因探針組包括識別slc19a1-rs1131596、ggh-rs1800909、atic-rs2372536的探針;

增強療效基因探針組包括識別abcb1rs1045642、tyms-rs2853542、atic-rs4673993的探針;

降低療效基因探針組包括識別fpgs-rs1054774、dhfr-rs408626、mthfr-rs1801131的探針。

發(fā)明人通過對大量的臨床數(shù)據(jù)分析,對種類繁多的snp位點進行篩選,最終得到上述9個snp位點組合,從毒性基因、增強療效基因和降低療效基因3個方面全面入手,在盡可能減少snp使用量的同時,很好地保證了甲氨蝶呤療效及不良反應(yīng)的效果。通過對上述snp位點進行熒光實時分析,可以很好地指導(dǎo)甲氨蝶呤治療ra時的用藥。

根據(jù)熒光實時監(jiān)測結(jié)果中三類基因(毒性基因、增強療效基因和降低療效基因)出現(xiàn)的陽性結(jié)果百分比(如毒性基因三個指標(biāo)均為陽性,則陽性結(jié)果百分比表述為100%;如毒性基因兩個指標(biāo)為陽性,一個指標(biāo)為陰性,則陽性結(jié)果百分比表述為67%,依次類推),作為藥物劑量增減的依據(jù),藥物增減的劑量控制在30%至50%,在臨床用藥過程中定期檢測毒副作用指標(biāo),同時做好療效觀察。

發(fā)明人選擇了50個類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人,其中:

預(yù)測毒性基因與增強療效基因均出現(xiàn)snp陽性的病人為8例,在用藥過程中劑量減少30%至50%不等,用藥三個月后顯示療效明顯,且只有1例出現(xiàn)少量蛋白尿,有效地規(guī)避了不良反應(yīng);

預(yù)測毒性基因snp陰性但降低療效基因陽性的病人11例,在用藥過程中劑量增加30%至50%不等,用藥三個月后證明療效明顯且只有2例出現(xiàn)輕度的腹瀉和惡心、1例出現(xiàn)白細胞下降。

說明本發(fā)明的探針組可以有效地指導(dǎo)臨床用藥,對病人進行個性化用藥,減少毒副作用。

作為上述探針組的進一步改進,識別slc19a1-rs1131596、ggh-rs1800909、atic-rs2372536的探針序列分別為:

slc19a1-rs1131596:cttccaggcacagtgtcaccttcgtccc

ggh-rs1800909:ccagtccgggctgcctgctgtgcgt

atic-rs2372536:tccaggtgtaagtgttgaggaggc。

作為上述探針組的進一步改進,識別abcb1、tyms-rs16430、atic-rs4673993的探針序列分別為:

abcb1rs1045642:cacaggaagagattgtgagggcagc

tyms-rs2853542:gcgccacttggcctgcctccgtc

atic-rs4673993:ctcagttttttattcaggagcagg。

作為上述探針組的進一步改進,識別fpgs-rs1054774、dhfr-rs408626、mthfr-rs1801131的探針序列分別為:

fpgs-rs1054774:ttgagcatatttattaggtgtgtc

dhfr-rs408626:atcagtaagactcttcgaccacc

mthfr-rs1801131:agctgaccagtgaagcaagtgtctttg。

作為上述探針組的進一步改進,內(nèi)標(biāo)基因為gapdh,對應(yīng)的探針序列為gapdh:ttcctagattattctctggtaaatca。

一種用于預(yù)測甲氨蝶呤療效及不良反應(yīng)的試劑盒,包括質(zhì)控品、針對相同基因的核酸擴增劑和多色熒光檢測劑,多色熒光檢測劑使用的熒光探針如上所述。

作為上述試劑盒的進一步改進,核酸擴增劑的引物對分別為:

1)slc19a1-rs1131596:

上游引物:ggggtagggaggcctgcagaccat

下游引物:gggcaccatcctgctcaggcca

2)ggh-rs1800909:

上游引物:ttgaaaggcggcgggaggcgg

下游引物:gtctagacagctcgaggctc

3)atic-rs2372536:

上游引物:caatctctatccctttgtaaag

下游引物:ttctgacttaccaatgtcaa

4)abcb1rs1045642:

上游引物:acattgcctatggagacaac

下游引物:tcgatgaaggcatgtatgttg

5)tyms-rs2853542:

上游引物:accgcgccacttggcctgcc

下游引物:ggacggaggcaggcgaagt

6)atic-rs4673993:

上游引物:atactagatggtcttctgaag

下游:gcctcactcttcaatgacac

7)fpgs-rs1054774:

上游引物:cactgcaatttcgatggtct

下游引物:cagctgtattaagtcccgaa

8)dhfr-rs408626:

上游引物:tcttctagtcacccaatccag

下游引物:tgcgtcttttaacctccatcc

9)mthfr-rs1801131:

上游引物:aaggaggagctgctgaagatg

下游引物:gttctcccgagaggtaaaga

10)gapdh:

上游引物:gctagctggcccgatttctc

下游引物:cacagccaccacacctctg。

作為上述試劑盒的進一步改進,不同的探針上標(biāo)記有不同的熒光基團。

作為上述試劑盒的進一步改進,多色熒光檢測劑由毒性基因檢測池、增強療效基因檢測池和降低療效基因檢測池組成。

作為上述試劑盒的進一步改進,毒性基因檢測池、增強療效基因檢測池和降低療效基因檢測池中探針的熒光標(biāo)記組合分別為如下組合中的一個:

a:fam、vic、tet、rox、bhq-1五種熒光,bhq-1標(biāo)記在探針的3’端,其余的分別標(biāo)記在探針的5’端;;

b:rec、hex、texasred、cy5、bhq-2五種熒光,bhq-2標(biāo)記在探針的3’端,其余的分別標(biāo)記在探針的5’端;

c:fam、rec、hex、rox、bhq-1五種熒光,bhq-1標(biāo)記在探針的3’端,其余的分別標(biāo)記在探針的5’端。

上述熒光組合具有如下優(yōu)點:

1)不同熒光基團均有自己特定的激發(fā)波長光譜,在設(shè)計時充分考慮到每種熒光基團的光譜范圍,按照光譜錯峰不重疊的原則,使每個檢測池中四種熒光基團的光譜峰之間都有最佳的間隔,相互基團完全不影響各自的熒光激發(fā);

2)影響熒光基團發(fā)光的另一個因素是緩沖體系中的各種離子會引起熒光基團最大吸收波長的位移及相應(yīng)熒光峰的改變,這會導(dǎo)致儀器收集四種不同顏色的信號時不能得到穩(wěn)定的信號源甚至引起熒光淬滅,從而造成結(jié)果的波動和改變。通過測試發(fā)現(xiàn)在離子強度達到正常配置10倍濃度時對熒光信號強度的干擾僅在5%以內(nèi),完全不影響信號采集及分析;

3)傳統(tǒng)的熒光淬滅基團主要為tamra,本發(fā)明中熒光淬滅基團均選用bhq系列,因為bhq基團本身不產(chǎn)生熒光,吸收光譜覆蓋范圍非常廣,從430nm一直到近紅外,可淬滅的報告基團種類包括了絕大多數(shù)的熒光報告基團,在反應(yīng)過程中無噪聲干擾,背景干凈,大大提高了反應(yīng)的靈敏度和特異性。

下面結(jié)合實施例,進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

熒光檢測試劑盒:包括陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品、熒光探針、反應(yīng)緩沖液,其中:

熒光探針的具體序列如下:

slc19a1-rs1131596:cttccaggcacagtgtcaccttcgtccc

ggh-rs1800909:ccagtccgggctgcctgctgtgcgt

atic-rs2372536:tccaggtgtaagtgttgaggaggc

abcb1rs1045642:cacaggaagagattgtgagggcagc

tyms-rs2853542:gcgccacttggcctgcctccgtc

atic-rs4673993:ctcagttttttattcaggagcagg

fpgs-rs1054774:ttgagcatatttattaggtgtgtc

dhfr-rs408626:atcagtaagactcttcgaccacc

mthfr-rs1801131:agctgaccagtgaagcaagtgtctttg

gapdh:ttcctagattattctctggtaaatca。

擴增引物如下:

1)slc19a1-rs1131596:

上游引物:ggggtagggaggcctgcagaccat

下游引物:gggcaccatcctgctcaggcca

2)ggh-rs1800909:

上游引物:ttgaaaggcggcgggaggcgg

下游引物:gtctagacagctcgaggctc

3)atic-rs2372536:

上游引物:caatctctatccctttgtaaag

下游引物:ttctgacttaccaatgtcaa

4)abcb1rs1045642:

上游引物:acattgcctatggagacaac

下游引物:tcgatgaaggcatgtatgttg

5)tyms-rs2853542:

上游引物:accgcgccacttggcctgcc

下游引物:ggacggaggcaggcgaagt

6)atic-rs4673993:

上游引物:atactagatggtcttctgaag

下游:gcctcactcttcaatgacac

7)fpgs-rs1054774:

上游引物:cactgcaatttcgatggtct

下游引物:cagctgtattaagtcccgaa

8)dhfr-rs408626:

上游引物:tcttctagtcacccaatccag

下游引物:tgcgtcttttaacctccatcc

9)mthfr-rs1801131:

上游引物:aaggaggagctgctgaagatg

下游引物:gttctcccgagaggtaaaga

10)gapdh:

上游引物:gctagctggcccgatttctc

下游引物:cacagccaccacacctctg。

在單一反應(yīng)管內(nèi)快速準(zhǔn)確的同時進行臨床4色多基因snp檢測,檢測探針采用熒光標(biāo)記物進行標(biāo)記,每種探針均有一個熒光報告基團和熒光淬滅基團,分別標(biāo)記在探針序列的5’端和3’端,試劑共分三個檢測池,每個檢測池有四種探針(對應(yīng)于三種待檢基因和一種內(nèi)參基因),共包含五種熒光標(biāo)記物(前四種為熒光報告基團,后一種為熒光淬滅基團),其組合情況如下:

a:檢測池一包括fam、vic、tet、rox、bhq-1五種熒光,bhq-1標(biāo)記在探針的3’端,其余的分別標(biāo)記在探針的5’端。

b:檢測池二包括rec、hex、texasred、cy5、bhq-2五種熒光,bhq-2標(biāo)記在探針的3’端,其余的分別標(biāo)記在探針的5’端。

c:檢測池三包括fam、rec、hex、rox、bhq-1五種熒光,bhq-1標(biāo)記在探針的3’端,其余的分別標(biāo)記在探針的5’端。

檢測結(jié)果:

采集中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕科一病人edta抗凝全血0.5ml,提取得到濃度為160ng/ul的總dna溶液,od測定260/280純度數(shù)值為1.82;

取5uldna提取溶液作為每個檢測池的反應(yīng)模板,分別加入3個檢測池的反應(yīng)管內(nèi),進行實時熒光擴增;擴增程序如下:

95℃預(yù)變性15分鐘,然后95℃45秒、60℃55秒共40個循環(huán)。

分析結(jié)果顯示,slc19a1-rs1131596、ggh-rs1800909、fpgs-rs1054774、mthfr-rs1801131、atic-rs4673993五個位點的snp檢測結(jié)果為陽性改變,擴增同陽性質(zhì)控品,熒光擴增曲線的ct檢測值均位于24~31區(qū)間,熒光信號強度值rfu大于1000;abcb1-rs1045642、dhfr-rs408626、tyms-rs2853542、atic-rs2372536四個位點的snp檢測結(jié)果為正常型別,熒光擴增曲線形態(tài)為陰性擴增,擴增同陰性質(zhì)控品。重復(fù)三次實驗,結(jié)果均一致。說明本發(fā)明的擴增引物和熒光探針具有很好的靈敏度和特異性,可以滿足臨床的需要。

sequencelisting

<110>廣州之遠生物技術(shù)有限公司

<120>預(yù)測甲氨蝶呤療效及不良反應(yīng)的熒光探針組和檢測試劑

<130>mtx

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<170>patentinversion3.5

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