本發(fā)明屬于植物促生菌開發(fā)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及的是一種熱反硝化地芽孢桿菌菌株tb62及其在促進(jìn)堆肥腐熟中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：化肥在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著巨大作用。但是隨著化肥使用量的增加，其利用率逐年降低。農(nóng)藥和化肥的殘留，向環(huán)境釋放了大量的有害物質(zhì)，污染了土壤、水源和食品，對人類健康及生存環(huán)境構(gòu)成了極大威脅，要求保護(hù)生態(tài)環(huán)境和生產(chǎn)安全食品的呼聲日益強(qiáng)烈。因此，開發(fā)利用替代化學(xué)肥料的新肥源，以適應(yīng)發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)和綠色食品的需要已是當(dāng)務(wù)之急。而微生物肥料可使土壤中無效營養(yǎng)有效化，預(yù)防和控制農(nóng)作物病害，減少農(nóng)藥和化肥的使用，是解決土壤、水源和食品污染的根本途經(jīng)，被普遍認(rèn)為是一種環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)有效的提高作物產(chǎn)量的方法。微生物肥料是一類含有微生物活體的特定制品，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，能夠獲得特定的肥料效應(yīng)。其中制品中活微生物起關(guān)鍵作用。目前，一般將微生物肥料制品分為兩大類：一類是狹義的微生物肥料，指通過微生物的生命活動，增加了植物營養(yǎng)元素的供應(yīng)量，包括土壤和生產(chǎn)環(huán)境中植物營養(yǎng)元素的供應(yīng)總量，導(dǎo)致植物營養(yǎng)狀況的改善，進(jìn)而增加產(chǎn)量。這一類微生物肥料的代表是根瘤菌肥；另一類是廣義的微生物肥料，指通過其中微生物的生命活動，不但能提高植物營養(yǎng)元素的供應(yīng)量，還能產(chǎn)生植物生長激素，促進(jìn)植物對營養(yǎng)元素的吸收利用或有拮抗某些病原微生物的致病作用，減輕農(nóng)作物病蟲害簡介提高作物產(chǎn)量。與化學(xué)肥料相比，微生物肥料具有以下優(yōu)點：不破壞土壤結(jié)構(gòu)；保護(hù)生態(tài)、不污染環(huán)境，對人畜無毒無害；肥效持久；提高作物產(chǎn)量，改善作物品質(zhì)；成本低廉，經(jīng)濟(jì)有效。植物根際促生菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria，pgpr)是一類能高密度定殖在植物根際的微生物，兼有抑制植物病原菌、根際有害微生物，以及促進(jìn)植物生長并增加作物產(chǎn)量的作用。作為生物肥料和生物農(nóng)藥的重要資源庫，pgpr的研究和應(yīng)用已經(jīng)起到了舉足輕重的作用。從資源再生利用的角度來研究和開發(fā)微生物肥料則對資源綜合利用和環(huán)境保護(hù)更具有現(xiàn)實意義。芽孢桿菌屬于芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬，能形成內(nèi)生孢子-芽孢的革蘭氏陽性桿菌，需氧或兼性需氧，具有鞭毛。芽孢桿菌廣泛分布于土壤、空氣、水和動物腸道中，其穩(wěn)定性強(qiáng)，芽孢一旦形成，便能耐受各種不利條件，如干熱(150℃干熱1h仍有芽孢存活)、濕熱、紫外線、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑、極度干燥、真空干燥、氧化劑的氧化作用等。在一定條件下，芽孢能夠長時間保存，可以保證益生菌制品的有效期。所有菌屬中芽孢桿菌是最理想的微生物添加劑。大量試驗證明，芽孢桿菌添加劑可明顯改善機(jī)體內(nèi)菌群組成和具有促生長的功效，并且芽孢桿菌在顆粒料、粉料的加工過程中以及酸性環(huán)境中具有較高穩(wěn)定性，在腸道內(nèi)環(huán)境中能發(fā)揮作用而增殖，符合微生物添加劑的條件。芽孢桿菌在腸道酸性環(huán)境中具有高度的穩(wěn)定性，能分泌較強(qiáng)活性的蛋白酶及淀粉酶，促進(jìn)飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化。芽孢桿菌可以減少糞和消化道中的大腸埃希氏菌數(shù)量。目前，使用的芽孢桿菌菌株主要有枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)、蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)、東洋芽孢桿菌(bacillustoyoi)等，而關(guān)于熱反硝化地芽孢桿菌的研究則鮮有報道，如申請?zhí)?01510455215.7的發(fā)明專利《一株熱反硝化地芽孢桿菌cf-1及其用途》，該專利公開了保藏編號為cgmccno.10697，并公開了該菌株在微生物采油中的用途。公開于該
背景技術(shù)：
部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明解決的問題在于提供一種熱反硝化地芽孢桿菌菌株tb62，該菌株可應(yīng)用于制備表面活性劑及促進(jìn)堆肥腐熟。本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：本發(fā)明公開了一種熱反硝化地芽孢桿菌菌株tb62，其分類學(xué)命名為熱反硝化地芽孢桿菌tb62(geobacillusthermodenitrificans)，于2017年01月05日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為cgmcc13530。本發(fā)明還提供了所述的熱反硝化地芽孢桿菌菌株tb62在降解木質(zhì)纖維素中的用途。本發(fā)明還提供了所述的熱反硝化地芽孢桿菌菌株tb62在制備表面活性劑中的用途。本發(fā)明還提供了所述的熱反硝化地芽孢桿菌菌株tb62在制備漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶、纖維素酶和半纖維素酶中的用途。本發(fā)明還提供了一種菌劑，將權(quán)利要求1所述的熱反硝化地芽孢桿菌菌株tb62種子液按1％(v/v)的接種量，接種到1l滅菌后的lb培養(yǎng)液中，在搖床(50℃，120rmp)中培養(yǎng)24h，收集培養(yǎng)液，即得菌劑。本發(fā)明還提供了所述的菌劑在促進(jìn)堆肥腐熟中的用途。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：1.本發(fā)明提供的熱反硝化地芽孢桿菌菌株tb62為首次從堆肥高溫期樣品中篩選分離得到的，該菌株耐高溫，生長繁殖快，且能夠產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶。2.本發(fā)明提供的含熱反硝化地芽孢桿菌菌株tb62的菌劑能夠提高堆肥溫度，加速有機(jī)質(zhì)降解和dom降解，提高凱氏氮的含量，促進(jìn)堆肥腐熟。3.本發(fā)明提供的熱反硝化地芽孢桿菌菌株tb62還具有產(chǎn)生物表面活性劑的功能，因此，該菌株可以用于制備表面活性劑。保藏信息說明熱反硝化地芽孢桿菌tb62(geobacillusthermodenitrificans)，保藏編號為cgmcc13530，保藏日期為2017年01月05日，保藏單位為中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。附圖說明圖1為溫度隨堆肥時間變化曲線。rt：室溫，空白組(ck)，實驗組(t)圖2為ph隨堆肥時間變化曲線?？瞻捉M(ck)，實驗組(t)圖3為水分隨堆肥時間變化曲線?？瞻捉M(ck)，實驗組(t)圖4為有機(jī)質(zhì)含量隨堆肥時間變化曲線?？瞻捉M(ck)，實驗組(t)圖5為凱氏氮含量隨堆肥時間變化曲線。空白組(ck)，實驗組(t)圖6為氨氮含量隨堆肥時間變化曲線?？瞻捉M(ck)，實驗組(t)圖7為硝態(tài)氮含量隨堆肥時間變化曲線?？瞻捉M(ck)，實驗組(t)圖8為dom含量隨堆肥時間變化曲線。空白組(ck)，實驗組(t)圖9為geobacillusthermodenitrificanstb62菌落圖。圖10為geobacillusthermodenitrificanstb62在血瓊脂平板上的表現(xiàn)。圖11為葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖12為木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖13為篩選出菌株的凝膠電泳圖譜；有關(guān)附圖標(biāo)記的說明：m-2000bpmake；1-tb21；2-tb22；3-tb23；4-tb24；5-tb25；6-tb41；7-tb42；8-tb43；9-tb44；10-tb45；11-tb61；12-tb62；13-tb63；14-tb64；15-tb65；16-ta65；17-tb46。具體實施方式下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。下述實施例中所用的材料和試劑，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例1：熱反硝化地芽孢桿菌tb62(geobacillusthermodenitrificans)的篩選1.實驗材料與設(shè)備1.1主要試劑表1主要試劑藥品名稱分子式規(guī)格abtsc18h24n6o6s4ar過氧化氫h2o2ar檸檬酸c6h8o7ar檸檬酸鈉na3c6h5o7ar冰醋酸ch3coohar無水醋酸鈉ch3coonaar木糖c5h10o5ar木聚糖(c5h8o4)nar酒石酸鈉c4h5na2o6ar酒石酸c4h6o6ar藜蘆醇c8h12o3ar乳酸c3h6o3ar乳酸鈉c3h5o3naar硫酸錳mnso4ar氫氧化鈉naohar鹽酸hclardns試劑1.2主要儀器與設(shè)備表2主要儀器與設(shè)備1.3培養(yǎng)基細(xì)菌培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂33g，去離子水1000ml；lb培養(yǎng)液：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，去離子水1000ml。2.木質(zhì)素降解菌的分離篩選2.1取樣篩菌的樣品分別為2、4、6天的堆肥樣品，在堆體溫度較高處多點取樣(一般在堆體表面下方10-20cm)，樣品混勻后裝入樣品袋中于-4℃的冰箱里保存。2.2耐高溫菌的篩選及純化稱取樣品10g，加入到含有90ml滅菌處理后的nacl溶液(0.9％w/v)的三角瓶中，置于搖床上振蕩30min，目的是打散菌膠團(tuán)，使細(xì)菌呈單細(xì)胞狀態(tài)分散于溶液中。將滅菌處理后的nacl溶液分別加到7支試管中(同樣滅菌處理過)，每支加入9ml,取震蕩后的菌液1ml分別加入試管，即分別稀釋到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，再分別將各稀釋度下的菌液取0.1ml涂布在細(xì)菌培養(yǎng)基平板上，50℃恒溫培養(yǎng)。每種稀釋梯度的平板均作5個平行?？梢杂^察到細(xì)菌群落在10-5稀釋度下長勢較好。在五個平行平板中選取菌落較大的進(jìn)行分離培養(yǎng)并多次劃線純化。如圖9-10所示，熱反硝化地芽孢桿菌tb62菌落形態(tài)不規(guī)則，菌落較小，表面粗糙，較濕潤，稍透明，淡黃色，菌落邊緣不整齊。3.粗酶液的制取配制lb培養(yǎng)液，滅菌處理，倒入同樣滅過菌的血清瓶中(25ml)，把分離得到的株菌接種到血清瓶中，放入搖床(50℃，120rmp)培養(yǎng)，制備種子液。配制lb培養(yǎng)液，在錐形瓶中倒入100ml，滅菌處理，吸取上述1ml種子液到錐形瓶中，同樣放入搖床培養(yǎng)(50℃，120rmp)，制成菌液。液體產(chǎn)酶培養(yǎng)：菌液經(jīng)5000r/mim離心5min，取上清液作為粗酶液，以熱滅活酶液(取0.6ml粗酶液于離心管，煮沸10min)作為對照。4.酶活的測定方法4.1漆酶(lac)活性的測定1、試劑(1)由該酶氧化abts的速度決定；(2)0.1mol/l檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液:分別稱取2.941g檸檬酸鈉和2.1014g檸檬酸，加去離子水100ml，向檸檬酸鈉中加檸檬酸，用ph計調(diào)ph＝5.0；(3)0.5ml0.5mol/labts；2、操作步驟(1)在25℃時，在試管中加入2ml檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(0.1mmol/l，ph＝5)，和0.5mlabts，將混合液倒入比色皿中；(2)然后添加1ml酶液啟動反應(yīng)，在420nm下測定吸光值變化。3、計算方法酶活定義：為每分鐘氧化1μmol的abts為一個酶活單位，消光系數(shù)ε＝3.6*104[(mol/l)-1cm-1]，酶活單位：u/l漆酶(lac)活力＝δod*106/δt*v酶液*∈＝(δod/δt)*106/0.5*3.6*104式中：δod-測定的相鄰吸光度值差最大的值；δt-δod值對應(yīng)的時間差值；v-酶液的體積。4.2木質(zhì)素過氧化物酶(lip)活性的測定1、試劑(1)0.24mol/l酒石酸鈉緩沖液：分別稱取3.60216g酒石酸和5.52192g酒石酸鈉，加去離子水100ml，向酒石酸鈉中加酒石酸，調(diào)ph＝3.0；(2)0.1ml24mmol/l藜蘆醇；(3)0.05ml6.0mmol/l的h2o2；2、操作步驟(1)在37℃時，總反應(yīng)體系為3ml，向試管中加入1.85ml0.24mol/l酒石酸鈉緩沖液(ph＝3.0)，和0.1ml24mmol/l藜蘆醇和1.0ml酶液；(2)預(yù)熱至37℃將溶液倒入比色皿，然后再添加0.05ml6.0mmol/l的h2o2啟動反應(yīng)，在波長為310nm下測定吸光值變化。3、計算方法酶活定義為每分鐘氧化1μmol的藜蘆醇為一個酶活單位，消光系數(shù)ε＝9.3*103[(mol/l)-1cm-1]。酶活單位：u/l過氧化物酶(lip)活力＝δod*106/δt*v酶液*∈＝(δod/δt)*106/1*9.3*103式中：δod-測定的相鄰吸光度值差最大的值；δt-δod值對應(yīng)的時間差值；v-酶液的體積。4.3錳過氧化物酶(mnp)活性的測定1、試劑(1)0.11mol/l的乳酸鈉緩沖液：稱取1.10098g乳酸和2.05516g乳酸鈉，分別加去離子水100ml,向乳酸鈉中加乳酸，調(diào)ph＝4.5；(2)0.025ml40mmol/l硫酸錳；(3)0.025ml1.6mmol/l的h2o2；2、操作步驟(1)根據(jù)酶在h2o2存在下把mn2+氧化mn3+的速度來決定；(2)總反應(yīng)體積為1ml，向試管中加入0.85ml0.11mol/l的乳酸鈉緩沖液(ph＝4.5)再加入0.025ml、40mmol/lmnso4和1ml的酶液；(3)預(yù)熱37℃后，將溶液倒入比色皿，在比色皿中添加0.025ml1.6mmol/l的h2o2啟動反應(yīng)，在240nm下測定吸光值變化。3、計算方法酶活的定義為每分鐘氧化1μmol的mn2+為mn3+為一個酶活單位，消光系數(shù)ε＝6.5*103[(mol/l)-1cm-1]。酶活單位：u/l錳過氧化物酶(mnp)活力＝δod*106/δt*v酶液*∈＝(δod/δt)*106/1*6.5*103式中：δod-測定的相鄰吸光度值差最大的值；δt-δod值對應(yīng)的時間差值；v-酶液的體積。4.4纖維素酶活性的測定1、試劑(1)0.1mol/l檸檬酸鈉-檸檬酸鈉緩沖液：分別稱取2.941g檸檬酸鈉和2.1014g檸檬酸，加去離子水100ml，向檸檬酸鈉中加檸檬酸，用ph計調(diào)ph＝4.8；(2)1.5mldns；(3)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：1.0000g葡萄糖溶于1000ml的去離子水配制成1mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。2、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線制作取1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液各0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2ml于試管中，補(bǔ)加去離子水至2.0ml，再加入2.0mldns試劑，具塞，沸水浴10min，冷卻后定容至15ml，用分光光度計在波長為550nm下測od值，3次重復(fù)實驗，取均值制圖，葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)曲線參見圖11。由光密度值引得葡萄糖量。3、操作步驟(1)向試管中加入1cm*2cm的whatmanno1定量試紙，再加入1.0cm檸檬酸鈉-檸檬酸鈉緩沖液(0.1mol/l,ph＝4.8)以及0.5ml酶液；(2)在50℃下保溫1h，然后取出加入1.5mldns終止反應(yīng)，再廢水浴5min后流水冷卻，定容至25ml；(3)在540nm下測定其吸光度。4、計算方法纖維素酶活力＝y(tǒng)*1000ug/v酶液/t,其中y由標(biāo)曲得到y(tǒng)＝0.6916x式中：x-測定的吸光度值；t-水浴的時間；v酶液-酶液的體積。4.5半纖維素酶活性測定1、試劑(1)1.8ml1％的木聚糖溶液：用木聚糖以ph＝4.8醋酸緩沖液配成1％溶液；(2)1.8ml醋酸緩沖液：稱取0.82g乙酸鈉，量取0.6ml乙酸，分別加去離子水100ml，向乙酸鈉中加乙酸，調(diào)ph＝4.8；(3)2mldns；(4)木糖標(biāo)準(zhǔn)液：1.0000g木糖溶于1000ml的去離子水配制成1mg/ml的木糖標(biāo)準(zhǔn)液。2、木糖曲線制作取1mg/ml標(biāo)準(zhǔn)木糖液各0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml于試管中，補(bǔ)加去離子水至2.0ml，再加入2.0mldns試劑，具塞、沸水浴10min，冷卻后定容至15ml，用分光光度計在波長為550nm下測od值，3次重復(fù)試驗，取均值制圖，木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線參見圖12。由光密度值引得木糖量。3、操作步驟(1)在15ml刻度試管中加入酶液0.2ml，再各吸取1.8ml1％的木聚糖溶液；(2)空白用0.2ml酶液加1.8ml醋酸緩沖液，不加木聚糖溶液，搖勻；(3)50℃水浴60min，取出后，再吸取2mldns試劑搖勻，具塞，立即沸水浴反應(yīng)10min，冷卻后，補(bǔ)加水定容到15ml，輕輕上下?lián)u勻；(4)用空白調(diào)零點，于波長550nm下測吸光度。4、計算方法按照公式計算：半纖維素酶活力＝y(tǒng)*1000ug/v酶液/t,其中y由標(biāo)曲得到y(tǒng)＝1.1504x+0.008；式中：x-測定的吸光度值；t-水浴的時間；v酶液-酶液的體積。5、結(jié)果表3geobacillusthermodenitrificanstb62菌株產(chǎn)酶活性測定如表3所示，熱反硝化地芽孢桿菌tb62產(chǎn)錳過氧化物酶的活力最高，為136u/l，其次是半纖維素酶，其活力為27u/l，而漆酶、木質(zhì)素過氧化物酶和纖維素酶的活力分別為9u/l、4u/l和5u/l。實施例2：熱反硝化地芽孢桿菌tb62(geobacillusthermodenitrificans)的鑒定2.1實驗主要儀器表4實驗所用儀器2.2實驗步驟2.2.1提取dnadna使用生工《ezup柱式細(xì)菌基因組dna抽提試劑盒說明書》提取。具體操作步驟詳見說明書。2.2.2pcr擴(kuò)增使用2×estaqmastermix進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：反應(yīng)程序：2.2.3pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果使用1％濃度的瓊脂糖凝膠電泳，電壓120v，電泳30min，每孔上樣1ul，電泳圖譜見圖13。如圖13所示，pcr產(chǎn)物電泳結(jié)果表明成功擴(kuò)增了細(xì)菌的16srdna片段。2.2.4測序及比對結(jié)果測序使用引物27f/1492r雙向測序，熱反硝化地芽孢桿菌tb62的序列如seq.1所示。在ncbi基因庫進(jìn)行blastn比對，得菌種鑒定結(jié)果，結(jié)果見表5。表5熱反硝化地芽孢桿菌tb62鑒定數(shù)據(jù)由表5所示，菌株tb62與geobacillusthermodenitrificans相似度達(dá)到99％，因此，將菌株命名為熱反硝化地芽孢桿菌tb62(geobacillusthermodenitrificans)。實施例3：含熱反硝化地芽孢桿菌tb62的菌劑在促進(jìn)堆肥腐熟中的應(yīng)用3.1菌劑制備把tb42種子液按1％(v/v)的接種量，接種到1l滅菌后的lb培養(yǎng)液中，在搖床(50℃，120rmp)中培養(yǎng)24h，收集培養(yǎng)液即為菌劑。添加菌劑組為實驗組(t)，空白組(ck)添加1l滅菌后的lb培養(yǎng)液。3.2堆肥實驗堆肥原料選用牛糞和甘蔗葉，質(zhì)量比17:3，共20kg。堆肥進(jìn)行45d，分別在第0，5，10，16，23，30，45d取樣，測定了溫度，ph，含水率，有機(jī)質(zhì)，凱氏氮，無機(jī)氮，dom含量等參數(shù)。整個堆肥過程接種菌劑兩次，分別在0d和10d。堆體翻堆三次，分別是10d，20d和30d。3.3實驗結(jié)果熱反硝化地芽孢桿菌tb62耐高溫，增長繁殖快，且能夠產(chǎn)木質(zhì)纖維素降解酶。與不添加菌劑的堆肥相比(ck)，添加tb42菌劑的堆肥(t)具有以下優(yōu)勢：(1)從堆肥過程的溫度看，添加tb62菌劑的堆體溫度比不添加菌劑的堆體溫度高。有利于滅殺堆體中病原體及加速堆肥物料的高溫降解，促進(jìn)堆體腐熟(圖1)。(2)由圖2，圖3可知，添加tb62菌劑的堆肥的ph升得更高，水分降得更快，即添加菌劑的堆體反應(yīng)更加劇烈從而導(dǎo)致nh3大量揮發(fā)增加ph，產(chǎn)熱更多帶走大量的水分。(3)從有機(jī)質(zhì)(om)的降解率看，不添加菌劑的om從90.38％下降到78.67，降解率為12.9％，添加tb62菌劑的om從90.67％下降到77.63％，降解率為14.4％(圖4)。(4)從堆體可溶性有機(jī)物(dom)含量變化的角度看，不添加菌劑的dom含量由69.6mg/g下降到9.8mg/g，下降了85.9％，添加tb62菌劑的dom含量由71.4mg/g下降到9.2mg/g，下降了87.1％(圖8)。綜上所述，添加tb62菌劑能夠提高堆肥溫度，加速有機(jī)質(zhì)降解和dom降解，提高凱氏氮的含量，促進(jìn)堆肥腐熟。實施例4：熱反硝化地芽孢桿菌tb62產(chǎn)表面活性劑情況由血瓊脂平板和表面張力儀共同鑒定三株菌產(chǎn)表面活性劑情況。血瓊脂平板制法：取營養(yǎng)瓊脂(北京陸橋)，滅菌處理后，待其冷卻至50℃左右，在無菌環(huán)境于每100ml營養(yǎng)瓊脂加滅菌脫纖維綿羊血5-10ml，輕輕搖勻，立刻傾注于平板，制成斜面?zhèn)溆?。發(fā)酵液表面張力測定：采用環(huán)法測定發(fā)酵液表面張力，采用全自動表面張力儀，儀器型號：bzy-1。實驗證明，熱反硝化地芽孢桿菌tb62能產(chǎn)生表面活性劑。前述對本發(fā)明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變和變化。對示例性實施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。sequencelisting<110>廣西大學(xué)<120>一種熱反硝化地芽孢桿菌菌株tb62及其在促進(jìn)堆肥腐熟中的應(yīng)用<130>zyws<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>1458<212>dna<213>人工序列<400>1tggggggggtgctatacatgcagtcgagcggaccgaacgagagcttgctcttgttcggtc60agcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgcccgcaagaccgggataactccggg120aaaccggagctaataccggataacaccaaagaccgcatggtctttggttgaaaggcggct180tcggctgtcacttgcggatgggcccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctca240ccaaggcgacgatgcgtagccggcctgagagggtgaccggccacactgggactgagacac300ggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgac360ggagcgacgccgcgtgagcgaagaaggccttcgggtcgtaaagctctgttgtgagggacg420aaggagcgccgtttgaataaggcggcgcggtgacggtacctcacgagaaagccccggcta480actacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggggcgagcgttgtccggaattattgggc540gtaaagcgcgcgcaggcggtcctttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtgga600gggtcattggaaactgggggacttgagtgcaggagaggagagcggaattccacgtgtagc660ggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcggctctctggcctgtaa720ctgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacg780ccgtaaacgatgagtgctaagtgttagaggggtcacaccctttagtgctgyagctaacgc840gataagcactccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggg900gcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccagg960tcttgacatcccctgacaacccaagagattgggcgttcccccttcggggggacagggtga1020caggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacg1080agcgcaacccttgcctctagttgccagcattcagttgggcactctagagggactgccggc1140taaaagtcggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggcta1200cacacgtgctacaatgggcggtacaaagggctgcgaacccgcgagggggagcgaatccca1260aaaagccgctctcagttcggattgcaggctgcaactcgcctgcatgaagccggaatcgct1320agtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccg1380tcacaccacgagagcttgcaacacccgaagtcggtgaggtaacccttacggagccagccg1440ccgaaaggtgggcaatgt1458當(dāng)前第1頁12