本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種結(jié)腸癌細胞表面特異性結(jié)合多肽篩選方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于胃癌和食管癌，嚴重影響人類生命健康，目前我國每年新增結(jié)直腸癌確診病例44萬例，每年死亡患者多達23萬人。早發(fā)現(xiàn)、及早切除癌前病變及局灶性癌變能夠有效降低大腸癌病死率。但是由于結(jié)腸癌發(fā)展緩慢，早期癥狀多不明顯，40歲以上無癥狀人群中6％患有早期腸癌，70％-80％結(jié)腸癌患者確診時已經(jīng)進入中晚期，超過25％的患者癌細胞已發(fā)生轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌手術(shù)根治效果差，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，不能切除腫瘤的患者5年生存率幾乎為0。藥物靶向治療雖然取得了很大的成功，但仍然存在許多不足如用于靶向的抗體分子量大，在腫瘤組織中穿透力低，對肝臟和骨髓產(chǎn)生毒性作用；免疫原性強；制備過程及周期較長，價格昂貴等。因此，探索早期診斷和治療結(jié)腸癌的有效措施成為目前科研工作的熱點問題。

腫瘤細胞與正常細胞的不同特性，為尋找特異性靶向結(jié)合腫瘤細胞的分子提供可能，噬菌體展示技術(shù)能夠在腫瘤細胞表面分子未知的狀態(tài)下，親和篩選得到特異性結(jié)合腫瘤的多肽，有助于尋找新的靶向分子用于腫瘤的診斷和靶向治療。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種結(jié)腸癌細胞表面特異性結(jié)合多肽及其在結(jié)腸癌診斷和治療中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的結(jié)腸癌細胞表面特異性結(jié)合多肽，其篩選步驟如下：

步驟(1)：利用全細胞篩選法，將隨機十二肽庫噬菌體克隆株與結(jié)腸癌細胞一同孵育，棄去未與所述的結(jié)腸癌細胞結(jié)合的克隆株，將與所述的結(jié)腸癌細胞結(jié)合的克隆株擴增；

步驟(2)：將步驟(1)循環(huán)4次，最大限度的富集與所述結(jié)腸癌細胞結(jié)合的噬菌體克隆株，得到與結(jié)腸癌細胞具有較高親和力結(jié)合克隆株，進行擴增；

步驟(3)：將上述擴增后的克隆株與正常結(jié)腸上皮細胞孵育，進行負性篩選，去除與正常細胞結(jié)合的非特異性克隆株。

步驟(4)：將最終擴增后克隆株進行序列測定，分析出多肽序列。

較佳地，步驟(2)中采用在液相中進行篩選和驗證，4輪篩選后多次重復(fù)試驗比較各單克隆與結(jié)腸癌細胞結(jié)合前后的平均富集率，檢測各個單克隆的細胞結(jié)合能力，以平均富集率高于陰性對照組的一個數(shù)量級以上的標準確定陽性噬菌體克隆株。

較佳地，所述的步驟(4)中，所述的多肽序列在結(jié)腸癌細胞和組織中均經(jīng)過免疫熒光驗證。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明開創(chuàng)性的采用了噬菌體展示技術(shù)，利用基因工程的手段將外源肽或蛋白基因插入噬菌體特定蛋白基因，外源基因編碼的多肽或蛋白以融合蛋白的形式呈現(xiàn)在噬菌體的表面，被展示的多肽或蛋白能夠保持相對的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。噬菌體庫經(jīng)過生物淘選，即噬菌體庫與靶分子孵育，洗去未與靶分子結(jié)合的克隆株，收集，擴增，富集結(jié)合的克隆株，該過程反復(fù)循環(huán)3-5次，能夠獲得與靶分子特異性結(jié)合的噬菌體克隆株。通過基因測序獲得相應(yīng)多肽序列。該方法方便高效，篩選到的多肽，分子量較小，有效克服了傳統(tǒng)單克隆抗體的免疫過敏反應(yīng)，本發(fā)明通過噬菌體展示技術(shù)，篩選出1條與結(jié)腸癌細胞表面特異性結(jié)合的多肽。該多肽特異性結(jié)合在細胞表面，不與正常細胞結(jié)合，能夠有效區(qū)分結(jié)腸癌細胞和正常細胞，有望成為靶向分子，用于腫瘤的診斷和靶向治療。

附圖說明：

圖1a-c為本發(fā)明實施例中未移植及移植后糖尿病小鼠生存期結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明實施例中移植前與移植后糖耐量損傷小鼠ipgtt結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明實施例中流式細胞術(shù)檢測尿液干細胞表面標記物的結(jié)果圖

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進一步地說明，以更好地理解本發(fā)明。

實施例一：

一、篩選方法：

本實施例結(jié)腸癌細胞表面特異性結(jié)合多肽篩選方法，包括以下步驟：

步驟(1)：利用全細胞篩選法，將隨機十二肽庫噬菌體克隆株與結(jié)腸癌細胞一同孵育，棄去未與所述的結(jié)腸癌細胞結(jié)合的克隆株，將與所述的結(jié)腸癌細胞結(jié)合的克隆株擴增；

步驟(2)：將步驟(1)循環(huán)4次，最大限度的富集與所述結(jié)腸癌細胞結(jié)合的噬菌體克隆株，得到與結(jié)腸癌細胞具有較高親和力結(jié)合克隆株，進行擴增；

步驟(3)：將上述擴增后的克隆株與正常結(jié)腸上皮細胞孵育，進行負性篩選，去除與正常細胞結(jié)合的非特異性克隆株。

步驟(4)：將最終擴增后克隆株進行序列測定，分析出多肽序列。

所述的多肽序列還經(jīng)過免疫熒光驗證。

二、噬菌體滴度測定(titration法)

滅菌后的無抗生素lb液體培養(yǎng)基對擴增后的噬菌體上清液進行100倍等稀釋，然后從稀釋好的每個滴度中各取100ul于離心管中，與500ul對數(shù)生長期的xl1blue菌液混勻，加入3ml于57℃恒溫水浴鍋中保溫的lb頂層瓊脂，混勻后迅速傾倒在四環(huán)素抗性的lb固體平板上，待稍凝固后，放在37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，第二天計數(shù)噬菌斑的數(shù)量，噬菌體的滴度(pfu/100ul)＝噬菌體數(shù)目*稀釋倍數(shù)，即每100ul的噬菌體上清液中包含的噬菌體的數(shù)量，按照這種方法測定擴增出的噬菌體上清的滴度，然后將其滴度稀釋調(diào)整到固定滴度，用于檢驗細胞結(jié)合能力。

三、篩選出與所述的結(jié)腸癌細胞結(jié)合的克隆株的方法如下：

以結(jié)腸癌細colo320hsr細胞為靶細胞，人正常結(jié)腸黏膜上皮細胞ncm460為吸附細胞，進行4輪循環(huán)篩選，保持每一輪的噬菌體投入量。具體篩選程序如下：

步驟(1)：取1皿colo320hsr細胞，將其中懸浮的細胞3000rpm5min收集起來，用1mlpbs重懸，貼壁的細胞用2mlpbs吹打下來，放在兩個ep管里，重懸的懸浮細胞也分成兩份混勻在兩個ep管的細胞中，6000rpm3min，洗1遍，棄去上清液，注意將上清去除干凈，然后每管中加入500ul4％多聚甲醛，室溫下固定20min。同樣的方法處理正常結(jié)腸上皮細胞ncm460。

步驟(2)：用pbs10000rpm3min洗兩遍，將上清去除干凈，每管中加入0.5ml5％脫脂牛奶，封閉1h，10000rpm3min，離心去除牛奶，然后用0.5mlpbs將細胞重懸，混勻在一個ep管中。

步驟(3)：將上述titration滴度測定法中稀釋后滴度為10¹²/100ul的噬菌體取50ul留樣以備滴度測定，取1ml相同滴度的噬菌體加入固定好的colo320hsr細胞中，輕輕吹打?qū)⒓毎c噬菌體混勻，然后將混懸液室溫下低速震蕩1h，待噬菌體和colo320hsr細胞充分結(jié)合后，8000rp，離心3min棄掉上清，然后加入1ml1％pbst(含1％tween-20)重懸后，8000rpm，離心3min，同樣的方法沉淀重復(fù)洗滌4次，洗去沉淀中非特異性結(jié)合的或者未與細胞結(jié)合的噬菌體。

步驟(4)：用0.5ml的xl1blue菌液將沉淀重懸混勻，放在37℃搖床上培養(yǎng)1h，1000rpm，離心5min，收集上清，將其轉(zhuǎn)移至上述固定并封閉后的正常結(jié)腸上皮細胞ncm460中，重懸混勻后室溫下震蕩1h，10000rpm，5min，離心收集上清共500ul。

步驟(5)：取出50ul用于滴度測定，剩余的部分加入1.5ml對數(shù)生長期的xl1blue菌液，混勻后37℃搖床過夜。

步驟(6)：取出過夜擴增的噬菌體-菌液混合液，8000rpm離心20min去除細菌沉淀，收集上清液，然后按著上清液的1/4體積加入peg8000/nacl,在冰上靜置3小時，待液體中的噬菌體充分沉淀后13000rpm，30min，4℃恒溫離心，去除上清液，用0.5mlpbs重懸沉淀。

步驟(7)：按著titration滴度測定法，在相同的實驗條件下，分別測定每輪篩選前加入細胞中的噬菌體上清液，留樣的篩選后的未過夜的噬菌體上清液，peg8000收集的篩選后過夜擴增的噬菌體上清液的滴度，計算每輪篩選后的噬菌體富集率＝(篩選后未過夜的噬菌體上清液的滴度*篩選后噬菌體上清液的體積)/(篩選前加入到細胞中的噬菌體滴度*加入的體積)。

步驟(8)：反復(fù)1-7過程3-5次，與結(jié)腸癌細胞結(jié)合的陽性克隆株不斷富集(圖1a)，挑選21個克隆株，進行與colo320hsr在液相多次重復(fù)驗證其結(jié)合和能力，其中2#，5#，8#，19#號克隆株的平均富集率明顯高于陰性對照組的一個數(shù)量級以上，因此確定陽性噬菌體克隆株(圖1b)。

四、陽性噬菌體克隆的dna序列測定與分析

測序模板的快速純化

本方法非?？焖伲瑹o需酚或?qū)游?，可以產(chǎn)生足夠純的模板進行手工或自動雙脫氧測序。

步驟(1)：噬菌斑擴增離心后，將500μl含噬菌體上清轉(zhuǎn)入一新鮮離心管。

步驟(2)：加200μlpeg/nacl，顛倒混勻，室溫放置10min。

步驟(3)：離心10min，棄上清。

步驟(4)：短暫離心，小心吸去殘余上清。

步驟(5)：沉淀物重懸于100μl碘化物緩沖液中，加入250μl乙醇。室溫孵育10min。短時間的室溫孵育使單鏈噬菌體dna(ssdna)沉淀而大多數(shù)噬菌體蛋白保持在溶液中。

步驟(6)：離心10min，棄上清。用70％的乙醇沉淀，短暫真空干燥。

步驟(7)：沉淀重懸于30μlte[10mmtris-hcl(ph8.0),1mmedta]中。

步驟(8)：5μl的上述模板溶液進行³⁵s或³³p標記的手工雙脫氧測序,或染料標記的自動循環(huán)雙脫氧測序。根據(jù)測序方法的不同，適當(dāng)增減模板用量。

噬菌體單鏈dna序列測定：分別取上述陽性克隆相應(yīng)的模板液5ul，測序分析多肽序列(圖1c)。

五、免疫熒光在驗證合成多肽的特異性

1、細胞上驗證多肽特異性，步驟如下

步驟(1)：將預(yù)先清洗、高壓滅菌的蓋玻片放入24孔培養(yǎng)板。

步驟(2)：取生長狀態(tài)良好的結(jié)腸癌細胞colo320hsr和人正常結(jié)腸黏膜上皮細胞ncm460，用含10％胎牛血清的rpmi-1640培養(yǎng)基制成細胞懸液，細胞計數(shù)后，按個8000孔加入到24孔培養(yǎng)扳。

步驟(3)：將其置于溫箱繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞融合達80％，取出孔板，吸棄培養(yǎng)液，用pbs清洗3次，每次5min。

步驟(4)：用冰甲醇固定細胞爬片，室溫，10min。

步驟(5)：吸棄甲醇，室溫下晾干至發(fā)白；

步驟(6)：用pbs洗3次，每次5min；

步驟(7)：加入10ug/ml的多肽200ul/孔，對照組為隨機肽組cbp-r,實驗組為篩選獲得的多肽cbp-1：lpktvssdmsln，置入37℃孵箱15min；

步驟(8)：pbs洗滌3次，每次5min，避光。

步驟(9)：加入10ug/mldapi，室溫孵育10-30min，pbs洗滌3次，每次5min，避光。

步驟(10)：甘油封片，置于共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄(圖2)。

2、組織上驗證多肽特異性

步驟(1)：取新鮮結(jié)腸癌及癌旁組織oct包埋，切成4um厚的切片，；

步驟(2)：免疫染色洗滌液洗滌5min，加入冰凍切片快速抗原修復(fù)液進行修復(fù)，室溫下5min；

步驟(3)：免疫染色洗滌液洗滌5次，每次10min；

步驟(4)：用3％bsa+0.05％titonx-100封閉，室溫60min；

步驟(5)：0.1％titonx-100洗滌3次，每次5min；

步驟(6)：免疫組畫筆小心圈出輪廓，每張切片加入10ug/ml的多肽對照組為隨機肽組cbp-r,實驗組篩選獲得多肽cbp-1：lpktvssdmsln，200ul，4℃孵育30min；

步驟(7)：pbs洗滌3次，每次5min；

步驟(8)：每張切片加入10ug/mldapi，200ul，室溫下10min

步驟(9)：pbs洗滌3次，每次5min；

步驟(10)：避光，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照(圖3)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明開創(chuàng)性的采用了噬菌體展示技術(shù)，利用基因工程的手段將外源肽或蛋白基因插入噬菌體特定蛋白基因，外源基因編碼的多肽或蛋白以融合蛋白的形式呈現(xiàn)在噬菌體的表面，被展示的多肽或蛋白能夠保持相對的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。噬菌體庫經(jīng)過生物淘選(biopanning)，即噬菌體庫與結(jié)腸癌全細胞孵育，洗去未與癌細胞結(jié)合的克隆株，收集，擴增，富集結(jié)合的克隆株，該過程反復(fù)循環(huán)3-5次，能夠獲得與結(jié)腸癌特異性結(jié)合的噬菌體克隆株。在液相中進行篩選和驗證，每次將整皿的結(jié)腸癌細胞完全收集起來放在液相狀態(tài)下與噬菌體進行一定時間的充分結(jié)合，一方面保證了每次結(jié)合的細胞量一致，從而保證細胞表面的噬菌體結(jié)合位點數(shù)量一致，每次實驗中細胞的狀態(tài)都為新鮮生長的細胞；在液相中進行結(jié)合的篩選實驗，其每次洗滌過程都要經(jīng)過10次以上的吹打過程，而且要經(jīng)過5分鐘的低速離心，pbst相對pbs的洗滌能力大大增強，所以液相環(huán)境中的洗滌強度實際比固相表面篩選過程要大?？梢愿玫臏p輕非特異性結(jié)合作用的影響。需要再洗滌吹打和離心過程中應(yīng)該注意盡量保證細胞結(jié)構(gòu)的完整性，否則造成細胞膜破裂會造成一些目標噬菌體多肽的丟失，通過細胞結(jié)合前后的平均富集率的方法檢測各個單克隆細胞的結(jié)合能力，以平均富集率高于陰性對照組的一個數(shù)量級以上的標準確定陽性噬菌體克隆株。最后，通過與正常結(jié)腸上皮細胞孵育去除與正常結(jié)腸上皮結(jié)合的非特異性結(jié)合克隆。利用正常細胞作為消減細胞目前仍存在較大爭議，有學(xué)者認為這種負性篩選能夠更好地去除非特異性結(jié)合的噬菌體多肽，但也有人認為，由于人類細胞表面分子結(jié)構(gòu)和分布非常復(fù)雜，有可能在負性篩選過程中使特異性噬菌體多肽克隆喪失功能，本發(fā)明中為了避免后者，沒有在四輪體外篩選過程中設(shè)計負性篩選，而是在四輪篩選過后進行一次負性篩選，旨在不影響目標噬菌體多肽功能的前提下盡量降低非特異性噬菌體多肽的影響。最后，通過基因測序獲得相應(yīng)多肽序列。

該方法方便高效，篩選到的多肽，分子量較小，有效克服了傳統(tǒng)單克隆抗體的免疫過敏反應(yīng)，本發(fā)明通過噬菌體展示技術(shù)，篩選出與結(jié)腸癌細胞表面特異性結(jié)合的多肽。該多肽特異性結(jié)合在細胞表面，不與正常細胞結(jié)合，有望成為靶向分子，用于結(jié)腸癌的診斷及靶向治療。

以上對本發(fā)明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對本發(fā)明進行的等同修改和替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。