本發(fā)明屬于動(dòng)物疾病檢測(cè)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及J亞群禽白血病病毒特異性抗原表位、融合蛋白、特異性抗體及其應(yīng)用，尤其是J亞群禽白血病病毒GP85型特異性抗原表位、融合蛋白、特異性抗體及J亞群禽白血病檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
：禽白血病是由禽白血病病毒(ALV)和禽肉瘤病病毒(ASV)引起的禽類腫瘤性疾病，對(duì)我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)危害重大。ALV/ASV可分為A-J10個(gè)亞群，其中A、B和J亞群為發(fā)生于田間雞的外源性病毒。目前該病尚無(wú)有效治療手段，主要通過(guò)排除陽(yáng)性雞凈化種群來(lái)控制該病傳播。J亞型ALV可水平傳播和垂直傳播，垂直傳遞可導(dǎo)致子代免疫耐受，抗體檢測(cè)表現(xiàn)為陰性。同時(shí)發(fā)病雞出現(xiàn)急性腫瘤引起死亡，一旦發(fā)現(xiàn)患病需立即處理。AB亞型ALV主要通過(guò)垂直傳播影響雞雛質(zhì)量，病雞體重增長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)蛋量減少。對(duì)于J亞型和AB亞型ALV的診斷有助于根據(jù)不同亞群病毒引起的機(jī)理和癥狀進(jìn)行禽白血病的防控，而雞場(chǎng)也可根據(jù)成本和需求對(duì)病雞進(jìn)行分批次處理，減少經(jīng)濟(jì)損失?？乖砦皇侵肝挥诳乖肿颖砻婢哂刑厥饨Y(jié)構(gòu)和免疫活性的化學(xué)基團(tuán)，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞并能被其識(shí)別的部位，又稱抗原決定簇，禽白血病病毒RNA編碼區(qū)翻譯gag-pol-env。gag基因編碼病毒內(nèi)部結(jié)構(gòu)的核衣殼蛋白主要有P27、P19、P15、P12四種蛋白，P27蛋白在禽白血病毒中高度保守，已根據(jù)P27蛋白開(kāi)發(fā)出多種禽白血病檢測(cè)試劑盒。但只能用于檢測(cè)ALV病毒不能區(qū)別各病毒亞群。Env是囊膜糖基化表面蛋白，水解后形成膜表面蛋白SU(surfaceglycoprotein)(gp85基因編碼)和跨膜蛋白TM(transmembraneprotein)(gp37基因編碼)，gp85決定病毒亞群特異性和宿主范圍，是抗原表位的主要潛在區(qū)域。目前對(duì)禽白血病特異性亞群特異性抗原表位的研究工作都是基于gp85蛋白進(jìn)行。目前對(duì)亞群特異性抗原表位研究的方法局限于對(duì)所研究的特定亞群gp85蛋白進(jìn)行分析，如定位J亞群抗原表位只針對(duì)J亞群gp85蛋白進(jìn)行分析，檢測(cè)方法中待測(cè)樣品為J亞群特異性血清或ALV-J蛋白制備的鼠單抗，這種方法能找到的J亞群抗原表位但是特異性不強(qiáng)，不能排除找到的抗原表位區(qū)域包含有其他禽白血病亞群的抗原識(shí)別位點(diǎn)。在用重組蛋白對(duì)不同亞型禽白血病病毒感染血清進(jìn)行區(qū)分時(shí)，由于各亞群gp85蛋白存在一定的同源性，所以無(wú)法對(duì)禽白血病抗體亞型進(jìn)行體外診斷。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供J亞群特異性抗原表位，繼而開(kāi)發(fā)檢測(cè)試劑盒用于區(qū)分AB亞群和J亞群禽白血病。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了J亞群禽白血病病毒特異性抗原表位，其氨基酸序列如SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示。申請(qǐng)人通過(guò)比對(duì)不同亞群gp85蛋白序列，找到AB亞群和J亞群gp85蛋白的差異性區(qū)域，從差異性區(qū)域篩選來(lái)源于AB亞群和J亞群的15個(gè)多肽進(jìn)行合成，精確找到可區(qū)分禽白血病AB亞群和J亞群的多肽，同時(shí)免疫實(shí)驗(yàn)分析15個(gè)多肽時(shí)采用AB亞群特異性血清和J亞群特異性血清為樣本，如某J亞群來(lái)源多肽對(duì)J亞群血清有反應(yīng)同時(shí)對(duì)AB亞群血清無(wú)反應(yīng)即為J亞群特異性抗原表位。相比于以前的研究來(lái)說(shuō)，可找到能區(qū)分AB亞群和J亞群的特異性抗原表位。其中，一種J亞群禽白血病病毒特異性抗原表位的氨基酸序列為NGTNRTCVTFGSVCYEENSRSRVCHIFDGNFNGTG(J-Pep5，SEQIDNO：1)。實(shí)驗(yàn)表明，該抗原表位對(duì)J亞群血清有反應(yīng)同時(shí)對(duì)AB亞群血清無(wú)反應(yīng)，能夠特異性識(shí)別J亞群禽白血病病毒。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明所述特異性抗原表位的DNA分子。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，可以存在很多種能夠編碼本發(fā)明所述的特異性抗原表位的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)載體，含有本發(fā)明所述的DNA分子。另一方面，本發(fā)明還提供了一種工程菌，其含有本發(fā)明所述的重組表達(dá)載體。在本發(fā)明中，“工程菌”通過(guò)將重組表達(dá)載體熱激轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞所獲得。本發(fā)明中所表達(dá)的“宿主細(xì)胞”包括原核或真核細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞選自大腸桿菌、酵母、昆蟲(chóng)或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。本發(fā)明所述的特異性抗原表位、DNA分子、重組表達(dá)載體、或所述工程菌都有益于禽白血病的預(yù)防或治療，因此本發(fā)明提供了所述特異性抗原表位、DNA分子、重組表達(dá)載體、或所述工程菌在制備預(yù)防或治療禽白血病的藥物中的應(yīng)用。所述特異性抗原表位、DNA分子、重組表達(dá)載體、或所述工程菌可單獨(dú)使用，也可聯(lián)合使用，或與其它已知藥物聯(lián)合使用。進(jìn)一步的，優(yōu)選的，所述藥物為疫苗?？芍苯幼饔玫交颊叩氖苡绊懫鞴伲部扇斫o藥。本發(fā)明還提供了由所述工程菌表達(dá)的融合蛋白。所述工程菌經(jīng)誘導(dǎo)后表達(dá)，分離純化可獲得表達(dá)的融合蛋白。本發(fā)明所述融合蛋白能夠刺激受體產(chǎn)生抗體，保護(hù)受體抵抗J亞群禽白血病病毒感染。因此，本發(fā)明提供的融合蛋白能夠制成疫苗用于預(yù)防J亞群禽白血病病毒的感染。本發(fā)明還要求保護(hù)一種疫苗，包括本發(fā)明所述融合蛋白。進(jìn)一步的，所述疫苗還包括佐劑。作為優(yōu)選，佐劑為氫氧化鋁佐劑、弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑。本發(fā)明還要求保護(hù)J亞群禽白血病病毒特異性抗體，其是由所述融合蛋白免疫動(dòng)物制備而成的單克隆抗體或多克隆抗體。本發(fā)明所述J亞群禽白血病病毒特異性抗體可以與J亞群禽白血病特異性抗原表位特異性識(shí)別，開(kāi)發(fā)檢測(cè)試劑盒，用于區(qū)分AB亞群和J亞群禽白血病。因此本發(fā)明提供了所述J亞群禽白血病病毒特異性抗體在制備J亞群禽白血病檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。同時(shí)本發(fā)明還提供了一種J亞群禽白血病檢測(cè)試劑盒，其含有：(1)本發(fā)明所述的特異性抗原表位或本發(fā)明所述融合蛋白；和/或(2)本發(fā)明所述的J亞群禽白血病病毒特異性抗體。作為優(yōu)選，所述的J亞群禽白血病病毒特異性抗體可以為單克隆抗體，也可以為多克隆抗體。作為優(yōu)選，本發(fā)明所述的試劑盒中還包括酶標(biāo)板。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明提供的試劑盒可將融合蛋白固定于酶標(biāo)板用于J亞群禽白血病病毒特異性抗體，也可將J亞群禽白血病病毒特異性抗體包被于酶標(biāo)板，用于檢測(cè)融合蛋白。進(jìn)一步的，作為優(yōu)選，本發(fā)明所述試劑盒還包括包被液、封閉液、二抗、顯色液、終止液。由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種J亞群禽白血病病毒特異性抗原表位、融合蛋白、特異性抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明所述J亞群禽白血病病毒特異性抗原表位其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。實(shí)驗(yàn)表明，該抗原表位對(duì)J亞群血清有反應(yīng)同時(shí)對(duì)AB亞群血清無(wú)反應(yīng)，能夠特異性識(shí)別J亞群禽白血病病毒。本發(fā)明所述融合蛋白能夠制成疫苗，刺激受體產(chǎn)生抗體，保護(hù)受體抵抗J亞群禽白血病病毒感染。本發(fā)明所述融合蛋白免疫動(dòng)物可制備J亞群禽白血病病毒特異性抗體。本發(fā)明所述J亞群禽白血病病毒特異性抗體可以與J亞群禽白血病特異性抗原表位特異性識(shí)別，開(kāi)發(fā)檢測(cè)試劑盒，用于區(qū)分AB亞群和J亞群禽白血病。附圖說(shuō)明為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。圖1示ALV-A，ALV-B，ALV-J病毒的gp85蛋白序列比對(duì)圖；圖2為多肽與特異性血清的反應(yīng)效果。具體實(shí)施方式本發(fā)明公開(kāi)了J亞群禽白血病病毒特異性抗原表位及其應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及產(chǎn)品已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。如無(wú)特殊說(shuō)明，本發(fā)明實(shí)施例中所涉及的試劑均為市售產(chǎn)品，均可以通過(guò)商業(yè)渠道購(gòu)買獲得。其中ELISA免疫檢測(cè)方法涉及的試劑具體配置方法為：包被緩沖液(pH9.60.05M碳酸鹽緩沖液):Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，蒸餾水1000mL。洗滌緩沖液(pH7.4PBST)：KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，NaCl8.0g，KCl0.2g，Tween-200.5mL，蒸餾水1000mL。封閉液:牛血清白蛋白BSA5g，洗滌緩沖液100mL。ELISA免疫檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)方法為：(1)多肽包被用DMSO重懸多肽至20mg/ml，在15ml離心管中用包被緩沖液稀釋多肽至20ug/ml，各配制10ml。在96孔酶標(biāo)板中每孔加入100μl多肽包被液置于4℃冰箱過(guò)夜。(2)取出多肽包被板，在水池中甩去包被液，然后每孔加入200μl2％脫脂乳(封閉液)，與37度溫箱孵育2小時(shí)。(3)在水池中甩去封閉液，在吸水紙上控干，然后每孔加入100μl用2％脫脂乳50×稀釋的雞血清，37度溫箱反應(yīng)1小時(shí)。(4)甩去血清樣品，每孔用300μl洗滌液TBST各洗滌3次，濾紙上控干，然后加100μl5000x稀釋的HRP-羊抗雞IgG酶標(biāo)二抗，37度溫箱反應(yīng)1小時(shí)。(5)甩去酶標(biāo)二抗，每孔用300μl洗滌液TBST各洗滌3次，然后每孔再用300μl超純水洗滌兩次。濾紙上控干后，每孔加入100μlTMB底物溶液，等待底物溶液反應(yīng)20分鐘,平板拍照。(6)加入50μl終止液，測(cè)量在OD450的吸光。(7)陽(yáng)性結(jié)果的判定，樣品OD450吸光值大于>陰性對(duì)照均值+2x標(biāo)準(zhǔn)偏差(95％置信區(qū)間)實(shí)施例1、多肽合成：在NCBI上獲取代表流行毒株的ALV-A，ALV-B，ALV-J病毒的gp85蛋白氨基酸序列，蛋白序列號(hào)分別為：gi/559807359、gi/382933114、gi/350606570。用ClustalX2結(jié)合MEGA5.1軟件對(duì)這三個(gè)亞群病毒gp85蛋白比對(duì)結(jié)果如下圖1。從ALV-A，ALV-B，ALV-J病毒的gp85蛋白序列中選取多肽的規(guī)則為比對(duì)結(jié)果AB亞群和J亞群差異大的區(qū)域。選擇了15個(gè)多肽，其中J亞型來(lái)源多肽共7個(gè)，AB亞型來(lái)源多肽共8個(gè)。合成的多肽序列見(jiàn)下表1，通過(guò)多肽固相合成儀合成，并進(jìn)行脫鹽初步純化。表1ALV-A，ALV-B，ALV-J亞群特異性多肽的合成序列編號(hào)序列名稱長(zhǎng)度來(lái)源1GYFFFQMILVCVVIISVVPGVGGJ-Pep123J2VNYILTIGVLVLCEVTGVRADA-Pep221A3NCTTLGTDRLVSSASITGGPDNSTTA-Pep325A4DNSTTLTYRKVSCLLLKLNVSMWEDA-Pep425A5NGTNRTCVTFGSVCYEENSRSRVCHIFDGNFNGTGJ-Pep535J6GTGGAEAELRDFIEKWKGDDHLIRPYVNQSWTMVSPINJ-Pep638J7PINTGSFSISSRYCGFTSNEARYYGGNLSDWCNSKJ-Pep735J8SNSTEPFTVVTADRHNLFTGSEYCGAYGYRFWEA-Pep833A9VNQSREINETEPFSFTVNCTASNLA-Pep922A10GGNCTAEWNYYAYGFTFGKQPEVLWNNGTAJ-Pep1030J11SPNFTTWITYGPNITGHRRSRJ-Pep1121J12APNHTDILKILANSSRTGIRRKAB-Pep1221AB13AIIPCIIKCFQDCLSRTMNQFMDDRIRJ-Pep1327J14VCLPCLLQIVSRSVRKMVDNA-Pep1423A15NSIGYHTEYKKLQKACRQPA-Pep1519A實(shí)施例2、篩選表位識(shí)別區(qū)：用AB亞群和J亞群特異性血清對(duì)15個(gè)多肽進(jìn)行篩選，用間接ElISA法檢測(cè)多肽效果。具體檢測(cè)方法為：取合成的15個(gè)多肽用DMSO重懸至20mg/ml，分別用pH9.6碳酸鹽緩沖液(包被液)稀釋至20μg/ml包被CORNING酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜，未包被組作為對(duì)照用于陰陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)；加2％脫脂乳37℃封閉2h；每孔加300μlPBST清洗，每次倒出液體時(shí)甩干酶標(biāo)板中殘留水分并在干凈的吸水紙上控干，清洗5遍；加AB亞群和J亞群特異性血清100μl/孔，血清稀釋倍數(shù)為50倍、250倍、1000倍，37℃孵育1小時(shí)，清洗5遍；加1：5000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗雞IgY(IgG)酶標(biāo)二抗100μl/孔，37℃孵育1小時(shí)，清洗5遍；加TMB顯色劑100μl/孔，靜止10-15分鐘，加終止液50μl后酶標(biāo)儀檢測(cè)D450值。結(jié)果的判定由檢測(cè)OD450>標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品的均值+2×標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品的標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行陽(yáng)性判定，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上該判定結(jié)果可以達(dá)到95％的置信區(qū)間。采用間接ELISA法通過(guò)AB亞群和J亞群特異性血清篩選到AB亞群特異性抗原表位為J亞群來(lái)源5號(hào)多肽(J-Pep5)NGTNRTCVTFGSVCYEENSRSRVCHIFDGNFNGTG。圖2結(jié)果顯示5號(hào)多肽對(duì)J亞群特異性血清不同稀釋倍數(shù)樣品均有反應(yīng)而對(duì)AB亞群特異性血清不同稀釋倍數(shù)樣品基本無(wú)反應(yīng)，說(shuō)明5號(hào)多肽的亞群特異性，是J亞群禽白血病的抗原表位。實(shí)施例3、檢測(cè)抗原表位的特異性和敏感度：通過(guò)上述ELISA篩選獲得具有特異性的多肽，滿足J亞群來(lái)源多肽只對(duì)J亞群特異血清有反應(yīng)，AB亞群多肽只對(duì)AB亞群特異性血清有反應(yīng)。通過(guò)與田間雞血清的反應(yīng)初步模擬ELISA試劑盒的檢測(cè)效果，樣本共156份：標(biāo)準(zhǔn)陰性血清6份；IDEXX試劑盒(購(gòu)自北京愛(ài)德士元亨生物科技有限公司)檢測(cè)得到的AB特異性血清82份；J特異性血清77份。用間接ElISA法檢測(cè)抗原表位的特異性和敏感度：多肽用pH9.6碳酸鹽緩沖液(包被液)稀釋至20μg/ml包被CORNING酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜；加2％脫脂乳37℃封閉2h；每孔加300μlPBST清洗，每次倒出液體時(shí)甩干酶標(biāo)板中殘留水分并在干凈的吸水紙上控干，清洗5遍；加上述稀釋50倍血清100μl/孔，37℃孵育1小時(shí)，清洗5遍；加1：5000倍稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗雞IgY(IgG)酶標(biāo)二抗100μl/孔，37℃孵育1小時(shí)，清洗5遍；加TMB顯色劑100μl/孔，靜止10-15分鐘，加終止液后酶標(biāo)儀檢測(cè)D450值。結(jié)果的判定由檢測(cè)OD450>標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品的均值+2×標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品的標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行陽(yáng)性判定，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上該判定結(jié)果可以達(dá)到95％的置信區(qū)間。特異度反應(yīng)多肽正確判斷陰性血清的比率，敏感度反應(yīng)多肽正確判斷陽(yáng)性的比率。結(jié)果見(jiàn)表2。計(jì)算公式如下：敏感度＝A/(A+C)*100％；特異度＝D/(B+D)*100％表25號(hào)多肽(J-Pep5)/6號(hào)多肽(J-Pep6)的敏感度特異度表2結(jié)果顯示5號(hào)多肽(J-Pep5)的敏感度和特異度達(dá)到80％以上，適合開(kāi)發(fā)J亞群禽白血病特異性抗體檢測(cè)試劑盒。SEQUENCELISTING<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>J亞群禽白血病病毒特異性抗原表位、融合蛋白、特異性抗體及其應(yīng)用<130>MP1625681<160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>35<212>PRT<213>人工序列<400>1AsnGlyThrAsnArgThrCysValThrPheGlySerValCysTyrGlu151015GluAsnSerArgSerArgValCysHisIlePheAspGlyAsnPheAsn202530GlyThrGly35<210>2<211>37<212>PRT<213>人工序列<400>2GlyThrGlyGlyAlaGluAlaGluLeuArgAspPheIleGluLysTrp151015LysGlyAspAspHisLeuArgProTyrValAsnGlnSerTrpThrMet202530ValSerProIleAsn35當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3