本發(fā)明屬于動物醫(yī)學(xué)的微生物生產(chǎn)領(lǐng)域，具體公開了一種檢測豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗抗原菌含量的選擇性培養(yǎng)基及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬丹毒(Swine erysipelas,SE)是由豬丹毒桿菌(Erysipelothrix rhusiopathiae,ER)引起的一種急性熱性傳染病，其主要特征為高熱、急性敗血癥、皮膚疹塊(亞急性)、慢性疣狀心內(nèi)膜炎及皮膚壞死與多發(fā)性非化膿性關(guān)節(jié)炎(Wood R.L.,Erysipelas,in:Leman,et al.(Eds.),Diseases of swine,Iowa State University Press,Ames,Iowa,1992,pp.475–486)。從這些癥狀的豬體內(nèi)分離到的豬丹毒桿菌大多為血清1型(1a亞型和1b亞型)和2型(Takashi et al.,Protection Effect of NaOH-Extracted Erysipelothrix rhusiopathiae J.Vet.Med.Sci.60(1):9-14.1998)。本病曾經(jīng)被稱為我國“三大傳染病”之一，近年來，隨著養(yǎng)豬集約化發(fā)展豬丹毒逐漸淡出人們的視野，但該病并沒有完全被凈化，在全國各地區(qū)一直都有零星出現(xiàn)，給養(yǎng)豬戶造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(龔平陽，王連想，陽志香.廣東地區(qū)豬場豬丹毒的發(fā)病特點及綜合防控措施[J].畜禽業(yè)總，2010(11)：11－12.)。

目前預(yù)防該疾病主要采用豬丹毒桿菌弱毒疫苗來進(jìn)行免疫防控，我國采用的疫苗主要為豬丹毒弱毒疫苗株G4T10株，該疫苗株是由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院和南京生物藥品廠在20世紀(jì)70年代聯(lián)合研制而成，豬丹毒弱毒株G4T10是強(qiáng)毒株經(jīng)豚鼠370代和在含有0.01％～0.04％吖啶黃血液瓊脂培養(yǎng)基上傳10代獲得的。

為了簡化多次疫苗注射，在中國獸藥監(jiān)察所主持下，華東農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，南京、成都、鄭州和蘭州等生藥廠(1974-1978)年共同參與研制成了豬瘟、豬丹毒、豬肺疫三聯(lián)活疫苗。聯(lián)合疫苗中所用的菌、毒株為豬丹毒G4T10株、豬肺疫EO630及豬瘟兔化弱毒。三種菌、毒液按一定比例混合后分裝凍干而成。也可根據(jù)實際防疫血藥配制二聯(lián)苗。聯(lián)苗接種免疫豬所產(chǎn)生的抗各個病原的免疫力，與各個單苗接種引起的免疫力在強(qiáng)度上基本一致，說明三者之間無相互干擾現(xiàn)象。并且本實驗室前期實驗結(jié)果顯示三聯(lián)苗免疫能分別抵抗豬瘟和豬丹毒溫氏分離株的攻擊。

目前，生產(chǎn)上常用豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗對豬瘟豬丹毒豬肺疫三種疾病進(jìn)行免疫防控，豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗對養(yǎng)殖業(yè)的貢獻(xiàn)不可小窺，其免疫效果直接關(guān)系廣大養(yǎng)殖戶的利益。公知的，疫苗的免疫效果最根本的決定因素是疫苗中有效抗原的含量，但現(xiàn)有技術(shù)中并沒有一種有效的方法能對疫苗中豬丹毒抗原進(jìn)行很好地監(jiān)測。

由此可見，現(xiàn)有技術(shù)存在很大不足。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，有必要針對上述的問題，提供一種檢測豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗抗原菌含量的選擇性培養(yǎng)基及其制備方法，以及將該選擇性培養(yǎng)基應(yīng)用于實驗室檢測的方法；該選擇性培養(yǎng)基及檢測方法在商品化豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)苗中豬丹毒和豬肺疫混合在一起的情況下，仍舊能夠?qū)ωi丹毒抗原菌進(jìn)行準(zhǔn)確測定，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，為生產(chǎn)中監(jiān)測疫苗質(zhì)量穩(wěn)定提供依據(jù)。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種檢測豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗抗原菌含量的選擇性培養(yǎng)基，包括下列組分：TSA(胰蛋白胨大豆瓊脂)29-40mg/ml，牛血清3％～5％，卡那霉素20～80μg/mL，無菌雙蒸水適量。

進(jìn)一步的，所述選擇性培養(yǎng)基，包括下列組分：TSA(胰蛋白胨大豆瓊脂)30mg/ml，牛血清5％，卡那霉素50μg/mL，無菌雙蒸水適量。

進(jìn)一步的，所述選擇性培養(yǎng)基的制備方法包括：稱取TSA粉末溶于適量滅菌雙蒸水中，于121℃高壓16～21min，待其自然放涼至45-55℃，加入牛血清和卡那霉素，攪拌均均即可。

進(jìn)一步的，所述選擇性培養(yǎng)基的制備方法包括：稱取TSA粉末溶于適量滅菌雙蒸水中，于121℃高壓16min，待其自然放涼至50℃，加入牛血清和卡那霉素，攪拌均均即可。

進(jìn)一步的，所述選擇性培養(yǎng)基，在準(zhǔn)確測定豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗中抗原菌含量中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，所述選擇性培養(yǎng)基應(yīng)用于測定豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗中豬丹毒抗原菌含量的方法，包括以下操作：

1)按所述配比備料，用所述制備方法制備選擇性培養(yǎng)基，待用；

2)待檢樣本處理：將樣本三聯(lián)疫苗用無菌生理鹽水稀釋成1mL/頭份，取100μL稀釋于900μL無菌生理鹽水中；重復(fù)上述操作，連續(xù)稀釋6次，取最后一次稀釋液(即第6管)100μL接種于步驟1)制備的選擇性瓊脂平皿中，置于37℃培養(yǎng)24～48h；

所述樣本三聯(lián)苗濃度為(3-20)×10⁸稀釋6次后平板上生長菌落數(shù)為30～200，是便于準(zhǔn)確計數(shù)的最佳菌落數(shù)。

3)對步驟2)所得的菌落進(jìn)行計數(shù)；

所述三聯(lián)苗中豬瘟和豬丹毒抗原含量用普通培養(yǎng)基按現(xiàn)有方法計數(shù)即可。

進(jìn)一步的，所述單聯(lián)疫苗或三聯(lián)疫苗抗原的檢測方法中所述步驟2)中培養(yǎng)時間為36h。

進(jìn)一步的，所述三聯(lián)苗中豬丹毒抗原為豬丹毒G4T10株抗原株；所述豬肺疫抗原為豬肺疫為EO630株。

本發(fā)明有益效果：

本發(fā)明提供的選擇性培養(yǎng)基，組成組分及結(jié)構(gòu)簡單，制備便捷易操作；增加的卡那霉素可以抑制三聯(lián)苗中豬肺疫EO630的生長而不抑制豬丹毒G4T10株的生長，從而能夠分別準(zhǔn)確測定三聯(lián)苗中豬丹毒和豬肺疫兩種細(xì)菌抗原含量；同時，卡那霉素還能防止一些常見菌的干擾。本發(fā)明提供的選擇性培養(yǎng)基的測定方法對三聯(lián)苗中豬丹毒G4T10株和豬肺疫EO630株分別進(jìn)行準(zhǔn)確測定，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，為生產(chǎn)中監(jiān)測疫苗質(zhì)量穩(wěn)定提供依據(jù)，也有利于在采購中監(jiān)測疫苗的質(zhì)量從而保證免疫效果到位。

商品化豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)苗中豬丹毒菌和豬肺疫菌混合在一起，用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺疫菌會競爭性抑制豬丹毒菌生長，故只能對豬瘟和豬肺疫菌進(jìn)行計數(shù)，無法對豬丹毒菌進(jìn)行準(zhǔn)確計數(shù)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)并且利用豬肺疫生長速度快且菌落形態(tài)較豬丹毒大這一特性，提供了所述的選擇性培養(yǎng)基和檢測方法在商品化豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)苗中豬丹毒和豬肺疫混合在一起的情況下，仍舊能夠?qū)ωi丹毒抗原菌進(jìn)行準(zhǔn)確測定，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，為生產(chǎn)中監(jiān)測疫苗質(zhì)量穩(wěn)定提供依據(jù)。彌補(bǔ)了之前無法將三聯(lián)苗中兩種細(xì)菌抗原分別計數(shù)的缺陷，這也解決了臨床使用中對三聯(lián)苗進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控的長期問題。

附圖說明

圖1為豬肺疫EO630單價苗稀釋后接種普通瓊脂平皿后計數(shù)情況。

圖2為豬丹毒G4T10單價苗稀釋后接種普通瓊脂平皿后計數(shù)情況。

圖3為豬丹毒G4T10單價苗和豬肺疫EO630單價苗混合后稀釋后接種普通瓊脂平皿后計數(shù)情況。

圖4為豬丹毒G4T10單價苗和豬肺疫EO630單價苗混合后稀釋后接種選擇性瓊脂平皿后計數(shù)情況。

具體實施方式

為了更好地說明本發(fā)明所解決的問題、所采用的技術(shù)方案和所達(dá)到的效果，現(xiàn)結(jié)合具體實施例和相關(guān)資料進(jìn)一步闡述。需要說明的是，本發(fā)明內(nèi)容包含但不限于以下實施例及其組合實施方式。

若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用試劑均為市售商品，牛血清購自武漢三利公司，TSA購自美國BD公司，卡那霉素購自Sigma公司；豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗，豬丹毒G4T10單價活疫苗，豬肺疫EO630單價活疫苗均購自中牧實業(yè)股份有限公司。

實施例1 準(zhǔn)確性檢驗

(1)瓊脂平皿的制備：

普通瓊脂平皿制備：稱取30gTSA粉末溶于1000mL滅菌雙蒸水中，于121℃高壓16min，待其涼至50℃，加入5％牛血清；

選擇性瓊脂平皿制備：稱取30gTSA粉末溶于1000mL滅菌雙蒸水中，于121℃高壓16min，待其涼至50℃，加入5％牛血清和30mg卡那霉素。

(2)將豬丹毒G4T10單價活疫苗，豬肺疫EO630單價活疫苗分別用無菌生理鹽水稀釋成1mL/頭份，并分別取100μL稀釋于900μL無菌生理鹽水中，并分別連續(xù)進(jìn)行6次，分別取第6次稀釋液中100μL接種于無卡那霉素的普通瓊脂平皿中，置于37℃培養(yǎng)36h，并對菌落進(jìn)行計數(shù)。

(3)將豬丹毒G4T10單價活疫苗，豬肺疫EO630單價活疫苗混合后用無菌生理鹽水稀釋成分別含有豬丹毒和豬肺疫1mL/頭份，并取100μL稀釋于900μL無菌生理鹽水中，連續(xù)進(jìn)行6次，并分別取第6次稀釋液中100μL接種于無卡那霉素的普通瓊脂平皿和含有卡那霉素的選擇性瓊脂平皿中，置于37℃培養(yǎng)36h，并對普通平皿中大菌落很小菌落形態(tài)菌落分別進(jìn)行鑒別計數(shù)，以及對選擇性瓊脂所有菌落進(jìn)行計數(shù)。

鑒別依據(jù)：在普通培養(yǎng)基中豬肺疫菌生長速度較豬丹毒菌快，其菌落形態(tài)較大，直徑為3-4μm，而豬丹毒則較小直徑為1-2μm；而在選擇性培養(yǎng)基中，豬肺疫菌基本被抑制，不可見。

(4)計數(shù)結(jié)果：如表1所示，步驟(2)的計數(shù)結(jié)果分別為117和70，表明豬丹毒G4T10單價活疫苗豬丹毒細(xì)菌含量為11.7×10⁸，豬肺疫EO630單價活疫苗細(xì)菌含量為7×10⁸；步驟(3)中普通平皿大菌落數(shù)為69，小菌落數(shù)為90，表明原豬肺疫EO630單價活疫苗中豬肺疫細(xì)菌含量為6.9×10⁸，表明原豬丹毒G4T10單價活疫苗中豬丹毒細(xì)菌含量為9×10⁸，步驟(3)中選擇性瓊脂計數(shù)結(jié)果為113，表明原豬丹毒G4T10單價活疫苗中豬丹毒細(xì)菌含量為11.3×10⁸，結(jié)果表明普通瓊脂平皿可以準(zhǔn)確測定混合后豬肺疫抗原含量，而豬丹毒抗原含量則需在選擇性平皿中計數(shù)。檢測結(jié)果如圖1、圖2、圖3和圖4所示。

表1實施例1實驗數(shù)據(jù)

本實例中主要體現(xiàn)本發(fā)明選擇性培養(yǎng)基和方法的準(zhǔn)確性，將同一廠家的(選擇同一廠家即是為了保證抗原含量的一致性)三聯(lián)苗對應(yīng)的豬丹毒單苗和豬肺疫單苗分別計數(shù)即為兩種單苗的實際含量，然后我們?nèi)藶閷⑦@兩個已知抗原含量的豬丹毒單苗和豬肺疫單苗混在一起，并分別用本專利發(fā)明的方法和常規(guī)的計數(shù)方法進(jìn)行對比，對比結(jié)果可以看出本專利發(fā)明的方法和兩種單苗的實際含量是一致的，即本發(fā)明選擇性培養(yǎng)基和檢測方法所檢測到的混合疫苗中的各單抗原的量最接近實際含量。

實施例2 重復(fù)性檢驗

(1)按實施例1的步驟(1)制備普通瓊脂平皿和選擇性瓊脂平皿，將豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)苗稀釋成1mL/頭份，并取100μL稀釋于900μL無菌生理鹽水中，連續(xù)進(jìn)行6次，并分別取第6次稀釋液中100μL接種于無卡那霉素的普通瓊脂平皿和含有卡那霉素的選擇性瓊脂平皿中，置于37℃培養(yǎng)36h，并對普通平皿中大菌落很小菌落形態(tài)菌落分別進(jìn)行計數(shù)，以及對選擇性瓊脂所有菌落進(jìn)行計數(shù)，普通平皿中大菌落數(shù)即作為豬肺疫抗原含量，選擇性平皿中菌落數(shù)即為豬丹毒抗原含量。按上述操作進(jìn)行2次重復(fù)。

(2)將兩次重復(fù)的結(jié)果進(jìn)行對比，重復(fù)一：普通瓊脂平皿中大菌落數(shù)為78，小菌落數(shù)為76，則三聯(lián)苗中豬肺疫抗原含量為7.8×10⁸，豬丹毒抗原含量為7.6×10⁸，選擇性瓊脂平皿中菌落數(shù)為108，則三聯(lián)苗中豬丹毒抗原含量為10.8×10⁸；重復(fù)二：普通瓊脂平皿中大菌落數(shù)小菌落數(shù)72，則三聯(lián)苗中豬肺疫抗原含量為7.2×10⁸，豬丹毒抗原含量為8.3×10⁸，選擇性瓊脂平皿中菌落數(shù)為112，則三聯(lián)苗中豬丹毒抗原含量為11.2×10⁸。檢測結(jié)果見表2。

表2待檢樣品檢測結(jié)果

結(jié)果表明兩次重復(fù)相同培養(yǎng)時間，由于普通平皿中豬丹毒菌落生長速度慢被生長速度快的豬肺疫菌落覆蓋從而導(dǎo)致普通平皿對豬丹毒抗原含量計數(shù)重復(fù)性不好且不準(zhǔn)確，而選擇性瓊脂平皿則準(zhǔn)確而且重復(fù)性好。

實施例3 對不同批號豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗的檢測

試驗組：對三個不同批次的豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗分別按照本發(fā)明實施例2中步驟(1)方法進(jìn)行稀釋，接種，培養(yǎng)，然后計數(shù)，普通平皿中大菌落數(shù)即作為豬肺疫抗原含量，選擇性平皿中菌落數(shù)即為豬丹毒抗原含量。

對照組：按實施例1的步驟(1)制備普通瓊脂平皿和選擇性瓊脂平皿，將豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)苗稀釋成1mL/頭份，并取100μL稀釋于900μL無菌生理鹽水中，連續(xù)進(jìn)行6次，并分別取第6次稀釋液中100μL接種于無卡那霉素的普通瓊脂平皿和中，置于37℃培養(yǎng)36h，并對普通平皿中大菌落很小菌落形態(tài)菌落分別進(jìn)行計數(shù)，普通平皿中大菌落數(shù)即作為豬肺疫抗原含量，普通平皿中小菌落數(shù)即為豬丹毒抗原含量。

上述兩組實驗結(jié)果如表3所示：

表3不同批次三聯(lián)苗中細(xì)菌抗原含量測定結(jié)果

表3中可以看出，本發(fā)明的方法對豬瘟豬丹毒豬肺疫三聯(lián)活疫苗細(xì)菌抗原含量的測定較現(xiàn)有技術(shù)的測定方式更接近實際含量，即更為準(zhǔn)確。

以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。