本發(fā)明涉及基因重組和干細胞應(yīng)用領(lǐng)域。具體的，本發(fā)明提供了一種可表達分泌型trail蛋白可溶性片段的構(gòu)建體，以及包含所述構(gòu)建體的慢病毒表達載體，以及在其基因組上整合了所述構(gòu)建體的干細胞，其可表達和分泌所述trail蛋白片段。本發(fā)明還提供了所述構(gòu)建體或載體或干細胞在治療腦瘤或制備腦瘤藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(tumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand,trail)是腫瘤壞死因子超家族中的一員，主要通過與細胞表面的死亡受體(dr4和dr5)結(jié)合，啟動外源性凋亡途徑，從而誘導腫瘤細胞產(chǎn)生凋亡。并且，該凋亡誘導活性主要是針對腫瘤細胞，而對正常細胞不產(chǎn)生殺傷作用，因此具有一定腫瘤特異性。獲得trail蛋白最經(jīng)濟的方式是基因工程表達純化，目前多用的表達系統(tǒng)包括大腸桿菌原核表達系統(tǒng)和細胞真核表達系統(tǒng)。由于trail蛋白是哺乳動物起源，因此真核細胞表達系統(tǒng)具有更好的兼容性。

真核細胞表達trail蛋白過程中有3個問題需要解決。1.trail的可分泌性：一般的真核細胞表達載體缺乏有效的分泌型信號肽序列，不能將表達的目的蛋白輸送到細胞外培養(yǎng)基當中去，而是累積在細胞內(nèi)部，一方面影響了目的蛋白的積累，另一方面也為后續(xù)分離純化過程增加了困難。2.trail蛋白的可溶性：trail蛋白分子的氨基端為疏水區(qū)跨膜結(jié)構(gòu)，集中大量疏水氨基酸殘基，導致trail蛋白水溶性很差，在溶液中易集聚成團而失去活性。3.構(gòu)建的基因工程細胞基因穩(wěn)定性，普通真核細胞表達載體，將目的基因片段帶入宿主細胞基因組中后，并不能穩(wěn)定存在，目的基因隨著宿主細胞傳代分裂過程會逐漸丟失，因此需要不斷的抗生素選擇和單克隆細胞篩選。

本領(lǐng)域仍需要獲得能夠穩(wěn)定和高效表達和分泌有活性的trail蛋白或片段的構(gòu)建體、載體和宿主細胞。本領(lǐng)域更需要能夠用于治療有關(guān)疾病和用于制備相關(guān)藥物的能夠穩(wěn)定和高效表達和分泌有活性的trail蛋白或片段的構(gòu)建體、載體和宿主細胞。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對以上問題，提供了在其基因組上整合了外源核酸的間充質(zhì)干細胞，其可穩(wěn)定和高效表達和分泌trail蛋白片段。為此，本發(fā)明還構(gòu)建了一種可表達分泌型trail蛋白可溶性片段的慢病毒表達載體，該載體可穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染哺乳動物宿主細胞，并可將表達的trail蛋白可溶性片段分泌到宿主細胞外的細胞培養(yǎng)液中，便于后續(xù)的收集，分離和純化。本發(fā)明還提供了所述間充質(zhì)干細胞在治療trail相關(guān)疾病或制備藥物中的應(yīng)用，這些疾病包括癌癥或腫瘤，特別是腦瘤。

具體的，本發(fā)明提供了一種分離的構(gòu)建體，其中，所述構(gòu)建體包含(1)分泌信號肽編碼區(qū)；(2)trail蛋白三聚體穩(wěn)定結(jié)構(gòu)編碼區(qū)；和(3)trail蛋白片段編碼區(qū)，

其中所述trail蛋白片段具有與下列(a)或(b)的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列：

(a)trail的114～281氨基酸殘基的；

(b)與(a)的氨基酸序列具有至少90％同一性，更優(yōu)選地至少95％同一性，例如至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，或至少99％同一性，并且具有trail蛋白活性。

真核生物的分泌信號肽存在于待分泌或?qū)⒊蔀榭缒げ糠值牡鞍踪|(zhì)上，通常位于蛋白質(zhì)的n-末端。本發(fā)明所指的信號肽可以是異源的信號肽，即為非天然地可操作地連接于蛋白質(zhì)或多肽的信號肽。信號肽的使用可以令目標蛋白質(zhì)或多肽可分泌到產(chǎn)生其的細胞外或分泌增加。常見的信號肽包括原纖蛋白分泌信號肽、生長因子信號肽、激素信號肽、細胞因子信號肽和免疫蛋白信號肽等。信號肽的例子包括gdf信號肽、igf信號肽、bmp信號肽、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號肽、pdgf信號肽和egf信號肽、激素信號肽(例如生產(chǎn)激素、胰島素、adh、lh、fsh、acth、msh、tsh)、或白細胞介素信號肽。這些信號肽多來自哺乳動物來源的，例如人、小鼠、大鼠、豬、猴等，優(yōu)選的，本發(fā)明使用的信號肽是小鼠或人來源的。所述信號肽還可經(jīng)過修飾，以增強其幫助蛋白質(zhì)分泌的能力。

其中本發(fā)明的構(gòu)建體中采用的所述分泌信號肽可選自人原纖維蛋白分泌信號肽，人生長激素分泌信號肽，人免疫球蛋白信號肽，人白細胞介素2信號肽等。

本發(fā)明優(yōu)選使用的分泌信號肽為來源于人原纖維蛋白的分泌信號肽。人原纖維蛋白(humanfibrillin-1)，或人原纖蛋白，由sakaily,keenedr,engvalle等在1986，j.cellbiol.103，“fibrillin,anew350-kdglycoprotein,isacomponentofextracellularmicrofibrils”進行了報道。人原纖維蛋白是一種可分泌的糖蛋白，由成纖維細胞分泌到細胞外基質(zhì)。人原纖維蛋白分泌信號肽具有如下氨基酸序列：mrrgrlleialgftvllasytshgada?？删幋a人原纖維蛋白分泌信號肽的核酸序列可用于本發(fā)明的構(gòu)建體中。本發(fā)明的構(gòu)建體中，優(yōu)選的所述分泌信號肽編碼區(qū)具有seqidno：2所示的序列。

在本發(fā)明的構(gòu)建體中，其中所述trail蛋白三聚體穩(wěn)定結(jié)構(gòu)用于幫助形成穩(wěn)定的trail蛋白或trail片段的三聚體形式。trail蛋白或trail片段的三聚體形式相對于單體更穩(wěn)定，活性更好。本發(fā)明可用的三聚體穩(wěn)定結(jié)構(gòu)序列包括異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)等。

在本技術(shù)領(lǐng)域中已知的，在多種天然蛋白中發(fā)現(xiàn)有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域或異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)存在。亮氨酸拉鏈(leucinezippers)結(jié)構(gòu)是指在反式因子的一段肽鏈中每隔7個氨基酸殘基就有一個亮氨酸殘基出現(xiàn)，這段肽鏈所形成的螺旋出現(xiàn)一個由亮氨酸殘基構(gòu)成的疏水面，而另一面則是由親水性氨基酸殘基所構(gòu)成的親水面。由亮氨酸殘基組成的疏水面即為亮氨酸拉鏈條，兩個具有亮氨酸拉鏈條的反式因子，就能借疏水作用形成二聚體或多聚體例如三聚體。亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域或異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)可以相互作用形成二聚體或者三聚體。本發(fā)明的構(gòu)建體中包含的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域或異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)可以促進融合蛋白的寡聚化因而能夠增加穩(wěn)定性。適合的人源亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域例如人c-fos，c-jun，c-myc，max和mdx1蛋白所含有的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明中，可選擇優(yōu)化并且經(jīng)實驗證明可使得表達的trail蛋白片段形成三聚體的亮氨酸拉鏈或異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)序列。發(fā)明人通過設(shè)計和測試，得到了優(yōu)化的編碼異亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)序列的核酸序列。本發(fā)明的構(gòu)建體中，優(yōu)選的所述trail蛋白三聚體穩(wěn)定結(jié)構(gòu)編碼區(qū)具有seqidno：3所示的序列。

在本發(fā)明的構(gòu)建體中，其中所述trail蛋白片段為seqidno：1所示的氨基酸序列第114-281個氨基酸的片段。

本領(lǐng)域已知人trail是由281個氨基酸組成的ii型跨膜蛋白。wiley,s.r.等在identificationandcharacterizationofanewmemberofthetnffamilythatinducesapoptosis.immunity3,673-682(1995)進行了報道。trail蛋白的氨基酸序列如seqidno：5所示。

本發(fā)明的構(gòu)建體包含的trail編碼區(qū)編碼的蛋白質(zhì)可以是帶有活性的trail的片段，即具有trail的281個氨基酸的氨基酸序列的一個連續(xù)部分，該部分具有trail蛋白的活性。本發(fā)明優(yōu)選的trail片段包括，例如，seqidno：1所示的trail的114～281氨基酸殘基的片段。本領(lǐng)域已知，trail的胞內(nèi)n-末端無信號肽，活性部分位于胞外114～281氨基酸殘基。人trail的114～281氨基酸殘基還可形成同源三聚體,在其頂部附近有鋅結(jié)合位點,對維持trail的及穩(wěn)定性起重要作用。

本發(fā)明的構(gòu)建體包含的trail編碼區(qū)編碼的蛋白質(zhì)也可以具有與trail的114～281片段基本上相同的氨基酸序列。在本文，“基本上相同的氨基酸序列”是指氨基酸序列中一個到幾個(例如2、3、4或5個)氨基酸被置換、缺失、添加或插入，其與該氨基酸序列相比具有相同或相似或更好的活性。

本發(fā)明的構(gòu)建體可通過使用常規(guī)dna合成制備。所述構(gòu)建體可通過常規(guī)基因工程方法插入表達載體；用得到的重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主細胞；培養(yǎng)得到的轉(zhuǎn)化體；和從培養(yǎng)物中收集所述多肽?？蓞⒄绽缫韵挛墨I中描述的方法進行：molecularcloning,t.maniatis等人,cshlaboratory(1983)。

本發(fā)明還提供了一種載體，其包含上述的構(gòu)建體。本發(fā)明的載體可以是質(zhì)粒、噬菌體和病毒等，在可表達蛋白的基因工程宿主中能夠獨立復(fù)制并具有選擇標記。載體在進入宿主細胞中，得到擴增和表達。合適的基因工程宿主是本領(lǐng)域公知的，可以是大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞等。優(yōu)選的，本發(fā)明的所述載體為在動物細胞表達的載體，例如非病毒載體，桿狀病毒表達載體，腺病毒載體，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體?？捎米鞅景l(fā)明的載體優(yōu)選為慢病毒載體，例如慢病毒載體pcdh，具體而言是具有前述本發(fā)明的構(gòu)建體的pcdh。在本發(fā)明的其中一個例子本發(fā)明提供了如實施例制備得到的pcdh-setrail。

本發(fā)明還提供了一種細胞，特別是哺乳動物細胞，例如人、小鼠、大鼠、豬、猴的細胞，其基因組上整合了上述本發(fā)明的構(gòu)建體，并且可表達和分泌所述trail蛋白片段。

上述本發(fā)明的哺乳動物細胞可以為干細胞、淋巴細胞，t細胞，b細胞，巨噬細胞，成纖維細胞，腫瘤細胞等。優(yōu)選的，本發(fā)明提供了在其基因組上整合了前述本發(fā)明的構(gòu)建體，并且可表達和分泌trail蛋白片段的干細胞，例如間充質(zhì)干細胞。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcell，msc)是成體干細胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。間充質(zhì)干細胞具有多向分化潛能、造血支持和促進干細胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點。研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)或體外特定的誘導條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能。根據(jù)來源，間充質(zhì)干細胞可分為臍帶間充質(zhì)干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞，脂肪間充質(zhì)干細胞等。

在本發(fā)明的其中一個方面，本發(fā)明提供的所述其基因組上整合了上述本發(fā)明的構(gòu)建體，并且可表達和分泌所述trail蛋白片段的哺乳動物細胞是通過下述方法制備的：

a.構(gòu)建如前所述的本發(fā)明的構(gòu)建體，所述構(gòu)建體包含(1)分泌信號肽編碼區(qū)；(2)trail蛋白三聚體穩(wěn)定結(jié)構(gòu)編碼區(qū)；和(3)trail蛋白片段編碼區(qū)，

其中所述trail蛋白片段具有與下列(a)或(b)的氨基酸序列相同或基本上相同的氨基酸序列：

(a)trail的114～281氨基酸殘基；

(b)與(a)的氨基酸序列具有至少90％同一性，更優(yōu)選地至少95％同一性，例如至少99％同一性，并且具有trail蛋白活性；

b.制備包含上述構(gòu)建體的載體，優(yōu)選的，所述載體為動物細胞表達載體，優(yōu)選為慢病毒載體，例如pcdh；

c.用所述載體感染哺乳動物細胞，所述哺乳動物細胞優(yōu)選為干細胞，例如間充質(zhì)干細胞。

本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)trail蛋白的方法，所述方法包括用上述的載體來轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞，在所述哺乳動物細胞中表達trail蛋白，所述trail蛋白可分泌到宿主細胞外的培養(yǎng)液中。

本發(fā)明提供了一種用于治療與trail有關(guān)的疾病的藥物組合物，其含有上述本發(fā)明的任意一種構(gòu)建體或載體或細胞。

本發(fā)明提供了上述本發(fā)明的任意一種構(gòu)建體或載體或細胞或其藥物組合物在治療與trail有關(guān)的疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了利用上述本發(fā)明的任意一種構(gòu)建體或載體或細胞或其藥物組合物在制備治療與trail有關(guān)的疾病的藥物中的用途。

本領(lǐng)域已知trail通過dr4和dr5兩種受體來誘導凋亡反應(yīng)。因此，本發(fā)明的任意一種構(gòu)建體或載體或細胞或其藥物組合物可用于治療目標細胞上帶有dr4或dr5受體的疾病。

本發(fā)明可治療的疾病包括癌癥和腫瘤，例如腦癌。本發(fā)明可治療的腦瘤包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioma)和腦膜瘤(meningioma)等。神經(jīng)膠質(zhì)瘤包括成膠質(zhì)細胞瘤(glioblastoma)、惡性星形細胞瘤(anaplasticastrocytoma)、神經(jīng)膠質(zhì)肉瘤(gliosarcoma)、退行性少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤(anaplasticoligodendroglioma)、退行性神經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤(anaplasticganglioglioma)、成松果體細胞瘤(pineoblasoma)、成神經(jīng)管細胞瘤(medullobastoma)等。

附圖說明

圖1經(jīng)雙酶切回收的分泌型trail蛋白可溶性片段表達基因的瓊脂糖凝膠電泳圖。右側(cè)為目的dna條帶，左側(cè)為invitrogen公司1kbplusdnaladder分子量marker。目標核酸片段約為711bp。

圖2經(jīng)雙酶切回收的慢病毒表達載體pcdh質(zhì)粒dna電泳圖。左側(cè)為目的dna條帶，右側(cè)為使用的invitrogen公司1kbplusdnaladder分子量marker。目標核酸片段約為8,000bp。

圖3hek293細胞經(jīng)慢病毒包裝四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染48小時后的熒光顯微照片。gfp為熒光下照片，light為同一視野下白光照片，merge為兩個視野的整合照片。

圖4慢病毒顆粒感染msc細胞的熒光和白光顯微照片。gfp為熒光下照片，light為同一視野下白光照片，merge為兩個視野的整合照片。

圖5檢測trail蛋白的elisa標準曲線。橫坐標為450nm處吸光值，縱坐標為trail蛋白標準品濃度(pg/ml)。

圖6mts法檢測感染了慢病毒的msc細胞上清液條件培養(yǎng)基對u87腫瘤細胞的生長抑制作用。

圖7感染慢病毒載體的msc細胞分泌trail蛋白的穩(wěn)定性。

圖8感染慢病毒載體的msc細胞在小鼠中抑制u87實體腫瘤。

具體實施方式

實施例1編碼分泌型trail蛋白可溶性片段的構(gòu)建體的制備

(1)合成具有以下seqidno：4的核苷酸序列的雙鏈dna分子。

seqidno：4：

tctagagccatgggtcgtcgagggcgtctgctggagatcgccctgggatttaccgtgcttttagcgtcctacacgagccatggggcggacgcccgtatgaaacagatcgaagacaaaattgaggagatccttagcaagatttaccatatagaaaacgagatcgctcgtattaaaaagcttatcggtgaacgtgaattcgtgagagaaagaggtcctcagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagcaacacattgtcttctccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcctgggaatcatcaaggagtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactggtcatccatgaaaaagggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcaggaggaaataaaagaaaacacaaagaacgacaaacaaatggtccaatatatttacaaatacacaagttatcctgaccctatattgttgatgaaaagtgctagaaatagttgttggtctaaagatgcagaatatggactctattccatctatcaagggggaatatttgagcttaaggaaaatgacagaatttttgtttctgtaacaaatgagcacttgatagacatggaccatgaagccagttttttcggggcctttttagttggctaaggatcc。

其中包括了xbai位點tctaga，kozak位點gccatgggt，以及

分泌信號肽編碼區(qū)序列：

cgtcgagggcgtctgctggagatcgccctgggatttaccgtgcttttagcgtcctacacgagccatggggcggacgcc(seqidno：2)；

三聚體穩(wěn)定結(jié)構(gòu)編碼區(qū)序列：

cgtatgaaacagatcgaagacaaaattgaggagatccttagcaagatttaccatatagaaaacgagatcgctcgtattaaaaagcttatcggtgaacgt(seqidno：3)；

編碼trail蛋白第114-281個氨基酸的核酸序列：

gtgagagaaagaggtcctcagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagcaacacattgtcttctccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcctgggaatcatcaaggagtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactggtcatccatgaaaaagggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcaggaggaaataaaagaaaacacaaagaacgacaaacaaatggtccaatatatttacaaatacacaagttatcctgaccctatattgttgatgaaaagtgctagaaatagttgttggtctaaagatgcagaatatggactctattccatctatcaagggggaatatttgagcttaaggaaaatgacagaatttttgtttctgtaacaaatgagcacttgatagacatggaccatgaagccagttttttcggggcctttttagttggc(seqidno：1)；

以及bamhi位點ggatcc。

(2)雙鏈dna分子的雙酶切和膠回收：

合成的雙鏈dna分子經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶xbai和bamhi(neb公司)充分消化，消化產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析，以qiagene公司的膠回收試劑盒純化711bp的核酸片段(圖1)。

實施例2分泌型trail蛋白可溶性片段慢病毒表達載體pcdh-setrail的構(gòu)建

(1)pcdh載體的雙酶切：將pcdh載體質(zhì)粒(systembiosciencescatalog:cd513b-1)經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶xbai和bamhi(neb公司)充分消化，消化產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析，以qiagene公司的膠回收試劑盒純化約8000bp片段(圖2)。

(2)酶切產(chǎn)物的連接及轉(zhuǎn)化：將經(jīng)過實施例1得到的酶切回收的711bp片段編碼dna和與經(jīng)同樣酶切回收的8,000bppcdh質(zhì)粒dna以5:1的摩爾比例混合，并以t4dna連接酶(neb公司)16℃連接過夜，構(gòu)建成表達載體pcdh-setrail。

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌stbls感受態(tài)細胞(stbls感受態(tài)細胞購自genecopoeia公司，轉(zhuǎn)化操作按f.奧斯伯，r.布倫特，r.e.金斯頓，d.d.穆爾，j.g.塞德曼，j.a.史密斯，k.斯特拉爾《精編分子生物學實驗指南》美國紐約johnwiley&sons出版社1995年第三版p39-40)，以氨卞青霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子。

(3)表達載體pcdh-setrail的驗證：將挑選的陽性轉(zhuǎn)化子擴培，提取質(zhì)粒dna(質(zhì)粒dna提取方法按j.薩姆布魯克，e.f.費里奇，t.曼尼阿蒂斯《分子克隆實驗指南》美國紐約冷泉港出版社2001年第三版p27-30)，并進行dna測序證實連接正確。

實施例3表達分泌型trail蛋白可溶性片段慢病毒顆粒的包裝和轉(zhuǎn)染

(1)表達質(zhì)粒pcdh-setrail和輔助質(zhì)粒濃度和純度的測定

采用第三代慢病毒包裝系統(tǒng)，除表達質(zhì)粒pcdh-setrail外，還同時采用包裝質(zhì)粒pmdlg/prre(購自addgene，catalog：12251)；包裝質(zhì)粒prsv-rev(購自addgene，catalog：12253)；外殼蛋白質(zhì)粒pmd2g(購自addgene，catalog：12259)共同完成病毒顆粒的包裝。

首先以nanodrop分光光度計分析各質(zhì)粒dna的純度和濃度。結(jié)果如表.1所示：

表1各質(zhì)粒dna的濃度和純度分析結(jié)果

(2)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染hek293細胞株

共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒配方(每15cm培養(yǎng)皿)：

*tebuffer(10mmtirsph8.0,1mmedta)

#hbs(280mmnacl,50mmhepes,1.5mmna2hpo4.h2o,10mmkcl,12mmdextrose)

轉(zhuǎn)染：

a.轉(zhuǎn)染前一日，將hek293細胞(購自clontech公司,cat.no632180)接種于15cm細胞培養(yǎng)皿中，控制使接種日細胞密度達到80％左右；

b.各質(zhì)粒組分，cacl2溶液，tebuffer充分混合在一個50ml的離心管中，并將以上混合物緩慢的加入另一個已經(jīng)放置了hbs溶液的離心管中；

c.中速震蕩混勻，并加入各細胞培養(yǎng)皿中，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

d.轉(zhuǎn)染后16小時，小心吸走培養(yǎng)基，并換液以含10％fbs的dmem培養(yǎng)基；

e.繼續(xù)培養(yǎng)48小時，以熒光顯微鏡觀察細胞的熒光信號。

圖3為被四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的hek293細胞株的熒光顯微照片。結(jié)果如圖3所示。gfp為熒光下照片，light為同一視野下白光照片，merge為兩個視野的整合照片。

(3)病毒顆粒收集

a.收集上述細胞培養(yǎng)上清液；

b.在4℃下，以800g離心10min，收集上清液；

c.上清液過0.45μm的微孔濾膜，保留濾過液；

d.每四倍體積的濾過液，加入一倍體積預(yù)冷的peg-itvirusprecipitationsolution(systembiosciencescatalog:lv810a-1)，充分混勻，在4℃靜置過夜下，以1,500g離心30min，獲得病毒顆粒沉淀；

e.病毒顆粒以適量tbs溶液(800mgnacl,20mgkcl,300mgtris堿，溶于100ml去離子水中，ph8.0)重懸成病毒顆粒儲液，分裝并保存于-80℃。

實施例4表達可分泌型trail慢病毒滴度的測定

1.hek293細胞接種于96孔板內(nèi)，接種密度為4,000個細胞每孔，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；

2.以含8μg/ml的polybrene的dmem培養(yǎng)基(含10％fbs)，十倍梯度稀釋制備的病毒儲液

3.小心吸走96孔板中的培養(yǎng)基，并以以上含有梯度稀釋病毒顆粒的培養(yǎng)基，加入各孔，每個濃度處理組三個孔重復(fù)。

4.繼續(xù)培養(yǎng)48小時，在熒光顯微鏡下觀察具有綠色熒光信號的hek293細胞，記錄有熒光信號出現(xiàn)的最低稀釋度(表2)，并以如下公式計算病毒顆粒儲液的滴度：

滴度(tu/μl)＝1/10x10^(n-1)

n為梯度稀釋系數(shù)

表2滴度測定熒光信號檢測結(jié)果(√表示有熒光，x表示無熒光)

由表2結(jié)果和上述公式計算

pcdh-setrail慢病毒滴度為1×10⁶tu/μl

pcdh(空載體對照)慢病毒滴度為1×10⁶tu/μl

實施例5表達可分泌型trail慢病毒對人間充質(zhì)干細胞的感染

1、臍帶來源的人間充質(zhì)干細胞細胞的制備

胎兒娩出后即刻按產(chǎn)科常規(guī)結(jié)扎斷臍截取臍帶，用生理鹽水沖洗臍帶，再用醫(yī)用酒精消毒，將臍帶置于臍帶保存液中2-8℃恒溫保存。

用0.9％氯化鈉注射液沖洗獲得的臍帶，重復(fù)2～3次，去除血漬。75％乙醇浸沒整根臍帶消毒滅菌。氯化鈉注射液重復(fù)洗滌去除殘留乙醇。用無菌手術(shù)剪將臍帶剪成約2～5cm數(shù)段，清除臍帶小段血管中淤血和凝塊。位于羊膜與血管之間的白色結(jié)締組織即為華通氏膠，用有齒鑷將其撕下，放入無菌平皿中，加入適量0.9％氯化鈉注射液，洗滌膠體。用無菌組織剪將稱重后的華通氏膠體剪切成1～4mm³的組織勻漿塊，加入0.9％氯化鈉注射液，離心800～900g,5min。收集末次洗滌液送檢無菌。根據(jù)膠體重量，加入適量培養(yǎng)基，定容組織勻漿濃度約為04～0.7g/ml，移液器吹打組織勻漿塊均勻后，將組織勻漿塊接種于t75培養(yǎng)瓶中，加入培養(yǎng)基混合培養(yǎng)。

平置培養(yǎng)瓶使組織勻漿塊盡量均勻分布于整個底面，將培養(yǎng)瓶放置于二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱。培養(yǎng)條件：37.0±0.5℃，二氧化碳體積分數(shù)為5.0±0.2％。

第一次換液：組織塊培養(yǎng)至第5～7天進行全量換液。將培養(yǎng)瓶中的未貼壁的組織塊和舊的培養(yǎng)基一起合并轉(zhuǎn)移到離心管，800～900g，離心5min，去掉上清液，將離心后的殘余組織塊，加入適量新鮮培養(yǎng)基，移液管吹打均勻，等量均分到原來的培養(yǎng)瓶，然后加培養(yǎng)基。平置培養(yǎng)瓶使組織塊盡量均勻分布于整個底面，放置co2恒溫恒濕培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

第二次換液：培養(yǎng)第10～13天換液。稍稍傾斜培養(yǎng)瓶，移液管輕輕吸掉半量舊的培養(yǎng)基，加入等量新鮮培養(yǎng)基。放置co2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

組織塊培養(yǎng)的第14～18天，細胞克隆團的面積百分比到達70％～80％時，消化收獲。去除培養(yǎng)基上清液，0.9％氯化鈉注射液洗滌細胞。培養(yǎng)瓶中加入適量消化酶，直至浸潤培養(yǎng)瓶底面。靜置1min后，取培養(yǎng)瓶，倒置顯微鏡下觀察，細胞呈圓形，大部分貼壁組織塊和細胞脫落，終止消化(消化時間不超過5min)。細胞懸液移入離心管中，少量0.9％氯化鈉注射液沖洗瓶壁，洗滌液轉(zhuǎn)入離心管中，移液管吹打懸浮后靜置30秒，100μm無菌濾網(wǎng)過濾，濾液離心，300g，10min。棄去洗滌上清液，0.9％氯化鈉注射液重懸細胞。

2.以60％的細胞密度接種于細胞培養(yǎng)皿中，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；

3.小心吸走細胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，以含8μg/ml的α-mem培養(yǎng)基(含10％fbs)，小心加入培養(yǎng)皿。

4.每細胞培養(yǎng)皿中分別加入pcdh-setrail和pcdh(空載體對照)慢病毒儲液，使moi(病毒tu與靶細胞的數(shù)量的比值)約為10，置于細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24小時；

5.小心吸走細胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，以含10％fbs的α-mem培養(yǎng)基小心加入各細胞培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)48小時；

6.以熒光顯微鏡觀察具有綠色熒光信號的msc細胞，并收集細胞培養(yǎng)上清。如圖4所示，gfp為熒光下照片，light為同一視野下白光照片，merge為兩個視野的整合照片。

實施例6感染慢病毒載體的msc細胞表達和分泌trail蛋白的活性

收集的細胞培養(yǎng)基上清液，以abcam公司的trailhumanelisakit試劑盒(catalog:ab46074)分析上清液中的trail蛋白含量，精確按照試劑盒說明書操作，以試劑盒中提供的重組humantrail做標準曲線。

測定結(jié)果如圖5所示：

感染慢病毒pcdh-setrail的msc培養(yǎng)基上清中，trail蛋白濃度約為634.93pg/ml。

感染對照空載體慢病毒pcdh的msc培養(yǎng)基上清中，trail蛋白濃度約為32.96pg/ml。這個數(shù)額為測試試劑和儀器讀數(shù)本底誤差范圍。

實施例7分泌trail蛋白的msc細胞對人膠質(zhì)瘤細胞系u87細胞的抑制

1.收集的培養(yǎng)了感染有病毒顆粒的msc的細胞培養(yǎng)上清液，1,000rpm離心10分鐘，除去殘存細胞，吸取上清液，做為條件培養(yǎng)基；

2.以含10％fbs的α-mem培養(yǎng)基以2倍濃度梯度逐次稀釋該條件培養(yǎng)基，設(shè)置1，0.5,0.25，和0.125濃度；

3.以含10％fbs的α-mem培養(yǎng)基培養(yǎng)的人膠質(zhì)瘤細胞系u87細胞(購自atcc，貨號htb-14)，以3,000細胞每孔的密度接種于96孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；

4.小心干凈的吸走每孔中的培養(yǎng)基上清液；

5.每孔中分別加入200ul梯度稀釋的各濃度條件培養(yǎng)基，同時設(shè)置空白對照孔(加入含10％fbs的α-mem培養(yǎng)基)，繼續(xù)培養(yǎng)72小時；

6.每孔加入預(yù)置的mts溶液(promega)20ul，繼續(xù)培養(yǎng)3小時

7.以thermoscientificmulitiskan微孔板讀板儀，在490nm測量波長，690nm參比波長下，測量各孔吸光度值；

8.以如下公式計算抑瘤率：抑瘤率(％)＝(空白孔吸光值-條件培養(yǎng)基處理孔吸光值)/空白孔吸光值x100

結(jié)果如圖6所示，本發(fā)明構(gòu)建的可表達分泌型trail蛋白的慢病毒載體感染msc細胞后，msc可表達分泌大量具有生物活性的trail蛋白到細胞培養(yǎng)基中，并且對u87細胞具有顯著生長抑制作用。

實施例8感染慢病毒載體的msc細胞分泌trail蛋白的穩(wěn)定性

1.以實施例6得到的感染慢病毒pcdh-setrail的msc條件培養(yǎng)基上清為分析對象(上清中trail蛋白濃度經(jīng)檢測為：634.93pg/ml)；

已感染對照空載體慢病毒pcdh的msc條件培養(yǎng)基上清為第一對照培養(yǎng)基；

已新鮮培養(yǎng)基上清為第二對照培養(yǎng)基(上清中trail蛋白濃度經(jīng)檢測約為0)；

以市售的商品化重組人rhtrail蛋白(peprotech公司，貨號：310-04)為研究參照。將市售的商品化重組人rhtrail蛋白分別溶解于第一對照培養(yǎng)基和第二對照培養(yǎng)基中，終濃度為650pg/ml。

將感染慢病毒pcdh-setrail的msc條件培養(yǎng)基上清，溶解rhtrail的第一對照培養(yǎng)基上清，和溶解rhtrail的第二對照培養(yǎng)基上清，同時置于37攝氏度溫浴中，每隔不同時間(0，3，6，12，24，48h)吸取少量上清，迅速置于-70攝氏度冰箱保存。

待全部時間點都取樣完畢后，以如實施例6中的elisa方法測定各樣品的trail蛋白含量。

以各處理組的0h時的蛋白含量為百分百，按照以下公式計算各處理組各時間點的trail蛋白殘留率：

殘留率＝(各時間點trail濃度/0h時間點trail濃度)x100％

結(jié)果如圖7所示。結(jié)果證明，本發(fā)明的感染帶有可分泌trail蛋白插入體的慢病毒載體的msc細胞制備和分泌的trail蛋白片段的穩(wěn)定性高于市售的商品化重組人rhtrail蛋白。

實施例9動物模型中分泌trail蛋白的msc細胞在裸鼠體內(nèi)對人膠質(zhì)瘤細胞的抑制

實驗動物為4-6周的雄性裸鼠(香港中文大學實驗動物中心，balb/c裸鼠)。在標準實驗條件下飼養(yǎng)：12小時光照-12小時黑暗循環(huán)，自由攝取水和食物。

感染慢病毒pcdh-setrail的mscs，感染對照空載體慢病毒pcdh的mscs，和人膠質(zhì)瘤細胞系u87細胞，都分別在含10％fbs的α-mem培養(yǎng)基中，37℃，5％co2飽和濕度條件下培養(yǎng)。待動物適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境4天后，將u87細胞注射到裸鼠皮下，每只動物接種兩個位置，分別為裸鼠背部的左側(cè)和與之對稱的右側(cè)，每個位點的u87細胞的接種量為2x10⁶細胞，注射體積為100ul。整個操作過程在超凈工作臺中完成。完成接種后對小鼠的健康狀況和腫瘤的生長情況進行監(jiān)測。待全部小鼠長出明顯腫瘤實體之后，根據(jù)動物的腫瘤體積選出左右兩側(cè)瘤塊大小均勻相同(游標卡尺測量直徑大約5mm)的8只小鼠，左側(cè)瘤塊位置注射2x106個感染對照空載體慢病毒pcdh的mscs，右側(cè)瘤塊位置注射2x106個感染慢病毒pcdh-setrail的mscs，注射體積均為100ul。每隔4天以游標卡尺測量腫瘤大小，并按照以下公式計算出腫瘤體積：腫瘤體積(mm3)＝1/2ab²，a為腫瘤長徑，b為腫瘤短徑。

數(shù)據(jù)分析組間比較用anova統(tǒng)計學方法進行統(tǒng)計分析，p＜0.05被認為有顯著性區(qū)別。

圖8為實驗過程中兩組平均腫瘤體積測量結(jié)果(體積單位mm³)

注射慢病毒感染的mscs后，兩組腫瘤體積開始出現(xiàn)分化，注射感染慢病毒pcdh-setrail的mscs的治療組腫瘤體積逐漸低于注射感染對照空載體慢病毒pcdh的mscs的對照組腫瘤體積。且在第12天和第16天時表現(xiàn)出顯著差異(p＜0.05)。實驗結(jié)果證明本發(fā)明的感染帶有可分泌trail蛋白插入體的慢病毒載體的msc細胞在動物體內(nèi)對人膠質(zhì)瘤具有顯著的治療效果。

本發(fā)明的發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)用本發(fā)明的方法制備的臍帶間質(zhì)干細胞在動物體內(nèi)能夠有效地抑制腦瘤，特別是神經(jīng)膠質(zhì)瘤。這個出乎意料的發(fā)現(xiàn)的其中一個原因是基于本發(fā)明構(gòu)建的分泌型trail蛋白可溶性片段構(gòu)建體以及含有該構(gòu)建體的慢病毒表達載體。

本發(fā)明的trail蛋白可溶性片段編碼區(qū)中添加了可促形成三聚體結(jié)構(gòu)的氨基酸序列，有助于提高表達的trail蛋白可溶性片段分子的穩(wěn)定性和活性。，在哺乳動物細胞中表達分泌型trail蛋白可溶性片段分子。另外，本發(fā)明構(gòu)建的分泌型trail蛋白可溶性片段表達載體，在啟動子下游區(qū)，緊鄰trail蛋白可溶性片段編碼基因的上游區(qū)，添加了高效的分泌信號肽序列，可使克隆于下游的trail蛋白可溶性片段編碼基因表達的trail蛋白可溶性片段分子分泌到細胞外培養(yǎng)基中，顯著提高蛋白表達效率，而且產(chǎn)生的trail蛋白可溶性片段穩(wěn)定性出乎意料地提高。特別是在利用慢病毒載體的情況下，可以將編碼分泌型trail蛋白可溶性片段的編碼基因穩(wěn)定的整合到宿主細胞的基因組中，不易丟失，而且插入性腫瘤生成的風險大大降低，更加安全可靠。

除非另外指出，本發(fā)明的實踐將使用生物技術(shù)、有機化學、無機化學等的常規(guī)技術(shù)，顯然除在上述說明和實施例中所特別描述之外，還可以別的方式實現(xiàn)本發(fā)明。其它在本發(fā)明范圍內(nèi)的方面與改進將對本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見。根據(jù)本發(fā)明的教導，許多改變和變化是可行的，因此其在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本文所提到的所有專利、專利申請與科技論文均據(jù)此通過引用結(jié)合到本文。

序列表

<110>深圳市北科生物科技有限公司

<120>分泌trail的干細胞及其治療疾病的用途

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