本發(fā)明屬于微生物
技術領域：
，具體涉及具有免疫促生長作用的解淀粉芽孢桿菌B7及應用方法。
背景技術：
：半滑舌鰨是我國重要的經(jīng)濟名貴魚類，肉味鮮美，具有廣溫、廣鹽和適應多變環(huán)境的特點，是理想的養(yǎng)殖品種之一。隨著海水工廠化養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，半滑舌鰨成為主養(yǎng)品種之一。長期高密度集約化養(yǎng)殖，導致病害發(fā)生愈來愈嚴重，主要病害有：潰爛病、腹水病、脾腎壞死病等，患病魚死亡率高達70％以上，經(jīng)濟損失巨大，嚴重制約了半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。傳統(tǒng)治療方法是使用大劑量抗生素或化學藥物浸泡或口服，長期使用的結(jié)果導致了致病菌抗藥性的產(chǎn)生，不僅沒有獲得良好的治療效果，還產(chǎn)生了因藥物殘留導致的食品安全問題，受到社會各界高度關注。探索新的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟動物疾病防治技術成為解決目前困局的有效方法和途徑。疫苗免疫技術具有綠色環(huán)保高效的特點，但水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境、養(yǎng)殖品種及養(yǎng)殖模式具有多樣性，致病微生物復雜多樣，再加上水生動物生活在水中，疫苗免疫接種技術還未取得重大突破，生產(chǎn)應用還只限于局部地區(qū)或某個養(yǎng)殖品種的生產(chǎn)應用實驗，還不能在水生動物疫病防控中發(fā)揮應有的重要作用。近年來，借鑒益生菌技術，篩選具有免疫促生長作用的微生物，通過優(yōu)化改善水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟動物腸道菌群結(jié)構，進而提高機體免疫力，促進養(yǎng)殖動物健康生長成為疾病防治技術研究熱點之一。已報道的研究結(jié)果表明，該項技術具有綠色環(huán)保、實用高效的優(yōu)點，但還未形成可供水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)應用的技術和產(chǎn)品，特別是針對海珍品魚類半滑舌鰨具有免疫促生長作用的技術產(chǎn)品還沒有相關報道。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供具有免疫促生長作用的解淀粉芽孢桿菌B7。本發(fā)明的第二個目的是提供具有免疫促生長作用的解淀粉芽孢桿菌B7的應用。本發(fā)明的技術方案概述如下：具有免疫促生長作用的解淀粉芽孢桿菌B7，其分類命名為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)B7，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCCNO：M2016128。上述具有免疫促生長作用的解淀粉芽孢桿菌B7的發(fā)酵液添加到飼料中的應用。本發(fā)明的優(yōu)點：實驗證明具有免疫促生長作用的解淀粉芽孢桿菌B7能顯著提高養(yǎng)殖半滑舌鰨免疫機能，有效抵抗病原微生物侵襲，疾病發(fā)病率顯著降低至4％以下，養(yǎng)殖成活率顯著提高到96％以上；顯著提高半滑舌鰨消化酶活性，提高飼料利用率，促進生長發(fā)育，餌料系數(shù)降低12％以上，特定生長率提高4％以上，經(jīng)濟效益顯著。該菌株的應用，有效降低抗生素及化學藥物使用量，減少環(huán)境污染，保障養(yǎng)殖產(chǎn)品質(zhì)量安全，具有良好的生態(tài)效益。解決了制約半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的病害防治關鍵技術難題，實現(xiàn)了綠色環(huán)保高效健康養(yǎng)殖目標。具體實施方式下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。我們針對半滑舌鰨養(yǎng)殖的特點和現(xiàn)狀，設計半滑舌鰨免疫促生長作用微生物篩選方案，從健康的半滑舌鰨腸道分離獲得大量菌株，經(jīng)過溶血性、消化酶活性及抑菌活性測試分析，并開展生產(chǎn)應用實驗，觀察了半滑舌鰨生長發(fā)育情況，測定了半滑舌鰨免疫指標、生長指標及存活率，篩選獲得沒有溶血性、具有消化酶活性、抑菌活性，同時具有提高半滑舌鰨免疫機能、促生長作用的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)B7菌株。實施例1解淀粉芽孢桿菌B7的獲得：(1)分離及純化：取體重15g左右的健康半滑舌鰨于無菌條件下解剖取腸道，去除腸道內(nèi)容物，用無菌生理鹽水沖洗3次，稱重后放到預冷的無菌玻璃勻漿器中勻漿，勻漿液100℃水浴10min，殺死非芽孢菌體，再梯度稀釋至10-2，分別取勻漿原液、10-1、10-2三個梯度的稀釋液100μL涂布在營養(yǎng)瓊脂平板上，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。觀察各個平板的菌落數(shù)量、形態(tài)、顏色及大小，挑取單菌落純化培養(yǎng)，將純化獲得的菌株用簡單復紅染色鏡檢，剔除非芽孢桿菌，用石碳酸復紅染色法進行革蘭氏染色和芽孢染色，獲得芽孢桿菌14株并保種備用。(2)菌株的篩選：以獲得對半滑舌鰨具有免疫促生長作用的芽孢桿菌為目標，將分離純化的芽孢桿菌進行溶血性、消化酶活性和抑菌活性篩選。首先將分離得到的芽孢桿菌在無菌營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)過夜，點種于血瓊脂平板上，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，根據(jù)菌落周圍是否形成透明圈，來判斷溶血素的產(chǎn)生與否，篩選出不產(chǎn)生溶血素的芽孢桿菌9株；分別用淀粉培養(yǎng)基和脫脂乳培養(yǎng)基鑒別上述9株芽孢桿菌的產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶能力，篩選出既產(chǎn)淀粉酶又產(chǎn)蛋白酶的菌株7株，采用牛津杯法對篩選出的7株芽孢桿菌進行抑菌活性測定，篩選出具有抑菌活性的菌株4株。綜上，篩選獲得不產(chǎn)溶血素、產(chǎn)淀粉酶、產(chǎn)蛋白酶且具有較強抑菌活性的芽孢桿菌一株，命名為B7。(3)菌株的鑒定：采用16SrDNA和gyrB基因序列分析方法，對分離篩選的芽孢桿菌B7進行屬種鑒定。16SrDNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中解淀粉芽孢桿菌序列同源性達99％以上，gyrB基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中解淀粉芽孢桿菌序列同源性達99％以上；委托中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心進行生化鑒定，其生化特征與解淀粉芽孢桿菌較為一致。綜合分子生物學及生化鑒定結(jié)果，芽孢菌株B7鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。(4)菌株的保存：將解淀粉芽孢桿菌B7，分類命名解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)B7于2016年3月17日送至位于武漢大學校內(nèi)的“中國典型培養(yǎng)物保藏中心”進行保藏，保藏編號為CCTCCNO：M2016128。地址：中國，武漢，武漢大學)所述的營養(yǎng)瓊脂平板是北京陸橋技術股份有限公司生產(chǎn)的營養(yǎng)瓊脂(NA)加蒸餾水溶解，加熱，煮沸，滅菌，冷卻倒板制成的；所述的無菌營養(yǎng)肉湯是北京陸橋技術股份有限公司生產(chǎn)的營養(yǎng)肉湯(NB)加蒸餾水溶解煮沸滅菌制成的；所述的血瓊脂平板是北京陸橋技術股份有限公司生產(chǎn)的；所述的淀粉培養(yǎng)基是北京陸橋技術股份有限公司生產(chǎn)的營養(yǎng)瓊脂(NA)加蒸餾水，每1000mL的培養(yǎng)基加2g可溶性淀粉，加熱，煮沸，滅菌，冷卻制成的平板；所述的脫脂乳培養(yǎng)基是北京陸橋技術股份有限公司生產(chǎn)的營養(yǎng)瓊脂(NA)加蒸餾水，每1000mL的培養(yǎng)基加12g脫脂奶粉，加熱，煮沸，滅菌，冷卻制成的平板。實施例2解淀粉芽孢桿菌B7的特點：(1)菌落特征：接種于營養(yǎng)瓊脂平板上30℃培養(yǎng)24h，菌落白色，粗糙，平坦，邊緣不整齊；革蘭氏陽性，菌體呈桿狀，單個、成對或鏈狀排列。(2)溶血性：將分離純化得到的解淀粉芽孢桿菌B7接種在無菌營養(yǎng)肉湯中，30℃150rpm振蕩培養(yǎng)24h，取10μl點種于血瓊脂平板上，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察發(fā)現(xiàn)菌落周圍沒有形成透明圈，說明解淀粉芽孢桿菌B7不產(chǎn)生溶血素。(3)淀粉酶活性：將解淀粉芽孢桿菌B7接種到無菌營養(yǎng)肉湯中，于30℃150rpm振蕩培養(yǎng)24h，4500rpm離心20min，取100μL上清液加入到放置在淀粉培養(yǎng)基上的牛津杯中，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。滴加少量碘液于培養(yǎng)基表面，輕輕旋轉(zhuǎn)，使碘液鋪滿整個平板，發(fā)現(xiàn)牛津杯周圍有透明圈，說明解淀粉芽孢桿菌B7分泌的淀粉酶將牛津杯周圍的淀粉水解了。牛津杯的直徑為8mm，水解形成的透明圈直徑越大，說明產(chǎn)淀粉酶能力越強(詳見表1)。(4)蛋白酶活性：將解淀粉芽孢桿菌B7接種到無菌營養(yǎng)肉湯中，于30℃150rpm振蕩培養(yǎng)24h，4500rpm離心20min，取100μL上清液加入到放置在脫脂乳培養(yǎng)基上的牛津杯中，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察發(fā)現(xiàn)脫脂乳培養(yǎng)基上牛津杯周圍形成了溶蛋白圈，牛津杯的直徑為8mm，牛津杯周圍溶蛋白圈直徑越大，說明產(chǎn)蛋白酶能力越強(詳見表1)。表1解淀粉芽孢桿菌B7的消化酶活性測試記錄培養(yǎng)基淀粉培養(yǎng)基脫脂乳培養(yǎng)基消化酶淀粉酶(mm)蛋白酶(mm)檢測結(jié)果2122(5)抑菌活性：用本實驗室保存的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及6種海水魚的常見致病菌(溶藻弧菌、遲緩愛德華氏菌、鰻弧菌、嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌和哈維氏弧菌)做指示菌，分別取濃度為1×108CFU/mL各指示菌懸液100μL均勻的涂布在營養(yǎng)瓊脂平板上，放上牛津杯，每個平板均勻放置4個牛津杯。將培養(yǎng)24h的解淀粉芽孢桿菌B7懸液用無菌營養(yǎng)肉湯調(diào)整菌懸液濃度至1×108CFU/mL，分別取100μL加到3個牛津杯中，另一個牛津杯加100μL無菌營養(yǎng)肉湯作為對照，觀察解淀粉芽孢桿菌B7對8種指示菌的抑菌活性，觀察測定抑菌圈直徑記錄于表2，牛津杯的直徑為8mm，抑菌圈直徑越大，說明抑菌作用越強。測定結(jié)果表明：解淀粉芽孢桿菌B7對大腸桿菌生長沒有抑制作用，對其他7種指示菌的生長都有明顯的抑制作用。表2解淀粉芽孢桿菌B7的抑菌活性測試記錄所述的無菌營養(yǎng)肉湯是北京陸橋技術股份有限公司生產(chǎn)的營養(yǎng)肉湯(NB)加蒸餾水溶解煮沸滅菌制成的；所述的血瓊脂平板是北京陸橋技術股份有限公司生產(chǎn)的；所述淀粉培養(yǎng)基是北京陸橋技術股份有限公司生產(chǎn)的營養(yǎng)瓊脂(NA)加蒸餾水，每1000mL的培養(yǎng)基加2g可溶性淀粉，加熱，煮沸，滅菌，冷卻制成的平板；所述的碘液是先將2g碘化鉀溶解在50mL蒸餾水中，再將1g碘片溶解在碘化鉀溶液中，待碘全溶后，再加入250mL蒸餾水混勻即可；所述的脫脂乳培養(yǎng)基是北京陸橋技術股份有限公司生產(chǎn)的營養(yǎng)瓊脂(NA)加蒸餾水，每1000mL的培養(yǎng)基加12g脫脂奶粉，加熱，煮沸，滅菌，冷卻制成的平板。實施例3解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液制備方法：實驗室制備方法為：(1)種子液培養(yǎng)：將解淀粉芽孢桿菌B7活化，接種到無菌營養(yǎng)肉湯中，30℃，150rpm振蕩培養(yǎng)24h，即得種子液；(2)發(fā)酵：在1L的三角瓶中裝400mL的無菌營養(yǎng)肉湯，將種子液以10％接種量接種到三角瓶中，30℃，150rpm恒溫振蕩培養(yǎng)48h，細菌數(shù)達8×108CFU/mL～1×109CFU/mL；(3)收獲：將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液轉(zhuǎn)移到500mL的無菌三角瓶中于4℃低溫避光保存。規(guī)?；苽浞椒椋?1)種子液培養(yǎng)：按上述實驗室制備方法，制備種子液4L；(2)發(fā)酵培養(yǎng)基：50L發(fā)酵罐裝36L培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為葡萄糖0.5％～1％，豆餅粉1.0％～1.5％，硫酸錳0.02％～0.03％，氯化鈉0.5％～0.7％，磷酸氫二鉀0.02％～0.03％，碳酸鈣0.5％～0.7％，115°滅菌30分鐘；(3)發(fā)酵：將4L種子液接種到準備好的發(fā)酵培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)速100-250rpm，溶氧20-30％。使用消泡劑進行消泡。發(fā)酵時間為48h，細菌數(shù)為8×108CFU/mL～1×109CFU/mL，芽孢形成率為75％～85％；(4)收獲：將上述培養(yǎng)好的發(fā)酵液轉(zhuǎn)移到5L的無菌塑料桶中低溫避光保存。實施例4解淀粉芽孢桿菌B7提高半滑舌鰨免疫機能：將解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液按照體積質(zhì)量比1:50(單位mL/g)添加到半滑舌鰨魚飼料(海旗半滑舌蹋魚飼料)中，與未添加解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液的半滑舌鰨魚飼料間隔投喂，即投喂添加了解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液的飼料4天后再投喂未添加解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液的飼料4天，依次循環(huán)，此為實驗組；同時設對照組，對照組一直投喂未添加解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液的飼料，投喂3個月后，檢測發(fā)現(xiàn)：半滑舌鰨血清溶菌酶活性較對照組提高31％，超氧化物歧化酶活性較對照組提高177％，過氧化氫酶活性較對照組提高121％，白細胞吞噬指數(shù)較對照組提高30％以上，白細胞吞噬百分比較對照組提高14％以上。統(tǒng)計實驗組半滑舌鰨養(yǎng)殖存活率提高到96％以上，疾病發(fā)病死亡率降低到4％以下。實驗組半滑舌鰨發(fā)病死亡率降低、存活率提高的結(jié)果與免疫指標顯著提高的實驗結(jié)果一致，說明口服解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液，能夠有效提高半滑舌鰨機體免疫機能，提高抵抗病原微生物侵襲能力。表3解淀粉芽孢桿菌B7提高半滑舌鰨免疫機能表注：U/mL：1mL樣品所含的酶活力單位，*：差異顯著實施例5解淀粉芽孢桿菌B7促進半滑舌鰨生長：將解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液按照體積質(zhì)量比1:50(單位mL/g)添加到半滑舌鰨魚飼料(海旗半滑舌蹋魚飼料)中，與未添加解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液的半滑舌鰨魚飼料間隔投喂，即投喂添加了解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液的飼料4天后再投喂未添加解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液的飼料4天，依次循環(huán)，此為實驗組；同時設對照組，對照組一直投喂未添加解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液的飼料。每天記錄實驗組、對照組飼料投喂量，投喂3個月后，抽樣測定實驗組、對照組半滑舌鰨體重，計算增重率、特定生長率和餌料系數(shù)，發(fā)現(xiàn)：實驗組的增重率較對照組提高10％以上，特定生長率較對照組提高4％以上，餌料系數(shù)較對照組降低12％以上，且實驗組的增重率、特定生長率和餌料系數(shù)與對照組存在顯著性差異，說明口服解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液能夠顯著促進半滑舌鰨生長。表4解淀粉芽孢桿菌B7促進半滑舌鰨生長注：*差異顯著實施例6解淀粉芽孢桿菌B7的應用1：(1)解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液的添加：將解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液按照體積質(zhì)量比1:50(單位mL/g)添加到半滑舌鰨魚飼料(海旗半滑舌蹋魚飼料)中，即發(fā)酵液100mL噴灑到5000g半滑舌鰨魚飼料中，攪拌均勻，現(xiàn)用現(xiàn)拌料，外層包裹1‰海藻酸鈉，陰干，1g飼料攜帶的解淀粉芽孢桿菌B7的數(shù)量約2×107CFU。(2)半滑舌鰨投喂方案：應用對象是體重15-20g工廠化養(yǎng)殖半滑舌鰨5000尾，分實驗組和對照組，隨機取實驗組和對照組魚各50尾，稱量體重，計算平均值。實驗組連續(xù)投喂添加了解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液的飼料4天，再連續(xù)投喂未添加解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液的飼料4天，依次循環(huán)，兩種飼料間隔投喂2個月；對照組一直投喂未添加解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液的飼料。(3)半滑舌鰨免疫酶類活性測定：按照上述投喂方案連續(xù)投喂2個月時，分別抽取實驗組、對照組半滑舌鰨20尾，分別尾靜脈取血，測定血清免疫酶活性及白細胞吞噬活性，記錄于表5。由表5可以看出：實驗組半滑舌鰨血清溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性、過氧化氫酶活性、白細胞吞噬指數(shù)和吞噬百分比等5項非特異性免疫指標均顯著高于對照組，說明解淀粉芽孢桿菌B7能提高半滑舌鰨機體免疫機能。(4)半滑舌鰨生長性能測定：投喂養(yǎng)殖過程中，記錄兩個組飼料攝食情況。連續(xù)投喂2個月，隨機取實驗組和對照組半滑舌鰨各20尾，稱量體重，計算平均增重、增重率、特定生長率，結(jié)合攝食情況，計算餌料系數(shù)，記錄于表6。由表6可以看出：實驗組的增重率和特定生長率顯著高于對照組，而餌料系數(shù)又顯著低于對照組，說明同樣餌料用量情況下，口服解淀粉芽孢桿菌B7能夠提高養(yǎng)殖魚類增重量，從而降低養(yǎng)殖成本。表5半滑舌鰨免疫酶類活性測定記錄表表注：U/mL：1mL樣品所含的酶活力單位，*：差異顯著表6半滑舌鰨生長性能測定記錄表表注：*差異顯著實施例7一株解淀粉芽孢桿菌B7的應用2：(1)解淀粉芽孢桿菌B7的添加：將解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液按照體積質(zhì)量比1:50(單位mL/g)添加到半滑舌鰨飼料(海旗半滑舌蹋魚飼料)中，即發(fā)酵液100mL噴灑到5000g半滑舌鰨魚飼料中，攪拌均勻，現(xiàn)用現(xiàn)拌料，外層包裹1‰海藻酸鈉，陰干，1g飼料攜帶的解淀粉芽孢桿菌B7的劑量約2×107CFU。(2)半滑舌鰨苗種投喂方案：應用對象是體重15-20g工廠化養(yǎng)殖半滑舌鰨20000尾，分實驗組和對照組，隨機取實驗組和對照組魚各50尾，稱量體重，計算平均值。實驗組連續(xù)投喂添加解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液的飼料4天，再連續(xù)投喂未添加解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液的飼料4天，依次循環(huán)，兩種飼料間隔投喂3個月；對照組一直投喂未添加解淀粉芽孢桿菌B7發(fā)酵液的飼料。(3)半滑舌鰨免疫酶類活性測定：按照各自的投喂方案，兩組魚在投喂相應飼料3個月時，尾靜脈取血，測血清非特異性免疫酶活性及白細胞吞噬活性，記錄于表7。由表7可以看出：實驗組半滑舌鰨血清溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性、過氧化氫酶活性、白細胞吞噬指數(shù)和吞噬百分比5項非特異性免疫指標均顯著高于對照組，且養(yǎng)殖成活率為96.4％，說明解淀粉芽孢桿菌能提高半滑舌鰨機體免疫機能。(4)半滑舌鰨生長性能測定：養(yǎng)殖生產(chǎn)中，記錄兩個組飼料的進食情況。兩種飼料間隔投喂3個月，隨機取實驗組和對照組魚各50尾，稱量體重，計算平均值，結(jié)合實驗初各組魚的均重計算平均增重、增重率、特定生長率，結(jié)合攝食情況，計算餌料系數(shù)，記錄于表8。由表8可以看出：對照組的增重率和特定生長率顯著高于對照組，而餌料系數(shù)又顯著低于對照組，說明同樣餌料用量情況下，解淀粉芽孢桿菌B7提高養(yǎng)殖魚類增重量，促進魚體生長，降低養(yǎng)殖成本。表7半滑舌鰨免疫酶類活性測定記錄表表注：U/mL：1mL樣品所含的酶活力單位，*：差異顯著表8半滑舌鰨生長性能測定記錄表注：*差異顯著。當前第1頁1 2 3