本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種解析植物葉際內(nèi)生細菌菌群結構的方法，特別涉及一種利用嵌套pcr技術解析水稻葉際內(nèi)生細菌菌群結構的方法。

背景技術：

植物內(nèi)生菌是指定殖于植物組織內(nèi)的微生物，包括內(nèi)生真菌和內(nèi)生細菌，在植物生長發(fā)育的整個生命歷程中，植物內(nèi)生菌調(diào)節(jié)宿主植物的營養(yǎng)狀態(tài)、參與宿主植物對環(huán)境脅迫(包括生物因素和非生物因素)的響應。

水稻是全球范圍內(nèi)最重要的糧食作物之一，對水稻內(nèi)生菌的研究將為水稻營養(yǎng)、抗病等相關研究提供借鑒和指導意義。對于植物共生菌群的研究，目前主要集中于對其根際微生物的關注，水稻也不例外。從分子水平分析，pcr擴增中植物dna對內(nèi)生細菌16srdna的干擾是主要原因之一。植物細胞中線粒體和葉綠體兩種細胞器均含有dna，其中，線粒體的18srdna和葉綠體的16srdna與細菌菌種測序鑒定所用的細菌16srdna序列同源性非常高。植物根細胞只有線粒體，而地上部分綠色組織既有線粒體又有葉綠體，對菌群測序鑒定的干擾更大，很難同時排除該兩種干擾。因此，目前還沒有成熟的方法來解析植物葉際內(nèi)生細菌的菌群結構。

就水稻而言，水稻是一種單子葉草本植物，植株結構簡單，主要由地上部分的葉和地下部分的根組成。水稻內(nèi)生菌的研究也可以由此分為根際菌群和葉際菌群兩個方向。目前，水稻葉際菌群的研究遠少于根際菌群，根據(jù)webofscience的檢索結果，水稻葉際菌群的研究僅停留在對葉片表面非定殖細菌的研究上，而水稻葉際內(nèi)生細菌的研究目前還是空白，主要原因就是缺少葉際內(nèi)生細菌的測序方法。

16srdna是細菌分類鑒定的分子鐘，16srdna測序是目前微生物群落多樣性測序的常用方法。16srdna存在于所有生物中，而且結構和功能高度保守。結構上，16srdna長約1.5kb，由序列恒定區(qū)和序列可變區(qū)交替排列組成，因此，在應用上，可以根據(jù)16srdna的的序列恒定區(qū)設計引物，擴增出含有幾個可變區(qū)的序列片段，然后根據(jù)可變區(qū)的序列特異性進行菌種的分類鑒定。16srdna測序結合二代測序技術平臺，從而實現(xiàn)對菌群多樣性的深度解析。水稻葉際內(nèi)生細菌的測定也需要采用16srdna測序，但是問題如前文所述，水稻葉肉細胞中線粒體dna和葉綠體dna的存在使得擴增產(chǎn)物中這兩種干擾占到90％以上的比例，細菌的序列信息幾乎被覆蓋掉，嚴重影響測序后數(shù)據(jù)的分析及分析質(zhì)量的科學性。

目前，急需一種水稻葉際內(nèi)生細菌的測序方法來開展水稻葉際內(nèi)生細菌的相關研究。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種解析植物葉際內(nèi)生細菌菌群結構的方法。

本發(fā)明所提供的解析植物葉際內(nèi)生細菌菌群結構的方法，是基于嵌套pcr技術的，具體可包括如下步驟：

(a)提取植物及其葉際內(nèi)生菌總dna；

(b)以步驟(a)提取的總dna為模板，采用引物對1進行第一次pcr擴增，得到pcr產(chǎn)物1(16srdna的v3-v8區(qū))；以所述pcr產(chǎn)物1為模板，采用引物對2進行第二次pcr擴增，得到pcr產(chǎn)物2(16srdna的v5-v7區(qū))；

所述引物對1由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈dna組成；所述引物對2由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈dna組成。

其中，所述引物對1中兩條引物的3’端均與植物線粒體18srdna序列有差異位點而與植物葉綠體和細菌的16srdna序列相同，因而可以避開線粒體序列，使得擴增產(chǎn)物為植物葉綠體16srdna和細菌16srdna的混合物(即所述pcr產(chǎn)物1為植物葉綠體16srdna和細菌16srdna的混合物)。所述引物對2中兩條引物的3’端均與植物葉綠體16srdna序列有差異位點而與細菌的16srdna序列相同，因而可以避開葉綠體序列，使得擴增產(chǎn)物只有細菌16srdna(即所述pcr產(chǎn)物2為植物葉際內(nèi)生細菌16srdna)。

(c)對所述pcr產(chǎn)物2(16srdna的v5-v7區(qū))進行測序，根據(jù)測序結果鑒定菌種，從而解析植物葉際內(nèi)生細菌菌群結構。

在步驟(a)中，所述提取植物及其葉際內(nèi)生菌總dna的方法，具體可包括如下步驟：

(a1)取植物葉片，去除表面細菌后進行液氮研磨；

其中，所述去除表面細菌具體可按照如下操作：將所述植物葉片先用體積百分含量為75％的乙醇浸泡5min，然后將所述植物葉片轉(zhuǎn)移至加有表面活性劑tween20的無菌水中，震蕩，最后用無菌水清洗。

(a2)取液氮研磨后樣品，加入te緩沖液，渦旋振蕩，充分混勻；

其中，所述te緩沖液的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：10mmtris，1mmedta；ph8.0。

(a3)加入sds和蛋白酶k，渦旋振蕩，充分混勻；

其中，所述sds是以濃度為10％(10g/100ml)的sds溶液的形式加入的，所述蛋白酶k是以濃度為100μg/ml的蛋白酶k溶液的形式加入的。

(a4)加入rna酶，37℃溫浴1h-2h(如1h)；

(a5)加入濃度為5m的nacl溶液，混勻后再加入ctab/nacl溶液，混勻后65℃溫育10min；

所述ctab/nacl溶液的溶劑為水，溶質(zhì)及濃度如下：0.7mnacl，10％(10g/100ml)ctab。

(a6)對步驟(a5)所得樣品依次進行dna抽提、dna沉淀和dna溶解，從而獲得所述植物及其葉際內(nèi)生菌總dna。

其中，對步驟(a5)所得樣品依次進行dna抽提、dna沉淀和dna溶解的具體步驟如下：1)向步驟(a5)所得樣品中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1，體積比)，混勻，10000g離心5min，取上清；2)加入等體積的氯仿/異戊醇(1∶1，體積比)，混勻，10000g離心5min，取上清；3)加入0.6-0.8倍(如0.7倍)倍體積的異丙醇，輕輕混勻，10000g離心5min，棄上清收集dna沉淀；4)沉淀用1ml的70％(體積百分含量)乙醇洗滌后，10000g離心5min，棄上清；5)晾干后加ddh2o溶解dna；6)nanodrop測dna濃度后，加ddh2o稀釋至～50ng/μl，-20℃保存。

在步驟(a)中，所述te緩沖液、所述sds、所述蛋白酶k、所述rna酶、所述濃度為5m的nacl溶液和所述ctab/nacl溶液的配比具體可為567μl：3mg：0.76u：200μg：100μl：80μl。

在步驟(b)中，進行所述第一次pcr擴增和所述第二次pcr擴增時，所采用的dna聚合酶均為高保真kodplus(東洋紡，日本)。

在步驟(b)中，進行所述第一次pcr擴增時，所采用的退火溫度為63℃；進行所述第二次pcr擴增時，所采用的退火溫度為54℃。

更加具體的，進行所述第一次pcr擴增時，所采用的擴增程序為：95℃3min；95℃30s，63℃30s，72℃1min06s，30個循環(huán)；72℃，10min。進行所述第二次pcr擴增時，所采用的擴增程序為：95℃3min；95℃30s，54℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃，10min。

當pcr擴增需要重復以保證其建庫所需pcr產(chǎn)物量的需求時，每個樣本的pcr擴增重復應該由1^stpcr提供，即“在步驟(b)中，進行所述第一次pcr擴增時，設置多個重復”。

步驟(c)中，所述測序可為二代測序。

本發(fā)明還保護由引物對1和引物對2組成的成套引物對。

其中，所述引物對1具體由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈dna組成；所述引物對2具體由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈dna組成。

本發(fā)明也保護所述引物對1。

所述成套引物對或所述引物對1在解析植物葉際內(nèi)生細菌菌群結構中的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。

在本發(fā)明的實施例中，所述植物具體為水稻或擬南芥。

本發(fā)明優(yōu)化了植物及其內(nèi)生菌總dna的提取方案，通過對pcr方案的不斷優(yōu)化(包括酶的選擇、污染源的排除、擴增流程的探索等)，并結合二代測序技術平臺，最終建立了一種利用引物對329f/1417r和799f/1193r的嵌套pcr技術對水稻葉際內(nèi)生細菌測序的實驗方案，打開了水稻葉際內(nèi)生細菌非培養(yǎng)法研究的大門，使得該領域的后續(xù)研究成為可能，并為整個植物葉際內(nèi)生細菌研究領域提供了借鑒。

附圖說明

圖1為1^stpcr擴增產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖2為2^ndpcr擴增產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖3為樣品稀釋曲線。

圖4為實施例3中樣品菌群組成相對豐度柱形圖(屬水平)。該圖是各樣品在屬水平上的物種相對豐度柱形圖，展示了物種相對豐度排名前十的10個屬，這10個屬之外的其他所有屬的相對豐度之和以others表示。

圖5為菌群組成維恩圖。該圖中的數(shù)字表示otus的個數(shù)，展示了三組共有otus的情況。

圖6為nmds分析圖。

圖7為對比例1中樣品菌群組成相對豐度柱形圖(屬水平)。該圖是各樣品在屬水平上的物種相對豐度柱形圖，展示了物種相對豐度排名前十的10個屬，這10個屬之外的其他所有屬的相對豐度之和以others表示。

圖8為對比例2中樣品菌群組成相對豐度柱形圖(屬水平)。該圖是各樣品在屬水平上的物種相對豐度柱形圖，展示了物種相對豐度排名前十的10個屬，這10個屬之外的其他所有屬的相對豐度之和以others表示。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1、水稻及其葉際內(nèi)生菌總dna提取實驗方案

1)準備：實驗中用到的研砵、研錘、離心管、鑷子等均提前高壓蒸汽滅菌處理。

2)去除水稻葉片組織表面的細菌：將-80℃凍存的水稻葉片先用75％(體積百分韓浪)乙醇浸泡5min，然后將所述水稻葉片轉(zhuǎn)移至加有表面活性劑tween20(amresco，solon，usa)的無菌水中(ddh2o和tween20按1000:1的體積比加入，渦旋震蕩2-5min)，最后用滅菌ddh2o清洗4遍。

3)液氮充分研磨后取約100mg置于2ml離心管中。

4)加567μlte緩沖液(配方：溶劑為水，溶質(zhì)為10mmtris，1mmedta；ph8.0)，渦旋振蕩，充分混勻。

5)加入30μl10％(10g/100ml)sds和20μl的蛋白酶k(100μg/ml，amresco，solon，usa)(相當于0.76u蛋白酶k)，渦旋振蕩，混勻。

6)加入2μlrnase(100mg/ml，天根生化科技公司，北京)，顛倒混勻于37℃溫育1小時。

7)加入100μl5mnacl，顛倒混勻后，加入80μlctab/nacl溶液(配方：溶劑為水，溶質(zhì)為0.7mnacl，10％(10g/100ml)ctab)，顛倒混勻后再65℃溫育10min。

8)加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1，體積比)，混勻，10000g離心5min，取上清。

9)加入等體積氯仿/異戊醇(1∶1，體積比)，混勻，10000g離心5min，取上清。

10)加入0.7倍體積的異丙醇，輕輕混勻，10000g離心5min，棄上清收集dna沉淀.

11)沉淀用1ml的70％(體積百分含量)乙醇洗滌后，10000g離心5min，棄上清。

12)晾干后加ddh2o溶解dna。

13)nanodrop測dna濃度后，加ddh2o稀釋至50ng/μl，-20℃保存。

實施例2、嵌套pcr擴增

1、模板：實施例1的方法提取的水稻葉片及其內(nèi)生菌總dna

2、酶：kodplus(東洋紡，日本)

3、引物(濃度10μm)：329f/1417r，799f/1193r

329f：5’–acgghccaractcctacggga-3’(序列1)；

1417r：5’–gtgtacaagrcccgggaacg-3’(序列2)。

799f：5’–aacmggattagataccckg-3’(序列3)；

1193r：5’–acgtcatccccaccttcc-3’(序列4)。

其中，h表示a或c或t；r表示a或g；m表示a或c；k表示g或t。引物329f/1417r的擴增產(chǎn)物為16srdna的v3-v8區(qū)，引物799f/1193r的擴增產(chǎn)物為16srdna的v5-v7區(qū)。

4、嵌套pcr

(1)第一輪pcr擴增(1^stpcr)

反應體系：10×kodbuffer5μl；2mmdntp5μl；mgso42μl；kodplus1μl；引物329f和1417r各1.5μl；模板(水稻葉片及其內(nèi)生菌總dna)50ng；ddh2o補足至50μl。

擴增程序：95℃3min；95℃30s，63℃30s，72℃1min06s，30個循環(huán)；72℃，10min。

1^stpcr擴增產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示。marker：dnamarkerⅱ(天根生化科技公司，北京，中國)；1、2、3：擴增產(chǎn)物的三個重復，目的條帶約1.1kb；4、5、6：三個空對照(pcr體系不加dna模板)。

(2)第二輪pcr擴增(2^stpcr)

反應體系：10×kodbuffer5μl；2mmdntp5μl；mgso42μl；kodplus1μl；引物799f和1193r各1.5μl；模板(1^stpcr擴增產(chǎn)物稀釋10³倍)1μl；ddh2o補足至50μl。

擴增程序為：95℃3min；95℃30s，54℃30s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃，10min。

2^ndpcr擴增產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳圖如圖2所示。marker：dnamarkerⅱ(天根生化科技公司，北京，中國)；1、2、3：三個重復樣品，目的條帶約400bp。

實施例3、擴增產(chǎn)物的測序鑒定

一、單克隆測序法

1、回收純化擴增產(chǎn)物

(1)1％瓊脂糖凝膠電泳之后，將含有目的條帶的膠條切下，置于1.5ml離心管(axygen)中。

(2)用wizardsvgelandpcrclean-upsystem(promega，madison，usa)試劑盒進行回收純化，按照說明書進行操作。

(3)最后加65℃預熱的ddh2o20μl洗脫，回收純化的擴增產(chǎn)物-20℃保存。

2、擴增產(chǎn)物連接至空載體構建完整質(zhì)粒

目的片段：高保真的kodplus酶的pcr產(chǎn)物，即嵌套pcr的擴增產(chǎn)物。

載體：peasybluntsimplevector(全式金，北京，中國)

連接體系：載體1μl；目的片段4μl。

反應條件：25℃，10min。

3、轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞并篩選陽性轉(zhuǎn)化子

(1)-80℃凍存的感受態(tài)細胞trans1-t1(全式金，北京，中國)取出置于冰上，約5min后剛剛?cè)诨?/p>

(2)冰?。喝倓?cè)诨母惺軕B(tài)50μl加入到連接產(chǎn)物的ep管中，輕輕彈撥混勻，冰浴30min。

(3)熱激：42℃水浴熱激60s，立即置于冰上，冰置2min。

(4)復蘇：加入500μllb液體培養(yǎng)基，37℃，220rpm，培養(yǎng)45min。

(5)藍白斑篩選：取4μliptg(1m)、40μlx-gal(20mg/ml)、26μlddh2o，混勻后涂于與連接載體抗性一致的平板(lb固體培養(yǎng)基)。待iptg和x-gal被吸收后，將復蘇的菌液均勻涂于平板上，37℃過夜培養(yǎng)。

4、單克隆測序

將篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子挑單斑送中美泰和生物公司進行測序。

5、比對鑒定pcr擴增產(chǎn)物

利用vectornti軟件將測序結果與相應引物進行比對，并將比對結果在nabi數(shù)據(jù)庫中進行blast從而鑒定pcr擴增產(chǎn)物。

6、測序結果

嵌套pcr法擴增所用的模板為以2016年9月10日采于河南開封水稻試驗田健康水稻葉片為材料提取的總dna，單克隆測序所測27個單克隆全部為細菌16srdna序列，沒有線粒體18srdna和葉綠體16srdna序列。單克隆測序的序列信息經(jīng)ncbi數(shù)據(jù)庫blast比對后，將比對結果在genbank中檢索其生物學分類地位，將全部結果統(tǒng)計歸類后得到表1。如表1所示，該27個單克隆除6個在ncbi數(shù)據(jù)庫中檢索不到生物學分類信息外，其余21個涵蓋了細菌界的4個門、12個屬。該結果表明，嵌套pcr法成功避開了線粒體18srdna和葉綠體16srdna兩種干擾，能夠從三者的混合模板中特異地擴增細菌16srdna，并且擴增沒有偏好性即擴增產(chǎn)物具有豐富的多樣性，使得水稻葉際內(nèi)生細菌的非培養(yǎng)法研究成為可能。

表1嵌套pcr單克隆測序結果系統(tǒng)進化樹

二、借助二代測序平臺的高通量測序

嵌套pcr法的2^ndpcr以1^stpcr擴增產(chǎn)物取1μl稀釋10³倍后作為模板，因此，存在該方法最終的擴增產(chǎn)物不能充分展現(xiàn)初始模板中細菌的多樣性即代表性不強、覆蓋度不夠的可能。為了檢測該方法是否有此缺陷，我們設置了實驗，結合二代測序平臺的高通量測序來進行分析。

(一)實驗設計

1、dna提取

材料：2016.09.13采于南京農(nóng)業(yè)科學院實驗田的健康水稻葉片，-80℃凍存。

方法：同實施例1。

2、pcr擴增

方法同實施例2。其中，2^ndpcr所用引物799f/1193r5’端加上6個堿基長度的barcode，每個樣品的引物barcode組合均不同，用于后續(xù)高通量測序的樣品標識。

具體擴增方案如下：

(1)1^stpcr

同一dna模板做3個重復，得到3份pcr產(chǎn)物，分別記為a、b、c。

(2)2^ndpcr

a、b、c各取1μl加滅菌ddh2o稀釋1000倍，用移液槍反復吹打充分混勻，作為2^ndpcr的模板。每份模板各做3個2^ndpcr重復，共得9份pcr產(chǎn)物，分別為a1、a2、a3、b1、b2、b3、c1、c2、c3。

嵌套pcr可行性驗證擴增方案如表2所示。

表2嵌套pcr可行性驗證擴增方案

3、高通量測序

將上步所得9個樣品(a1、a2、a3、b1、b2、b3、c1、c2、c3)送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行高通量測序。本次測序利用illuminahiseqpe250測序平臺，對嵌套pcr最終擴增產(chǎn)物16srdna的v5-v7區(qū)進行高通量測序，得到平均每個樣品可用于后續(xù)分析的有效tags為67361，有效tags的平均長度為377bp；每個樣品的otus數(shù)目均不低于300。

(二)實驗結果及分析

分析分組方案如表3所示。

表3分析分組方案

1、物種多樣性

樣品稀釋曲線(圖3)中，所有樣品的稀釋曲線最終都趨于平緩，說明每個樣品的測序深度合理即測序數(shù)據(jù)量是足夠的，可以進行數(shù)據(jù)分析。

2、組間差異分析

物種相對豐度柱形圖(圖4)和維恩圖(圖5)直觀地展示了兩種分析分組方案中三組之間在物種的組成及豐度上相似度都很高，組間無明顯差異；進一步，表4和表5的組間差異分析數(shù)據(jù)顯示，三組之間兩兩比較，anosim分析和amova分析的p-value均大于0.05，說明組間沒有顯著性差異，mrpp分析significance指數(shù)大于0.05，也說明組間沒有顯著性差異，由此說明三組樣本之間統(tǒng)計學上沒有顯著性差異。綜合以上分析，三組樣本沒有顯著性差異即沒有分組的必要，說明嵌套pcr法的擴增產(chǎn)物不存在代表性不強、覆蓋度不夠的問題，即嵌套pcr法結合二代測序平臺的高通量測序其所測數(shù)據(jù)具有代表性且覆蓋度是足夠的。

a方案和a方案比較，從物種相對豐度柱形圖(圖4)和維恩圖(圖5)可以比較直觀地看出a方案的組間相似度略高。從圖6的nmds分析圖中可以看出，兩種分組方案相比較，a方案的分組方式其組間差異明顯小于a方案。表4和表5比較可以看出，三種組間差異分析指數(shù)(anosim分析的p-value、amova分析的p-value以及mrpp分析significance指數(shù))均大于0.05，特別是a方案anosim分析的p-value以及mrpp分析significance指數(shù)均為1，說明100％的概率判定a方案的組間差異不顯著。另外，兩種分組分析方案的anosim分析r-value相比較，a方案的r-value均大于0，表明a方案的組間差異大于組內(nèi)差異，而a方案的r-value均小于零，表明其組內(nèi)差異大于組間差異，即：相對于組間差異，a方案的的組內(nèi)差異對總體的差異起了主要貢獻，說明a方案的分組方式能夠更大程度地避免抽樣誤差，數(shù)據(jù)覆蓋度更高。由此，兩種分析分組方案組間均無顯著性差異，其中，a方案分組方式其組間相似度更高。

表4a方案分組組間差異分析指數(shù)

表5a方案分組組間差異分析指數(shù)

綜合以上分析得出如下結論：1)嵌套pcr法結合二代測序平臺的高通量測序其所測數(shù)據(jù)覆蓋度足夠、物種多樣性豐富，具有可行性。2)嵌套pcr法應用于借助二代測序平臺的高通量測序，當pcr擴增需要重復以保證其建庫所需pcr產(chǎn)物量的需求時，每個樣本的pcr擴增重復應該由1^stpcr提供。

對比例1

鑒于沒有可以同時避開植物葉綠體16srdna或者線粒體的18srdna序列的引物，在測定植物葉際內(nèi)生細菌時，目前常規(guī)的做法是先擴增得到含有葉綠體16srdna或者線粒體的18srdna干擾的擴增產(chǎn)物，建庫測序后再將干擾序列去掉，只用剩余的細菌16srdna序列進行后續(xù)分析。本發(fā)明的發(fā)明人按照該方法對水稻葉際內(nèi)生細菌開展了高通量測序?qū)嶒?，具體如下：

按照實施例1的方法提取水稻葉片及其內(nèi)生細菌總dna。14個樣品其取樣地點分別為開封(k)、南京(n)、哈爾濱(h)、福州(fz-w、fz-t)、北京(bj-w、bj-f)。

將提取的dna樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行高通量測序，以引物799f/1193r(可以避開水稻葉綠體16srdna但能擴增出水稻線粒體16srdna)進行pcr擴增，利用illuminahiseqpe250測序平臺建庫測序。

結果分析：得到平均每個樣品可用于后續(xù)分析的有效tags為45743，有效tags的平均長度為441bp；每個樣品的平均otus數(shù)目為28。所測結果在屬水平上的物種相對豐度柱形圖如圖7所示，絕大部分擴增產(chǎn)物都是水稻線粒體序列，只有10％左右的序列是細菌序列。

實施例3步驟二中的圖5的所有樣品都與圖7中樣品n1為相同的dna模板來源(2016.09.13采于南京農(nóng)業(yè)科學院實驗田的健康水稻葉片，-80℃凍存)。首先，相比于以不能避免葉綠體序列干擾的引物進行擴增，嵌套pcr法擴增到的otus數(shù)目高出前者十多倍；另外，圖5與圖7相比較，說明：1)引物799f/1193r不能避免水稻線粒體序列的干擾，2)嵌套pcr法在測定水稻葉際內(nèi)生細菌時能夠避免水稻線粒體序列和葉綠體序列兩種干擾。

對比例2

dna提?。阂詼厥遗嘤臄M南芥為實驗材料，按照實施例1的方法提取擬南芥葉片及其內(nèi)生細菌總dna，dna樣品共三個重復。

pcr擴增：1)按照實施例2嵌套pcr擴增流程分別對提取的三個dna樣品進行擴增，所得擴增產(chǎn)物記為at.q。2)按照實施例2嵌套pcr第二輪擴增的反應體系及流程以引物799f和1193r分別對提取的三個dna樣品進行一次擴增，所得擴增產(chǎn)物記為at。

高通量測序：擴增產(chǎn)物送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行高通量測序，利用illuminahiseqpe250測序平臺，得到平均每個樣品可用于后續(xù)分析的有效tags為74842，有效tags的平均長度為376bp；每個樣品的平均otus數(shù)目為171。

測序結果分析：所測結果在屬水平上的物種相對豐度柱形圖如圖8所示，嵌套pcr法(at.q)和以引物799f和1193r進行一次擴增(at)的擴增產(chǎn)物中都含有擬南芥葉綠體序列，說明引物799f和1193r不能避免擬南芥葉綠體序列的干擾；兩組相比較，at.q組的葉綠體序列含量明顯少于at組，at.q組的細菌序列約占測序總量的60％，而at組的細菌序列不足測序總量的25％。

該結果表明：對于擬南芥葉際內(nèi)生細菌的測序，引物799f和1193r不能避免葉綠體序列的干擾，而實施例3中當引物799f和1193r作為嵌套pcr法的第二輪擴增引物時，嵌套pcr法可以較大程度地減少葉綠體序列的干擾從而提高擴增產(chǎn)物中細菌序列的相對含量。

<110>中國科學院微生物研究所

<120>一種解析水稻葉際內(nèi)生細菌菌群結構的方法

<130>gncln170686

<160>4

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<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(5)..(5)

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<212>dna

<213>人工序列

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<213>人工序列

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<213>人工序列

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