本發(fā)明涉及一種脂滴熒光探針及其應(yīng)用，尤其涉及一種具有超高選擇性的兩親性的脂滴探針及其在專一性地標(biāo)記或顯示活細(xì)胞或組織中的脂滴形態(tài)和分布中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

脂滴，長(zhǎng)期以來一直被認(rèn)為是細(xì)胞中存儲(chǔ)中性脂質(zhì)(甘油三酯和膽固醇酯)的簡(jiǎn)單的惰性的球體。但是最近的研究表明脂滴并不是靜態(tài)的，而是細(xì)胞內(nèi)高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，廣泛地存在于真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中。它們?cè)诩?xì)胞中扮演著重要的角色，參與細(xì)胞中的多種活動(dòng)，比如調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的代謝，維持細(xì)胞內(nèi)平衡，并與細(xì)胞內(nèi)多種細(xì)胞器相互作用。而且脂滴的異?？蓪?dǎo)致多種疾病，如肥胖癥，糖尿病，動(dòng)脈粥硬化等。因此為了深入研究脂滴的生物角色和各種生理活動(dòng)對(duì)脂滴的影響，包括質(zhì)譜分析、電子顯微鏡等的各種各樣的方法均被使用。在各種方法中，熒光探針能夠?qū)崟r(shí)原位地可視化脂滴，故其成為了研究脂滴及其相關(guān)活動(dòng)的強(qiáng)有力的手段。

正如我們所知，脂滴有一個(gè)大的無水的中性核，所以根據(jù)“相似相容”原理，一些親脂性的探針已經(jīng)被開發(fā)并用來成像脂滴。其中較廣泛應(yīng)用的有兩個(gè)商業(yè)化的脂滴探針：Nile Red和BODIPY。Nile Red是一個(gè)親脂性的探針，盡管它能夠優(yōu)先地聚集在脂滴，但是它也對(duì)細(xì)胞內(nèi)絕大多數(shù)結(jié)構(gòu)染色，而且在水中也有微弱的熒光發(fā)出，因此造成了極大的背景噪音，導(dǎo)致選擇性很差。為了提高選擇性，另一種親脂性的探針BODIPY以及其它親脂性的脂滴探針也相繼被用來成像脂滴。相比Nile Red,它們的選擇性有所改善，但是仍然不能滿足研究需求，阻礙了脂滴的進(jìn)一步研究。由此可見，單純地依賴于脂滴的親脂性來設(shè)計(jì)親脂性的脂滴探針很難實(shí)現(xiàn)高選擇性地成像脂滴的目的。因此，迫切地需要一種新的設(shè)計(jì)方法以獲得高選擇性的脂滴探針，能夠?qū)Ｒ恍缘匕邢蛑?，?shí)現(xiàn)無背景噪音地成像。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種具有超高選擇性的兩親性的脂滴熒光探針及其在專一性地標(biāo)記或顯示活細(xì)胞或組織中的脂滴形態(tài)和分布中的應(yīng)用，以實(shí)現(xiàn)用于無背景噪音地成像細(xì)胞和組織中的脂滴。

本發(fā)明所述超高選擇性且具兩親性的脂滴熒光探針，其特征在于：該探針化學(xué)名稱為1-(3’-(7’-硝基苯并呋咱-4’-)氨丙基)-2,3,3-三甲基吲哚溴鹽，簡(jiǎn)稱NII；其化學(xué)通式如式(I)所示：

本發(fā)明所述超高選擇性且具兩親性的脂滴熒光探針(NII)的制備方法概述如下：

先合成4-(3’-溴丙氨基)-7-苯并呋咱(化合物1)，再將其與2,3,3-三甲基吲哚混合，以乙醇為溶劑，加熱回流制得1-(3’-(7’-硝基苯并呋咱-4’-)氨丙基)-2,3,3-三甲基吲哚溴鹽(NII)。

上述超高選擇性且具兩親性的脂滴熒光探針(NII)制備的反應(yīng)式如下：

目前的報(bào)道已經(jīng)表明，脂滴內(nèi)部的中性核是被一個(gè)兩親性的磷脂單分子層所包被，為了有效地存儲(chǔ)脂滴同時(shí)維持脂滴結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，脂滴內(nèi)部的水被排出，因此實(shí)際上脂滴形成了一個(gè)獨(dú)特的兩親性的結(jié)構(gòu)，它包含一個(gè)極性的頭部和無水的內(nèi)部?；谶@樣的認(rèn)識(shí)，本發(fā)明預(yù)測(cè)兩親性的分子能夠超高選擇性地靶向脂滴，并成功篩選出了一個(gè)基于兩親性的有機(jī)小分子探針。這個(gè)兩親性的探針分別由一個(gè)強(qiáng)親脂性的熒光團(tuán)NBD和一個(gè)陽離子部分(吲哚鹽)組成。在這里，我們選擇了一個(gè)遵循ICT(分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移)機(jī)制的NBD作為熒光母體，一方面它具有強(qiáng)的親脂性，能夠和脂滴的中性核有強(qiáng)的結(jié)合力，同時(shí)結(jié)合陽離子部分和脂滴的極性頭部之間的強(qiáng)的靜電作用力，可以實(shí)現(xiàn)專一性地靶向脂滴，從而有利于無背景噪音地成像。另一方面，該熒光團(tuán)的發(fā)光性質(zhì)受環(huán)境的極性影響，即在低極性環(huán)境中它的熒光強(qiáng)度明顯地高于其在高極性環(huán)境中，這樣當(dāng)該親脂性的熒光團(tuán)靶向脂滴低極性的內(nèi)部后，能發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，實(shí)現(xiàn)熒光開關(guān)的效果，進(jìn)而也有利于無背景噪音地成像。因此，兩親性探針的雙靶標(biāo)策略能夠?qū)Ｒ恍缘匕邢蛑危瑢?shí)現(xiàn)無背景噪音的成像。

本發(fā)明所述超高選擇性且具兩親性的脂滴熒光探針在專一性地標(biāo)記或顯示活細(xì)胞或組織中的脂滴形態(tài)和分布中的應(yīng)用。

其中：所述活細(xì)胞優(yōu)選永生化細(xì)胞或正常細(xì)胞，所述組織優(yōu)選小鼠肌肉組織或肝臟組織。

進(jìn)一步的，所述永生化細(xì)胞優(yōu)選是HeLa細(xì)胞或PC-3細(xì)胞；所述正常細(xì)胞優(yōu)選是MSC細(xì)胞。

本發(fā)明提供的具有超高選擇性的可用于無背景噪音地成像脂滴的兩親性的熒光探針同時(shí)具有雙光子成像能力。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明所述的兩親性的脂滴探針具有超高的選擇性，能夠?qū)Ｒ恍缘匕邢蚣?xì)胞甚至更復(fù)雜的組織中的脂滴，其成像效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于商業(yè)化的脂滴探針Nile red。同時(shí)，由于在NBD基礎(chǔ)上非共軛地引入了陽離子鹽部分并不會(huì)影響NBD的發(fā)光性質(zhì)，這使得兩親性的探針NII保持了NBD的熒光性質(zhì)，即ICT性質(zhì)，熒光受環(huán)境極性的影響，隨環(huán)境極性的增加，熒光強(qiáng)度降低，同時(shí)熒光峰位有所紅移。因此當(dāng)NII靶向具有低極性的脂滴內(nèi)部時(shí)，熒光強(qiáng)度將遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其在水中的熒光強(qiáng)度，從而可以實(shí)現(xiàn)了熒光開關(guān)效果。同時(shí)，這樣的高信噪比和低的背景噪音也使得探針進(jìn)行染色后，可無需進(jìn)一步洗滌，即可在顯微鏡下直接觀察。同時(shí)NII具有合適的雙光子性能，可用于雙光子成像。在雙光子顯微鏡下，細(xì)胞和組織中的脂滴可被清楚地觀察到。此外，NII探針的光穩(wěn)定性極好，明顯強(qiáng)于Nile Red.同時(shí)它的染色速度極快(2分鐘)，細(xì)胞毒性很低，并且可和其他探針兼容。因此探針NII能夠成為研究脂滴及其相關(guān)活動(dòng)的一個(gè)強(qiáng)有力的工具，更重要的是利用兩親性分子的雙靶向的設(shè)計(jì)思路能夠?yàn)槲磥砟ば约?xì)胞器包括脂滴在內(nèi)的探針的設(shè)計(jì)提供一個(gè)通用的指導(dǎo)。

本發(fā)明提供的高選擇性的兩親性的脂滴探針NII是首次報(bào)道的兩親性的可用于無背景噪音地成像脂滴的熒光探針。與其功能相近的其他親脂性的脂滴熒光探針相比，本發(fā)明所述探針NII具有超高的選擇性、無背景噪音成像、雙光子性能、極好的光穩(wěn)定性、快速染色能力、免洗滌、細(xì)胞毒性低等特點(diǎn)。

綜上，本發(fā)明的探針是一種全新的探針，具有適用范圍廣，單、雙光子光穩(wěn)定性好，染色速度快，細(xì)胞毒性低，以及能在活性細(xì)胞中專一地成像脂滴的特點(diǎn)，其應(yīng)用前景廣闊。

附圖說明

圖1：用Hoechst 33342和NII(A)或Nile red(B)共同染色HeLa細(xì)胞的共聚焦熒光照片。

其中：(1)圖為明場(chǎng)激光掃描的微分干涉照片；(2)圖為Hoechst 33342在405nm激光輻照下得到的熒光照片；(3)圖為NII或Nile red在473nm激光輻照下得到的熒光照片；(4)圖為(1)、(2)、(3)的疊加圖。(5,6,7)分別為對(duì)應(yīng)的黃色框中的放大圖。標(biāo)尺(4)＝20μm；標(biāo)尺(5)＝1μm。

圖2：用Hoechst 33342和NII(A)或Nile red(B)共同染色經(jīng)過不同處理的HeLa細(xì)胞的共聚焦熒光照片。

不同處理：(1-4)為固定細(xì)胞，(5-8)為固定后的細(xì)胞再通過二甲苯去除細(xì)胞內(nèi)脂滴。

其中：1、5圖為明場(chǎng)激光掃描的微分干涉照片；2、6圖為Hoechst 33342在405nm激光輻照下得到的熒光照片；3、7圖為NII、Nile red在473nm激光輻照下得到的熒光照片；4、8圖為2、3的疊加圖。標(biāo)尺＝20μm。

圖3：用NII染色經(jīng)過油酸處理不同時(shí)間的HeLa細(xì)胞的共聚焦熒光照片。

(A)：2h；(B):4h；(C):6h。

其中：1圖為NII在473nm激光輻照下得到的熒光照片；2圖為為明場(chǎng)激光掃描的微分干涉照片；3圖為1、2的疊加圖。標(biāo)尺＝20μm。

圖4：(A)圖：用NII染色HeLa細(xì)胞的雙光子熒光照片，標(biāo)尺＝20μm；

(B)圖：NII的單/雙光子光穩(wěn)定性及Nile red的單光子光穩(wěn)定性的量化圖；

(C)圖：用NII處理HeLa細(xì)胞不同時(shí)間(2h,10h,24h)后細(xì)胞的存活率。

圖5：用NII染色小鼠肌肉組織(橫切面和縱切面)以及肝臟組織后在840nm激光輻照下得到的不同深度的雙光子熒光照片。標(biāo)尺＝20μm。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

4-(3’-溴丙氨基)-7-苯并呋咱(1)的合成

在燒瓶中，將4-氯-7-硝基苯呋咱(2g,10mmol)溶解在甲醇中，攪拌15分鐘，然后加入3-溴丙胺(2.19g,10mmol)，于室溫下反應(yīng)8小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后用二氯甲烷萃取，水洗。用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥。最后用石油醚和乙酸乙酯的混合物進(jìn)行柱層分析獲得最終產(chǎn)物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ(ppm)9.54(t,J＝5.40Hz,1H),8.54(d,J＝9.00Hz,1H),6.45(d,J＝8.70Hz,1H),3.64(m,4H),2.23(m,2H)。

1-(3’-(7’-硝基苯并呋咱-4’-)氨丙基)-2,3,3-三甲基吲哚溴鹽(NII)的合成

將合成的化合物(1)(0.3g,1mmol)與2,3,3-三甲基吲哚(240Μl,1.5mmol)混合，以乙醇為溶劑，加熱回流。24小時(shí)后反應(yīng)結(jié)束，冷卻至室溫，沉淀物用乙醚沖洗三次，然后再用水沖洗三遍，得到最終產(chǎn)物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ(ppm)9.48(s,1H),8.57(d,J＝9.00Hz,1H),7.99(m,1H),7.81(m,1H),7.58(m,2H),6.51(d,J＝9.00Hz,1H).¹³C NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ(ppm)＝197.62,144.84,142.30,141.59,138.28,129.83,129.28,123.94,115.81,100.08,54.72,46.12,40.68,40.47,40.26,40.05,39.84,39.63,39.39,22.52,14.61.HRMS(m/z):[M]⁺calculated for C₂₀H₂₂N₅O₃,380.43；found,380.18。

實(shí)施例2：永生化的癌細(xì)胞HeLa的培養(yǎng)

HeLa細(xì)胞株均是在37℃，5％CO₂的CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。HeLa細(xì)胞株在內(nèi)含10％胎牛血清和1％雙抗的H-DMEM培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)。

等細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期，接片培養(yǎng)：①將蓋玻片于無水乙醇中浸泡30min，酒精燈烘干后放入一次性35mm培養(yǎng)皿中；②將100mL細(xì)胞瓶中的細(xì)胞用PBS洗三遍，用1mL0.25％胰酶消化3-5分鐘，小心地倒出培養(yǎng)基，加入少量新鮮培養(yǎng)基吹打均勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，留下合適密度的細(xì)胞，將培養(yǎng)基加至所需體積(控制細(xì)胞終濃度為1×10⁵)，接種至內(nèi)含蓋玻片的培養(yǎng)皿中，放入CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞爬片生長(zhǎng)。

實(shí)施例3：NII和Nile red染色HeLa細(xì)胞內(nèi)脂滴的共聚焦熒光顯微實(shí)驗(yàn)

將接好的細(xì)胞爬片先用細(xì)胞核染料Hoechst 33342(5μM)孵育30min，用PBS洗滌2遍，然后在室溫下用4μM NII染色孵育2min或5μM Nile red孵育20min。將細(xì)胞爬片取出，細(xì)胞生長(zhǎng)面朝下蓋在載玻片上，在共聚焦熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的脂滴被NII清晰地著色，呈圓球狀，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中(未被Hoechst著色的區(qū)域)。然而，Nile red除了染色圓點(diǎn)之外，也染色了細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明所述兩親性探針NII是具有超高選擇性的脂滴探針，能夠給出脂滴的無背景噪音的熒光照片。

結(jié)果見圖1。用Hoechst 33342和NII(A)或Nile red(B)共同染色HeLa細(xì)胞的共聚焦熒光照片。其中(1)圖為明場(chǎng)激光掃描的微分干涉照片；(2)圖為Hoechst 33342在405nm激光輻照下得到的熒光照片；(3)圖為NII或Nile red在473nm激光輻照下得到的熒光照片；(4)圖為(1)、(2)、(3)的疊加圖。(5,6,7)分別為對(duì)應(yīng)的黃色框中的放大圖。標(biāo)尺(4)＝20μm；標(biāo)尺(5)＝1μm。

實(shí)施例4：通過去除脂滴法證明兩親性脂滴探針NII的超高選擇性的證明實(shí)驗(yàn)

二甲苯可用來去除固定細(xì)胞中的脂滴，因此可用來進(jìn)一步證明NII對(duì)脂滴的超高選擇性。對(duì)照組：細(xì)胞先用多聚甲醛固定，30分鐘后細(xì)胞已被固定，然后吸去多聚甲醛，加入1ML的PBS，再用細(xì)胞核染料Hoechst 33342(5μM)孵育30min,用PBS洗滌2遍，然后用4μM NII染色孵育2min或5μM Nile red孵育20min。實(shí)驗(yàn)組：細(xì)胞先用多聚甲醛固定，30分鐘后細(xì)胞已被固定，然后吸去多聚甲醛，之后用不同濃度梯度的酒精(70％,80％,90％,95％和100％)依次處理細(xì)胞各5分鐘，然后用二甲苯處理細(xì)胞兩次，各5分鐘，之后再用反濃度梯度的酒精依次處理各5分鐘。最后用PBS洗滌細(xì)胞兩次，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)的脂滴被完全去除。然后用細(xì)胞核染料Hoechst 33342(5μM)孵育30min,用PBS洗滌2遍，最后用4μM NII染色孵育2min或5μM Nile red孵育20min。將兩組實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞爬片取出，細(xì)胞生長(zhǎng)面朝下蓋在載玻片上，在共聚焦顯微鏡分別收集NII，Nile red和Hoechst 33342的信號(hào)。

觀察發(fā)現(xiàn)，去除脂滴前，細(xì)胞內(nèi)的脂滴能夠被NII清晰地著色，但是脂滴被去除之后，沒有檢測(cè)到來自NII的熒光。相比之下，去除脂滴后，細(xì)胞內(nèi)的其他環(huán)境仍會(huì)被Nile red著色。因此該實(shí)驗(yàn)證明了兩親性探針NII只能夠?qū)Ｒ坏厝旧?，而不能染色?xì)胞內(nèi)的其他環(huán)境。

結(jié)果如圖2。用Hoechst 33342和NII(A)或Nile red(B)共同染色經(jīng)過不同處理的HeLa細(xì)胞的共聚焦熒光照片。不同處理：(1-4)為固定細(xì)胞，(5-8)為固定后的細(xì)胞再通過二甲苯去除細(xì)胞內(nèi)脂滴。其中1、5圖為明場(chǎng)激光掃描的微分干涉照片；2、6圖為Hoechst 33342在405nm激光輻照下得到的熒光照片；3、7圖為NII、Nile red在473nm激光輻照下得到的熒光照片；4、8圖為2、3的疊加圖。標(biāo)尺＝20μm。

實(shí)施例5：通過用油酸處理HeLa細(xì)胞再一次證明兩親性脂滴探針NII的超高選擇性的證明實(shí)驗(yàn)

因?yàn)橛退崮軌蜃鳛橐环N中性磷脂聚集在脂滴內(nèi)，從而能誘導(dǎo)脂滴的形成，使脂滴增多。因此我們用油酸處理HeLa細(xì)胞來進(jìn)一步證明兩親性脂滴探針NII的超高選擇性。將接好的細(xì)胞爬片分別用油酸處理不同的時(shí)間(2h,4h,6h)，然后吸出，用PBS洗滌2遍，之后用4μM NII染色孵育2min。取出細(xì)胞爬片，將細(xì)胞生長(zhǎng)面朝下蓋在載玻片上，在共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)的脂滴增大，來自NII的綠色熒光也顯著增強(qiáng)。這表明NII也能很好地染色細(xì)胞內(nèi)新產(chǎn)生的脂滴。

結(jié)果見圖3。用NII染色經(jīng)過油酸處理不同時(shí)間的HeLa細(xì)胞的共聚焦熒光照片。(A)：2h；(B):4h；(C):6h.其中1圖為NII在473nm激光輻照下得到的熒光照片；2圖為為明場(chǎng)激光掃描的微分干涉照片；3圖為1、2的疊加圖。標(biāo)尺＝20μm。

實(shí)施例6：NII染色HeLa細(xì)胞的雙光子照片，單/雙光子光穩(wěn)定性及其細(xì)胞毒性試驗(yàn)

將接種好的細(xì)胞爬片用4μM的NII進(jìn)行染色，室溫下孵育2min。然后將細(xì)胞爬片取出，細(xì)胞生長(zhǎng)面朝下蓋在載玻片上，直接在雙光子顯微鏡(激發(fā)波長(zhǎng)：840nm，平均飛秒脈沖功率為3mW)下觀察細(xì)胞。結(jié)果表明NII具有雙光子成像能力，能夠在雙光子激發(fā)下清晰地成像細(xì)胞中的脂滴。同時(shí)，測(cè)定其單/雙光子光穩(wěn)定性及Nile red的單光子光穩(wěn)定性，結(jié)果表明NII有極好的光穩(wěn)定性，明顯高于Nile red。用CCK8測(cè)定NII的細(xì)胞毒性，結(jié)果表明NII對(duì)細(xì)胞的毒性極小。

結(jié)果見圖4。(A)用NII染色HeLa細(xì)胞的雙光子熒光照片，標(biāo)尺＝20μm；(B)NII的單/雙光子光穩(wěn)定性及Nile red的單光子光穩(wěn)定性的量化圖；(C)用NII處理HeLa細(xì)胞不同時(shí)間(2h,10h,24h)后細(xì)胞的存活率。

實(shí)施例7：NII染色小鼠肌肉組織和肝臟組織的雙光子顯微實(shí)驗(yàn)

將從小鼠體內(nèi)取出的肌肉組織和肝臟組織分別培養(yǎng)在裝有細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)小皿中，然后用10μM的NII染色，室溫下孵育2分鐘后直接在雙光子顯微鏡下(激發(fā)波長(zhǎng)：840nm)下進(jìn)行觀察。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：NII能夠清晰地可視化組織中脂滴的形態(tài)及分布，且成像深度可達(dá)82μm。

結(jié)果見圖5。用NII染色小鼠肌肉組織橫斷面、縱切面和肝臟組織后在840nm激光輻照下得到的不同深度的雙光子熒光照片。