本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術、納米醫(yī)藥、超分子化學及藥物控制釋放技術領域，具體地說是一種具有腫瘤特異性還原降解釋藥的環(huán)糊精-喜樹堿類前藥的制備方法和應用。

背景技術：

癌癥又名為惡性腫瘤，已成為威脅人類生存健康的主要原因，是全球第二大死亡原因。據世界衛(wèi)生組織統計，2015年癌癥造成約880萬人死亡，占全球死亡率的六分之一。由于診斷和治療資源的匱乏，其中約70％的癌癥死亡發(fā)生在中低收入國家。治療癌癥、提高癌癥病人的生存率和生活質量成為了一個世界性的難題。目前，化療手段仍然是癌癥治療的主要方法之一。然而，大多數化療藥物，比如喜樹堿(camptothecin)、紫杉醇(paclitaxel)等，在水中溶解度有限，穩(wěn)定性差，而且對人體正常組織具有嚴重的副作用。納米藥物由于其獨特的性質被科學家們廣泛的用于癌癥研究和治療。納米藥物可以有效提高抗癌藥物在生理環(huán)境中的分散性和穩(wěn)定性，延長納米藥物在血液中的循環(huán)時間，提高藥物在腫瘤組織中的富集。相比較于傳統的小分子化療藥物，納米藥物可以有效提高抗腫瘤活性，降低對正常組織的毒副作用。因此，設計有效的納米載藥體系一直是藥物控制釋放領域的研究焦點。

喜樹堿(camptothecin，cpt)是一種細胞毒性喹啉類生物堿，能抑制dna拓撲異構酶i(topoi)，在臨床前研究中具有顯著的抗腫瘤活性。但由于其自身水溶性差，生理環(huán)境下易水解失活以及嚴重的毒副作用，喜樹堿沒能在臨床試驗中獲得成功。通過對喜樹堿改性，目前已有幾個喜樹堿類似物藥物通過了美國食品和藥物管理局(fda)批準用于結腸癌的治療，如伊立替康(irinotecan)和拓撲替康(topotecan)。另一方面，這些藥物中的內酯結構(lactoneform)在血液循環(huán)過程中容易水解成羧基結構，從而導致藥效急劇下降。因此非常有必要開發(fā)出一種具有腫瘤選擇性釋放的納米藥物來投遞喜樹堿。

技術實現要素：

本發(fā)明的首要目的是提供一種喜樹堿類-環(huán)糊精前藥，在水溶液中可以通過環(huán)糊精與喜樹堿之間的輸水相互作用力自組裝形成納米粒子，實現降低對正常組織毒性的同時提高抗腫瘤活性。

本發(fā)明的另一目的是提供制備所述的喜樹堿類-環(huán)糊精前藥的方法。

本發(fā)明的再一目的是提供所述的前藥在制備癌癥治療藥物中的應用。

本發(fā)明的上述目的通過以下技術方案實現：

首先，本發(fā)明提供一種喜樹堿-環(huán)糊精前藥，它是喜樹堿或其衍生物和環(huán)糊精形成的超分子前藥，其結構如式(i)所示：

其中，n1取1-3的整數，即所述的環(huán)糊精可以選用α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精或者γ-環(huán)糊精的一種；

r¹為中的一種；

r²為中的一種；

r³為中的一種；

r⁴為喜樹堿或其衍生物基團；

x為s或者-ch2-中的一種；

n2、n3和n4為重復單元數，均取0-10的整數；優(yōu)選0-5的整數；進一步優(yōu)選0-2的整數。

本發(fā)明優(yōu)選的方案中，所述的式(i)中的r⁴來自式(ii)-式(v)所示結構中的一種；進一步優(yōu)選來自式(ii)或式(iii)所示的結構；最優(yōu)選來自式(ii)所示的結構：

式(ii)為喜樹堿的化學結構式，式(iii)為7-乙基-10-羥基喜樹堿化學結構式，式(iv)為伊立替康的化學結構式，式(v)為拓撲替康的化學結構式。

本發(fā)明的方案中，所述的r¹優(yōu)選為中的一種；最優(yōu)選

本發(fā)明的方案中，所述的r²優(yōu)選為中的一種；最優(yōu)選

本發(fā)明的方案中，所述的r³最優(yōu)選

本發(fā)明進一步優(yōu)選的方案中，所述的喜樹堿類-環(huán)糊精前藥是喜樹堿和β-環(huán)糊精形成的超分子前藥，即所述式(i)中的n1＝2；r¹為中的一種；r²為r³為r⁴為喜樹堿基團；x為s或-ch2-；n2＝1，n3＝0，n4＝0。

本發(fā)明最優(yōu)選的所述喜樹堿類-環(huán)糊精前藥，是結構如下式(vi)～(xiii)所示的任意一種：

本發(fā)明還提供一種制備喜樹堿類-環(huán)糊精前藥的方法，是以喜樹堿類為原料，在有機溶劑中，通過與帶有相應基團的原料反應，制成喜樹堿類前藥中間體，最后所述中間體再和環(huán)糊精反應制備得到所述的喜樹堿類-環(huán)糊精前藥。

本發(fā)明的一種具體制備方法包括以下步驟：

1)在有機溶劑中，在?；呋瘎┐嬖谙率褂萌鈿饣罨矘鋲A類內酯環(huán)上的羥基，再加入過量的2,2'-二硫代二乙醇或1,6-己二醇反應，得到中間體醇；

2)在有機溶劑中，對步驟1)得到的中間體醇進行活化，使中間體醇直接轉化為活化酯；

或者，

在有機溶劑中，先在催化劑存在下使用丁二酸酐將步驟1)得到的中間體醇轉化為羧酸封端的中間體酸，再在活化劑存在下對所述中間體酸進行羰基活化得到活化酯；

3)步驟2)得到的活化酯再和環(huán)糊精衍生物在有機溶劑中混合，并加入催化劑攪拌反應，得到所述的喜樹堿類-環(huán)糊精前藥。

本發(fā)明所述制備方法中，步驟1)所述的有機溶劑可以選自二氯甲烷、氯仿、四氫呋喃、1,4-二氧六環(huán)或二甲基甲酰胺中的任意一種；優(yōu)選二氯甲烷。步驟1)所述的?；呋瘎┛梢赃x自4-(二甲基氨基)吡啶、三乙胺或n,n-二異丙基乙胺中的任意一種；優(yōu)選4-(二甲基氨基)吡啶。

本發(fā)明所述制備方法中，步驟1)所述的喜樹堿類優(yōu)選喜樹堿或7-乙基-10-羥基喜樹堿；最優(yōu)選喜樹堿。

本發(fā)明所述制備方法中，步驟2)所述的中間體醇的活化，優(yōu)選使用羰基咪唑或炔丁酸與所述的中間體醇在二甲亞砜中反應。

本發(fā)明所述制備方法中，步驟2)所述的中間體酸的羰基活化，優(yōu)選使用n-羥基琥珀酰亞胺與所述的中間體酸在無水二氯甲烷中反應。

本發(fā)明所述制備方法中，步驟2)所述的催化劑可以選自4-(二甲基氨基)吡啶、三乙胺或n,n-二異丙基乙胺中的任意一種，優(yōu)選4-(二甲基氨基)吡啶；步驟2)所述的活化劑優(yōu)選1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽。

本發(fā)明所述制備方法中，步驟3)所述的環(huán)糊精衍生物選自α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精或它們的衍生物中的任意一種；優(yōu)選β-環(huán)糊精或其衍生物中的任意一種；進一步優(yōu)選6-乙氨基-β-環(huán)糊精、6-丁氨基-β-環(huán)糊精、6-己氨基-β-環(huán)糊精或6-疊氮-β-環(huán)糊精中的任意一種。

本發(fā)明所述制備方法中，步驟3)所述的有機溶劑選自二甲基甲酰胺或二甲基亞砜中的任意一種；優(yōu)選二甲基甲酰胺；步驟3)所述的催化劑選自三乙胺、4-(二甲基氨基)吡啶或n,n-二異丙基乙胺中的任意一種，優(yōu)選三乙胺。

本發(fā)明所述制備方法優(yōu)選的一種實施方式中，制備了式(vi)、(xi)和(xii)所示的前藥，其合成路線如下：

具體包括如下步驟：在4-(二甲基氨基)吡啶的存在下，在二氯甲烷中，使用三光氣活化喜樹堿的羥基，然后與過量的2,2'-二硫代二乙醇反應，制備得到中間體醇1；然后在無水二氯甲烷中在4-二甲氨基吡啶存在下使用丁二酸酐將中間體醇1轉化為中間體酸2；最后，在無水二氯甲烷中，在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽存在下將中間體酸2用n-羥基琥珀酰亞胺活化轉化為活化酯3，再在dmf中，在三乙胺存在下，用活化酯3分別與6-乙氨基-β-環(huán)糊精4、6-丁氨基-β-環(huán)糊精11或6-己氨基-β-環(huán)糊精13攪拌反應制備得到式(vi)、(xi)或(xii)所示的前藥，記作cd-s-s-cpt-1、15和16。

本發(fā)明所述制備方法優(yōu)選的另一種實施方式中，制備了式(vii)所示的前藥cd-c-c-cpt，其合成路線如下：

具體包括如下步驟：

在4-(二甲基氨基)吡啶的存在下，在二氯甲烷中，使用三光氣活化喜樹堿的羥基，然后與過量的1,6-己二醇反應，制備得到中間體醇5；然后在無水二氯甲烷中在4-二甲氨基吡啶存在下使用丁二酸酐將中間體醇5轉化為中間體酸6；最后，在無水二氯甲烷中，在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽存在下將中間體酸6用n-羥基琥珀酰亞胺活化轉化為活化酯7，再在dmf中，在三乙胺存在下，用活化酯7與6-乙氨基-β-環(huán)糊精4攪拌反應制備得到式(vii)所示的前藥cd-c-c-cpt。

本發(fā)明所述制備方法優(yōu)選的再一種實施方式中，制備了式(viii)～(x)和(xiii)所示的前藥，其合成路線如下：

具體包括如下步驟：

將所述的中間體醇1溶于二甲亞砜中，分別加入羰基咪唑或炔丁酸，室溫下攪拌反應得到活化酯9或17，所得的活化酯9或17溶于二甲亞砜中，加入6-乙氨基-β-環(huán)糊精4、6-丁氨基-β-環(huán)糊精11、6-己氨基-β-環(huán)糊精13或者6-疊氮-β-環(huán)糊精19，室溫攪拌反應，可分別得到式(viii)～(x)或(xiii)所示的前藥，記作10、13、14或20。

本發(fā)明的前藥可以直接單獨用作癌癥治療藥物，也可以進一步制成其他藥物學上可接受的劑型用于癌癥治療。因此，本發(fā)明還提供所述喜樹堿類-環(huán)糊精前藥在藥物學上可接受的制劑。

本發(fā)明優(yōu)選的方案中，所述的制劑是含有本發(fā)明所述的喜樹堿類-環(huán)糊精前藥的納米顆粒制劑。

所述的納米顆粒制劑既包括所述的喜樹堿類-環(huán)糊精前藥分子在水溶液中自組裝形成的納米顆粒，也包括所述的喜樹堿類-環(huán)糊精前藥分子與其他聚合物一起組裝制備得到的納米顆粒。

本發(fā)明還提供所述的喜樹堿類-環(huán)糊精前藥在制備癌癥治療藥物中的應用。

本發(fā)明優(yōu)選的一種應用方案中，使用高分子聚合物對本發(fā)明所述的喜樹堿類-環(huán)糊精前藥進行自組裝，制備得到納米顆粒。所述的高分子聚合物選自聚乙二醇-喜樹堿、含有環(huán)糊精的嵌段聚合物或含有喜樹堿的嵌段聚合物中的任意一種。

本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式中，將本發(fā)明所述的喜樹堿類-環(huán)糊精前藥與聚乙二醇-喜樹堿或含有環(huán)糊精的嵌段聚合物以一定比例溶于水，攪拌或者超聲一定時間制得納米顆粒。

本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實施方式中，將本發(fā)明所述的喜樹堿類-環(huán)糊精前藥分子與含有喜樹堿的嵌段聚合物以一定比例一起溶于水和丙酮的混合溶劑中，攪拌或者超聲一定時間揮發(fā)掉有機溶劑，制得納米顆粒。

本發(fā)明優(yōu)選的另一種應用方案中，使用兩親性高分子對所述的喜樹堿類-環(huán)糊精前藥進行物理包裹，制備得到納米顆粒。

本發(fā)明的一種優(yōu)選的實施方式中，使用聚乙二醇-b-聚乳酸作為藥用載體對所述的喜樹堿類-環(huán)糊精前藥進行物理包裹；具體是將本發(fā)明所述的喜樹堿類-環(huán)糊精前藥和聚乙二醇-b-聚乳酸以一定比例一起溶于有機溶劑(如四氫呋喃)，然后滴入正在攪動或者超聲的水溶液中，然后揮發(fā)掉有機溶劑，制得納米顆粒。

本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實施方式中，使用聚乙二醇-b-聚磷酯作為藥用載體對所述的喜樹堿類-環(huán)糊精前藥進行物理包裹；具體是將本發(fā)明所述的喜樹堿類-環(huán)糊精前藥和聚乙二醇-b-聚磷酯以一定比例一起溶于有機溶劑(如四氫呋喃)，然后滴入正在攪動或者超聲的水溶液中，然后揮發(fā)掉有機溶劑，制得納米顆粒。

本發(fā)明的再一種優(yōu)選的實施方式中，使用聚乙二醇-b-聚己內酯作為藥用載體對所述的喜樹堿類-環(huán)糊精前藥進行物理包裹；具體是將本發(fā)明所述的喜樹堿類-環(huán)糊精前藥和聚乙二醇-b-聚己內酯以一定比例一起溶于有機溶劑(如四氫呋喃)，然后滴入正在攪動或者超聲的水溶液中，然后揮發(fā)掉有機溶劑，制得納米顆粒。

在本發(fā)明中，我們創(chuàng)新性地把喜樹堿類連接在環(huán)糊精上，制備出一種新穎的超分子化療藥物。這一藥物在水溶液中可以通過環(huán)糊精與喜樹堿之間的輸水相互作用力自組裝形成納米粒子。所述的納米粒子可以有效被腫瘤細胞攝取，并且具有載藥效率高、載藥量大的優(yōu)點，而且喜樹堿包結在環(huán)糊精的輸水空腔中，可以大大提高喜樹堿的水溶性，同時有效抑制喜樹堿自身的水解，這一特性可以大大提高這一超分子藥物的抗腫瘤活性。更重要的是喜樹堿和環(huán)糊精之間的二硫鍵可以在腫瘤細胞內谷胱甘肽(gsh)的作用下斷開釋放出具有高抗癌活性的未經修飾的喜樹堿，實現降低對正常組織毒性的同時提高抗腫瘤活性。截止目前，這一新穎的設計還未被國內外報道，具有非常高的創(chuàng)新價值。

本發(fā)明合成的喜樹堿類-環(huán)糊精超分子化療藥物cd-s-s-cpt具有如下特點：

(1)有效提高喜樹堿在生理環(huán)境中的溶解度和分散性；

(2)有效提高喜樹堿在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性，防止水解；

(3)喜樹堿被化學修飾后，在二硫鍵斷裂前對細胞的毒性?。?/p>

(4)由于喜樹堿和環(huán)糊精用二硫鍵連接，因此該前藥對細胞內的還原性谷胱甘肽敏感，接觸谷胱甘肽后能迅速釋放喜樹堿；

(5)本發(fā)明合成的超分子藥物也可以很容易的被生物相容性高分子包裹制備出其他高載藥量的納米藥物；

(6)最后，前藥的合成簡單，可以大批量生產，納米顆粒制備容易，非常有潛力用于臨床轉化。

附圖說明

圖1為實施例1制備的cpt-s-s-oh的¹hnmr譜圖(300mhz，cd2cl2)。

圖2為實施例2制備的cpt-s-s-cooh的¹hnmr譜圖(300mhz,cdcl3)。

圖3為實施例3制備的cd-s-s-cpt的¹hnmr譜圖(300mhz,dmso-d6)。

圖4為實施例4制備的cpt-c-c-oh¹hnmr譜圖(300mhz，cd3cl)。

圖5為實施例5制備的cpt-c-c-cooh¹hnmr譜圖(300mhz,cdcl3)。

圖6為超分子前藥cd-s-s-cpt制備得到的納米顆粒的透射電鏡照片。

圖7為超分子前藥cd-s-s-cpt與甲基聚乙二醇-喜樹堿制備得到的納米顆粒的透射電鏡照片。

圖8為藥物從實施例3的cd-s-s-cpt納米顆粒隨時間釋放的曲線圖。

圖9為實施例3的前藥cd-s-s-cpt和喜樹堿的隨時間水解的曲線圖。

圖10為細胞毒性對比實驗結果曲線圖。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明進行具體描述，本實施例只用于對本發(fā)明作進一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，本領域的技術人員根據上述發(fā)明的內容做出的一些非本質的改進和調整，均屬本發(fā)明保護范圍。

實施例1：cpt-s-s-oh(1)的制備

室溫攪拌下，將4-二甲氨基吡啶(2.10g，17.2mmol)加入到喜樹堿(2.00g，5.74mmol)的二氯甲烷溶液中。繼續(xù)攪拌30分鐘后，緩慢加入三光氣(0.633g，2.12mmol)。攪拌1小時后，逐滴加入2,2'-二硫代二乙醇(17.2g，117mmol)，反應液室溫攪拌過夜。將混合物用飽和食鹽水(100ml)洗滌三次，分液得到的二氯甲烷有機相用無水硫酸鈉干燥。使用預填充的二氧化硅柱通過快速色譜分離純化產物。產量：2.12g(產率為70％)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.46(s，1h)，8.22(d，j＝8.3hz，1h)，7.99(dd，j＝8.2,1.1hz，1h)，7.86(ddd，j＝6.9,6.5hz，1h)，7.70(ddd，j＝8.1,6.9,1.2hz，1h)，7.42(s，1h)，5.64(d，j＝18hz，1h)，5.36(m，1h)4.37(t，j＝6.0hz，2h)，3.93-3.81(m，2h)，3.03-2.82(m，4h)，2.19(tdd，j＝14.0,12.3,7.5hz，3h)1.01(t，j＝7.5hz，3h)。圖1為cpt-ss-oh的¹hnmr譜圖，證明了制備該化合物成功。

實施例2：cpt-s-s-cooh(2)的制備

在攪拌下將實施例方法1制備的cpt-s-s-oh(300mg，0.552mmol)溶于無水二氯甲烷中，分別加入丁二酸酐(1.00g，10.0mmol)和少量4-二甲氨基吡啶(21.0mg，0.172mmol),反應液室溫攪拌過夜。溶液選干后，用水(100ml)洗滌固體三次，真空干燥得到產物cpt-s-s-cooh(產率為88％)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.44(s，1h)，8.32(d，j＝8.4hz，1h)，7.95(d，j＝8.2hz，1h)，7.84(ddd，j＝8.5,6.9,1.4hz，1h)，7.69(ddd，j＝8.1,7.0,1.1hz，1h)，7.43(s，1h)，5.71(d，j＝17.3hz，1h)，5.39(d，j＝17.3hz，1h)，5.32(s，2h)，4.46-4.25(m，4h)，3.00-2.86(m，4h)，2.79-2.61m，2h)，1.01(t，j＝7.5,3h)。esi-msm/z：計算值628.12，實測值629.10(m+h)⁺。圖2為cpt-s-s-cooh的¹hnmr譜圖，證明了制備該化合物成功。

實施例3：cd-s-s-cpt的制備

將按實施例2方法制備的cpt-s-s-cooh(628mg，1.00mmol)溶于100ml無水二氯甲烷中。分別加入n-羥基琥珀酰亞胺(0.575g，5.00mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc.hcl，1.91g，10.0mmol)，室溫下攪拌1天。有機溶劑用旋轉蒸發(fā)儀除去，混合物用冷凍的甲醇洗滌3次(100ml)。得到的白色固體(363mg，0.500mmol)溶于dmf中(20ml)，分別加入6-乙氨基-β-環(huán)糊精(1.18g，1.00mmol)和三滴三乙胺，室溫攪拌過夜。溶液倒入100丙酮中，抽濾得到淺黃色固體，二氯甲烷洗滌三次(100ml)，水洗三次(50ml)，固體抽干得到產品cd-s-s-cpt(產率74％)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.45(s，1h)，8.33(d，j＝8.4hz，1h)，7.94(d，j＝8.2hz，1h)，7.85(ddd，j＝8.5,6.9,1.4hz，1h)，7.71(ddd，j＝8.1,7.0,1.1hz，1h)，7.43(s，1h)，5.71(d，j＝6hz，1h)，5.39(d，j＝6hz，1h)，5.32(s，2h)，4.96-4.88(m，7h),4.46-4.25(m，4h)，3.83-3.68(m，28h)，3.51-3.25(m，14h),3.00-2.86(m，4h)，2.89(t，j＝6hz，2h)，2.79-2.61m，2h)，1.01(t，j＝7.5,3h)。esi-msm/z：計算值1787.72，實測值1788.86(m+h)⁺。圖3為cd-s-s-cpt的¹hnmr譜圖，證明了制備該化合物成功。

實施例4：cd-c-c-oh(5)的制備

室溫攪拌下，將4-二甲氨基吡啶(2.10g，17.2mmol)加入到喜樹堿(2.00g，5.74mmol)的二氯甲烷溶液中。繼續(xù)攪拌30分鐘后，緩慢加入三光氣(0.633g，2.12mmol)。攪拌1小時后，逐滴加入1,6-己二醇(11.8g，100mmol)，反應液室溫攪拌過夜。將混合物用飽和食鹽水(100ml)洗滌三次，分液得到的二氯甲烷有機相用無水硫酸鈉干燥。使用預填充的二氧化硅柱通過快速色譜分離純化產物。產量：1.78g(產率為63％)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.41(s，1h)，8.23(d，j＝8.7hz，1h)，7.95(dd，j＝8.2,1.1hz，1h)，7.85(ddd，j＝6.9,6.5hz，1h)，7.68(ddd，j＝8.1,6.9,1.2hz，1h)，7.36(s，1h)，5.70(d，j＝17.3hz，1h)，5.39(d，j＝1h)，5.30(s，2h)，4.21-4.05(m，2h)，3.59(dd，j＝10.1,6.1hz，2h)，2.43-2.01(m，2h)，1.74-1.65(m，3h)，1.59-1.47(m，2h)，1.45-1.32(m，4h)，1.00(t，j＝7.5hz，3h)。圖4為cpt-c-c-oh的¹hnmr譜圖，證明了制備該化合物成功。

實施例5：cpt-c-c-cooh(6)的制備

在攪拌下將按實施例4方法制備的cpt-c-c-oh(492mg，1.00mmol)溶于無水二氯甲烷中，分別加入丁二酸酐(1.00g，10.0mmol)和少量4-二甲氨基吡啶(21.0mg，0.172mmol),反應液室溫攪拌過夜。溶液選干后，用水(100ml)洗滌固體三次，真空干燥得到產物cpt-c-c-cooh。產量485mg(產率為82％)。esi-msm/z：計算值592，實測值591(m-h)^-。¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.42(s，1h)，8.28(d，j＝8.7hz，1h)，7.95(d，j＝8.3hz，1h)，7.85(ddd，j＝1h)，7.68(ddd，j＝8.1,6.9,1.1hz，1h)，7.38(d，j＝5.1hz，1h)，5.70(d，j＝17.3hz，1h),5.39(d,j＝17.3hz，1h)，5.31(s，2h)，4.23-3.99(m，4h)，2.74-2.56(m，4h)，2.37-2.07(m，2h)，1.61(ddd，j＝12.9,6.6hz，5h)，1.44-1.23(m，7h)，1.00(t，j＝7.5hz，3h)。圖5為cpt-c-c-cooh的¹hnmr譜圖，證明了制備該化合物成功。

實施例6：cd-c-c-cpt的制備

將按實施例5方法制備得到的cpt-c-c-cooh(1.18g，2.00mmol)溶于200ml無水二氯甲烷中。分別加入n-羥基琥珀酰亞胺(1.15g，10.0mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc.hcl，3.82g，20.0mmol)，室溫下攪拌1天。有機溶劑用旋轉蒸發(fā)儀除去，混合物用冷凍的甲醇洗滌3次(每次用量100ml)。得到的白色固體溶于dmf中(40ml)，分別加入6-乙氨基-β-環(huán)糊精(1.18g，1.00mmol)和三滴三乙胺，室溫攪拌過夜。溶液倒入100丙酮中，抽濾得到淺黃色固體，二氯甲烷洗滌三次(每次100ml)，水洗三次(每次20ml)，固體抽干得到產品cd-c-c-cpt(產率68％)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.43(s，1h)，8.30(d，j＝8.7hz，1h)，7.93(d，j＝8.3hz，1h)，7.84(ddd，j＝1h)，7.66(ddd，j＝8.1,6.9,1.1hz，1h)，7.39(d，j＝5.1hz，1h)，5.71(d，j＝17.3hz，1h),5.40(d,j＝17.3hz，1h)，5.32(s，2h)，4.92(m，7h),4.21-4.00(m，4h)，3.85–3.64(m，28h),3.53–3.21(m，14h),2.86(t，j＝6hz，2h)，2.76-2.53(m，4h)，2.39-2.05(m，2h)，1.62(ddd，j＝12.9,6.6hz，5h)，1.45-1.22(m，7h)，1.01(t，j＝7.5hz，3h)。esi-msm/z：計算值1751.67，實測值1752.73(m+h)⁺，證明了制備該化合物成功。

實施例7：前藥分子10，13和14的制備

將按實施例1方法制備得到的cpt-s-s-oh(528mg，1.00mmol)溶于50ml二甲亞砜中。分別加入羰基咪唑(1.62g，10.0mmol)，室溫下攪拌1天。反應液倒入冰甲醇中，得到的白色沉淀用乙醚洗滌三次(每次50ml)。所得的產品溶于二甲亞砜中(40ml)，加入6-乙氨基-β-環(huán)糊精(1.18g，1.00mmol)，室溫攪拌過夜。溶液倒入100丙酮中，抽濾得到淺黃色固體，二氯甲烷洗滌三次(每次100ml)，水洗三次(每次10ml)，固體抽干得到產品10(產率57％)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.43(s，1h)，8.32(d，j＝8.4hz，1h)，7.91(d，j＝8.2hz，1h)，7.83(ddd，j＝8.5,6.9,1.4hz，1h)，7.70(ddd，j＝8.1,7.0,1.1hz，1h)，7.45(s，1h)，5.70(d，j＝6hz，1h)，5.38(d，j＝6hz，1h)，5.34(s，2h)，4.96-4.88(m，7h),4.46-4.25(m，4h)，3.83-3.68(m，28h)，3.51-3.25(m，14h),2.89(t，j＝6hz，2h)，2.79-2.61m，2h)，1.01(t，j＝7.5,3h)。esi-msm/z：計算值1731.66，實測值1732.77(m+h)⁺，證明了制備該化合物成功。

同樣的方法下，我們分別采用6-丁氨基-β-環(huán)糊精或6-己氨基-β-環(huán)糊精替代所述的6-乙氨基-β-環(huán)糊精后，可以分別制備出另外兩種超分子前藥13和14。

化合物13：¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.43(s，1h)，8.32(d，j＝8.4hz，1h)，7.91(d，j＝8.2hz，1h)，7.83(ddd，j＝8.5,6.9,1.4hz，1h)，7.70(ddd，j＝8.1,7.0,1.1hz，1h)，7.45(s，1h)，5.70(d，j＝6hz，1h)，5.38(d，j＝6hz，1h)，5.34(s，2h)，4.96-4.88(m，7h),4.46-4.25(m，4h)，3.82-3.66(m，28h)，3.50-3.27(m，14h),2.87(t，j＝6hz，2h)，2.79-2.61m，2h)，1.52(m，2h),1.38(m，2h)，1.01(t，j＝7.5,3h)。esi-msm/z：計算值1759.71，實測值1760.80(m+h)⁺。

化合物14：¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.43(s，1h)，8.32(d，j＝8.4hz，1h)，7.91(d，j＝8.2hz，1h)，7.83(ddd，j＝8.5,6.9,1.4hz，1h)，7.70(ddd，j＝8.1,7.0,1.1hz，1h)，7.45(s，1h)，5.70(d，j＝6hz，1h)，5.38(d，j＝6hz，1h)，5.34(s，2h)，4.96-4.88(m，7h),4.46-4.25(m，4h)，3.82-3.66(m，28h)，3.50-3.27(m，14h),2.87(t，j＝6hz，2h)，2.79-2.61m，2h)，1.50(m，2h),1.36(m，2h)，1.27(m，4h)，1.01(t，j＝7.5,3h)。esi-msm/z：計算值1787.77，實測值1788.79(m+h)⁺。證明了制備該化合物成功。

實施例8：前藥分子15和16的制備

將按實施例2方法制備的cpt-s-s-cooh(628mg，1.00mmol)溶于100ml無水二氯甲烷中。分別加入n-羥基琥珀酰亞胺(0.575g，5.00mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc.hcl，1.91g，10.0mmol)，室溫下攪拌1天。有機溶劑用旋轉蒸發(fā)儀除去，混合物用冷凍的甲醇洗滌3次(100ml)。得到的白色固體(363mg，0.500mmol)溶于dmf中(20ml)，分別加入6-丁氨基-β-環(huán)糊精(2.41g，2.00mmol)和三滴三乙胺，室溫攪拌過夜。溶液倒入100丙酮中，抽濾得到淺黃色固體，二氯甲烷洗滌三次(100ml)，水洗三次(50ml)，固體抽干得到產品15(產率66％)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.44(s，1h)，8.35(d，j＝8.4hz，1h)，7.94(d，j＝8.2hz，1h)，7.85(ddd，j＝8.5,6.9,1.4hz，1h)，7.71(ddd，j＝8.1,7.0,1.1hz，1h)，7.43(s，1h)，5.71(d，j＝6hz，1h)，5.40(d，j＝6hz，1h)，5.32(s，2h)，4.96-4.88(m，7h),4.46-4.25(m，4h)，3.83-3.68(m，28h)，3.51-3.25(m，14h),3.00-2.86(m，4h)，2.89(t，j＝6hz，2h)，2.79-2.61m，2h)，1.52(m，2h),1.38(m，2h)，1.01(t，j＝7.5,3h)。esi-msm/z：計算值1815.78，實測值1816.81(m+h)⁺，證明了制備該化合物成功。

同樣的方法下，采用6-己氨基-β-環(huán)糊精替代6-丁氨基-β-環(huán)糊精后，我們可以制備出化合物16(產率63％)。¹hnmr(300mhz，cdcl3)：8.46(s，1h)，8.33(d，j＝8.4hz，1h)，7.96(d，j＝8.2hz，1h)，7.84(ddd，j＝8.5,6.9,1.4hz，1h)，7.71(ddd，j＝8.1,7.0,1.1hz，1h)，7.44(s，1h)，5.71(d，j＝6hz，1h)，5.38(d，j＝6hz，1h)，5.32(s，2h)，4.96-4.88(m，7h),4.46-4.25(m，4h)，3.83-3.68(m，28h)，3.51-3.25(m，14h),3.00-2.86(m，4h)，2.89(t，j＝6hz，2h)，2.79-2.61(m，2h)，1.54(m，2h),1.37(m，2h)，1.26(m，4h)，1.01(t，j＝7.5,3h)。esi-msm/z：計算值1843.83，實測值1844.90(m+h)⁺，證明了制備該化合物成功。

實施例9：前藥分子20的制備

將按實施例1方法制備的cpt-s-s-oh(628mg，1.00mmol)溶于100ml無水二氯甲烷中。分別加入炔丁基酸(840mg，10.0mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(edc.hcl，3.82g，20.0mmol)，室溫下攪拌1天。有機溶劑用旋轉蒸發(fā)儀除去，混合物用冷凍的甲醇洗滌3次(100ml)。得到的白色固體溶于dmf中(20ml)，分別加入6-疊氮-β-環(huán)糊精(2.32g，2.00mmol)，cuso4·5h2o，(24.9mg,0.100mmol)，抗壞血酸鈉(198mg，1.00mmol)，鼓氮氣30分鐘，在氮氣保護下室溫攪拌過夜。溶液倒入100丙酮中，抽濾得到淺黃色固體，二氯甲烷洗滌三次(100ml)，水洗三次(50ml)，固體抽干得到產品20(產率71％)。esi-msm/z：計算值1754.65，實測值1755.71(m+h)⁺，證明了制備該化合物成功。

實施例10：超分子前藥cd-s-s-cpt制備納米顆粒

取實施例3方法制備的cd-s-s-cpt(2.00mg)溶于磷酸緩沖液中(pbs,4ml,ph＝7.4)，超聲20分鐘后得到澄清溶液。從透射電鏡照片(圖6)中可以看出cd-s-s-cpt可以自組裝形成直徑約為40nm的納米粒子。這些納米粒子的穩(wěn)定性非常高，可以在溶液中保存三個月不發(fā)生任何沉淀。同樣，按照實施例6-9的方法制備的一系列其他超分子前藥也可以自組裝后形成高穩(wěn)定性的納米粒子。

另外，本發(fā)明的方法制備的一系列超分子前藥還可以與聚合物混合使用，制備出聚合物納米顆粒。舉例來說，取實施例3制備的cd-s-s-cpt(5.00mg)，甲基聚乙二醇-喜樹堿(25.0mg)溶于磷酸緩沖液中(pbs,12ml,ph＝7.4)，超聲30分鐘后得到澄清溶液。從透射電鏡照片(圖7)中可以看出所得的納米粒子直徑約為80nm。這些納米粒子的穩(wěn)定性非常高，可以在溶液中保存三個月不發(fā)生任何沉淀。同樣的，cd-s-s-cpt等本發(fā)明的一系列前藥分子可以與含有環(huán)糊精的嵌段聚合物或者含有喜樹堿的嵌段聚合物通過主客體相互作用制備出粒徑約為100nm的納米粒子。這些納米粒子具有很高的穩(wěn)定性，可以長時間保存在pbs溶液中不發(fā)生沉淀。

實施例11：藥物釋放實驗

通過透析法測量喜樹堿的釋放。簡言之，用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)將實施例3方法制備的cd-s-s-cpt配制一定濃度的納米粒子溶液(1.00mg/ml)，然后將5ml的cd-s-s-cpt溶液轉移到預浸漬的透析袋(mwco：1kda)中，并分別用pbs溶液或者含有不同濃度的gsh溶液(1.00mm，5.00mm，10.0mm)透析48小時。通過hplc(條件：30％乙腈，含0.1％tfa，1ml/min，uv檢測器，250nm)監(jiān)測透析袋中cpt的濃度，繪制出不同條件下喜樹堿藥物分子的釋放曲線。每個實驗重復3次。

結果發(fā)現(圖8)不加gsh的條件下喜樹堿釋放非常緩慢。在gsh的存在下，喜樹堿釋放顯著加快。另一方面，隨著gsh濃度的提高，喜樹堿釋放速度也變快。這一結果證明cd-s-s-cpt可以在gsh的存在下，通過gsh與雙硫鍵反應釋放出喜樹堿。

同樣，按照實施例7-9的方法制備的一系列其他超分子前藥也與上述cd-s-s-cpt一樣，制備成納米粒子溶液后，在gsh的存在下，具有與cd-s-s-cpt類似的喜樹堿釋放效果。

實施例12：cd-s-s-cpt和喜樹堿的水解實驗

用20ml二甲亞砜(dmso)和ph為7.4的pbs緩沖液的混合溶液(體積比為1:1)分別溶解喜樹堿和實施例3方法制備的cd-s-s-cpt(喜樹堿濃度保持在1mg/ml)配成溶液，室溫攪拌。每隔一定時間，通過hplc(條件：30％乙腈，含0.1％tfa，1ml/min，uv檢測器，250nm)監(jiān)測喜樹堿溶液和cd-s-s-cpt溶液中喜樹堿分子內酯結構的百分數，繪制出不同時間下喜樹堿分子的水解曲線(圖9)。每個實驗重復3次。

結果顯示(圖9)在環(huán)糊精包結下cd-s-s-cpt中喜樹堿水解大大下降，證明了這一超分子藥物相比較于喜樹堿本身可以有效抑制藥物水解，有利于提高其藥效；本發(fā)明的其他一系列前藥分子也基于相同的原理能有效抑制藥物水解。

實施例:13：體外細胞毒性測試

將人結腸癌細胞hct116接種在96孔板的mccoy's5a培養(yǎng)基(10％胎牛血清和1％青霉素)中。將細胞在37℃下在含有5％co2的潮濕氣氛中孵育。接種后24小時用新鮮培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。測試制劑選擇喜樹堿、cd-s-s-cpt和cd-c-c-cpt，將每種制劑溶解于pbs中并使用細胞培養(yǎng)基稀釋。對于每個孔，加入100μl具有不同指定藥物濃度的細胞培養(yǎng)基。通過加入100μl培養(yǎng)基產生陰性對照。將細胞孵育48小時后，用含有0.5mg/ml3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑(mtt)的100μl培養(yǎng)基替換培養(yǎng)基。孵育4小時后，除去含有mtt的培養(yǎng)基，用pbs小心洗滌3次。然后，加入dmso(100μl)，在bioteksynergyh4讀數器中測量在570nm的波長下吸光度。使用graphpadprism5進行ic50值的計算和統計分析。

如圖10顯示，喜樹堿的ic50為0.14μm，cd-s-s-cpt為0.17μm，兩者對hct116細胞都具有很好的細胞毒性。證明本發(fā)明的超分子化療藥物中，cd-s-s-cpt的喜樹堿和環(huán)糊精具有很強的抗癌活性；cd-c-c-cpt的ic50為1.92μm，表明含有二硫鍵的前藥分子細胞毒性比非二硫鍵的高很多，說明二硫鍵斷裂并且釋放喜樹堿是維持藥物毒性的關鍵所在?；谙嗤脑?，本發(fā)明的其他一系列二硫鍵連接的前藥分子也具有很強的抗癌活性。