本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種高效率的提取高質(zhì)量和高濃度的霉菌基因組提取方法。

背景技術(shù)：

自從人類基因組測(cè)序計(jì)劃完成之后，通過dna序列研究生物的遺傳性狀，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)研究中不可分割的部分，其中全基因組測(cè)序已經(jīng)是一種常用的研究方法，但現(xiàn)代分子生物學(xué)研究技術(shù)對(duì)dna樣品的要求較高，以往的sds法、ctab法作用效果無法滿足霉菌全基因組測(cè)序的高質(zhì)量文庫的要求。

霉菌與酵母等真菌不同，霉菌菌絲細(xì)胞的構(gòu)造雖然與酵母菌類似，但是其生長都是由菌絲頂端細(xì)胞的不斷延伸而實(shí)現(xiàn)的并且菌體之間連接緊密，在液體培養(yǎng)基中可看到霉菌以聚集的球體呈現(xiàn)，培養(yǎng)基清澈。隨著霉菌菌絲頂端不斷向前伸展，細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)的形態(tài)、成分都逐漸變化、加厚并趨于成熟，而成熟區(qū)，由內(nèi)至外相應(yīng)地為幾丁質(zhì)層、蛋白質(zhì)層、葡聚糖蛋白網(wǎng)層和葡聚糖層組成，一般的sds法和ctab法無法將其大量破壞。由于霉菌在液體培養(yǎng)基中生長時(shí)有聚集的特性，這大大降低了裂解試劑與菌體的有效接觸面積。在使用傳統(tǒng)的sds、ctab法時(shí)，主要從上清液中獲取基因組dna，無法將霉菌的基因組dna大量提取，樣品中有較多的多糖、糖蛋白的殘留，這對(duì)打斷dna樣品帶來非常大的困難，且很難去除，因此在構(gòu)建文庫時(shí)樣品一定要將多糖或糖蛋白去除干凈。

在樣品處理方面，常規(guī)的液氮研磨對(duì)研磨者的身體素質(zhì)要求過高，并且耗時(shí)耗力，不利于實(shí)驗(yàn)的重復(fù)。

以上兩個(gè)問題都直接影響了霉菌基因組dna提取的效率和質(zhì)量，最終導(dǎo)致傳統(tǒng)的提取方法無法滿足構(gòu)建文庫等樣品要求過高的實(shí)驗(yàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提供一種高效率提取高質(zhì)量和高濃度的霉菌基因組dna的提取方法，該方法簡單快捷，獲得的高質(zhì)量dna能滿足構(gòu)建文庫等高要求的實(shí)驗(yàn)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

一種簡單高效提取霉菌基因組dna的方法，包括以下步驟：

1)預(yù)處理：

將霉菌接種在液體培養(yǎng)基(察氏培養(yǎng)基)中，28℃下培養(yǎng)5-7天，然后將菌體收集，抽濾盡最大可能的去除水分，稱重后，取100mg菌體放入研磨器中，按重量比計(jì)算石英砂：菌體為0.25-2：1的比例加入石英砂，隨后加入研磨器容量約1/2v的液氮，在液氮揮發(fā)時(shí)，用研磨棒按壓菌體，待液氮揮發(fā)干凈后，利用其中石英砂將凍實(shí)的菌體研磨成粉末，該操作重復(fù)3-6次，總用時(shí)大約2min；

2)細(xì)胞洗滌：

將已經(jīng)研磨成粉末的菌體用勺子盛入2mlep管中，加入1ml溶液a，顛倒4-6次后，12000轉(zhuǎn)離心10min，留下沉淀，丟棄上清液；

3)細(xì)胞裂解：

將上一步的沉淀與1ml溶液b混勻，置于65℃水浴鍋中，溫育30min后，取出，12000轉(zhuǎn)離心10min，收集上清液于2mlep管中，標(biāo)記為s；

留下沉淀，與1ml溶液c混勻，置于65℃水浴鍋，溫育60min后，取出，12000轉(zhuǎn)離心10min，收集上清液于2mlep管中，標(biāo)記為c；

4)去除蛋白質(zhì)：

將步驟3)中的標(biāo)記為s和c的上清液與酚氯仿溶液等體積混勻，12000轉(zhuǎn)離心5min，收集上層水相，分別轉(zhuǎn)移至兩個(gè)新的1.5mlep管中；

5)dna沉淀：

將步驟4)收集的水相按相同體積添加異丙醇，搖勻，12000轉(zhuǎn)離心5min，丟棄上清液；

6)dna洗滌：

加入700ml70％乙醇，用槍頭輕刮管壁，使管壁上的dna沉落于管底，12000轉(zhuǎn)離心5min，該步驟重復(fù)2次；

7)dna保存

步驟6)處理完畢之后，風(fēng)干，加入60μl含有0.01g/ml的rna酶的1×te緩沖液溶液溶解沉淀的dna。

所述步驟2)中溶液a組成如下：2-15％sds，50mmedta,100mmtris，0-0.48mnacl，用固體氫氧化鈉調(diào)ph至9-10；

所述步驟3)中溶液b組成如下：10％sds，50mmedta,100mmtris；溶液c組成如下：2％ctab，0.9mnacl，50mmedta,100mmtris；

所述步驟4)中酚氯仿溶液組成如下：苯酚：氯仿：異戊醇＝25：24：1。

所述步驟6)中1×te緩沖液組成如下：5mmedta,10mmtris-hcl

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果：

1、由于霉菌的生長是由菌絲頂端細(xì)胞的不斷延伸而實(shí)現(xiàn)的，細(xì)胞之間結(jié)合緊密。在液體培養(yǎng)過程中，霉菌菌體層層加厚，若是簡單的液氮研磨，無法輕易將菌塊分散為粉末，不利于裂解液與菌體的有效接觸，導(dǎo)致dna提取效率低下。所以本發(fā)明采用分析純的石英砂同液氮一起研磨，不僅對(duì)霉菌的細(xì)胞壁的破壞大大加大，而且可以很輕松的將菌塊分散成粉末。

2、菌體的細(xì)胞壁表面多呈電負(fù)性，會(huì)吸附陽離子，雖然察式培養(yǎng)基中的鎂離子含量不算高，但是在霉菌成團(tuán)生長過程中會(huì)被富集。按傳統(tǒng)的方法操作，在研磨之后，直接加入裂解液處理，試劑中的edta量無法滿足中和鎂離子的要求，在該情況下按操作要求直接溫育，其中的dna水解酶依舊可以發(fā)揮作用，導(dǎo)致基因組dna降解。本發(fā)明，對(duì)應(yīng)該情況，特異添加了洗滌液溶液a，在經(jīng)過實(shí)驗(yàn)改良之后，可以去除研磨后的菌體粉末中的大部分疏水性蛋白和培養(yǎng)液中的金屬離子，盡可能將dna在洗滌液中的溶解量降到最小，使殘留的菌體碎片中的dna含量達(dá)到總產(chǎn)量的90％。

3、本發(fā)明采用常見的試劑，除rna酶之外，未使用蛋白酶k等其他酶類，方便霉菌dna大量提取，易于實(shí)現(xiàn)和放大生產(chǎn)。

4、本發(fā)明使用范圍廣泛，可適用于所有霉菌的基因組dna提取，得到的dna基因組的純度高，滿足于后續(xù)的構(gòu)建文庫、dna測(cè)序等實(shí)驗(yàn)。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1的方法提取獲得的青霉素基因組dna的電泳圖

泳道1:15000maker；泳道2：標(biāo)記為s的管中的基因組dna；泳道3：標(biāo)記為c的管中的基因組dna。

圖2為實(shí)施例2的方法提取獲得的青霉素基因組dna的電泳圖

泳道1：15000maker；泳道2：標(biāo)記為s的管中的基因組dna；泳道3：標(biāo)記為c的管中的基因組dna。

圖3為實(shí)施例3的方法提取獲得的青霉素基因組dna的電泳圖

泳道1:15000maker；泳道2：標(biāo)記為c的管中的基因組dna。

圖4為本發(fā)明方法、傳統(tǒng)的ctab法、某公司基因組提取試劑盒dnaisoreagent和某公司的ezup柱式真菌基因組dna抽提試劑盒提取獲得的青霉菌基因組dna的電泳圖

a為本發(fā)明方法；b為傳統(tǒng)的ctab法；c為某公司基因組提取試劑盒dnaisoreagent；d為某公司的ezup柱式真菌基因組dna抽提試劑盒。

具體實(shí)施方式

通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

實(shí)施例所用的霉菌為青霉菌。實(shí)施例中察式培養(yǎng)基成分按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)計(jì)，包括nano30.3％、na2hpo40.1％、mgso4﹒7h2o0.05％、kcl0.05％、feso40.0001％、蔗糖3％，ph自然，余量為水，121℃滅菌30min。

【實(shí)施例1】

1)預(yù)處理：

將青霉菌接種在液體培養(yǎng)基(察氏培養(yǎng)基)中，28℃下培養(yǎng)6天，然后將菌體收集，抽濾，盡最大可能的去除水分，稱重后，取99mg菌體放入研磨器中，加入石英砂30mg，隨后加入研磨器容量約1/2v的液氮。在液氮揮發(fā)時(shí)，用研磨棒按壓菌體，待液氮揮發(fā)干凈后，利用其中石英砂將凍實(shí)的菌體研磨成粉末。該操作重復(fù)4次，總用時(shí)大約2min。

2)細(xì)胞洗滌：

將已經(jīng)研磨成粉末的菌體用勺子盛入2mlep管中，加入1ml溶液a(2％sds，50mmedta,100mmtris，0.07mnacl，ph9-10)，顛倒4次后，12000轉(zhuǎn)離心10min，留下沉淀，丟棄上清液。

3)細(xì)胞裂解：

將上一步的沉淀與1ml溶液b混勻，置于65℃水浴鍋中，溫育30min后，取出，12000轉(zhuǎn)離心10min，收集上清液于2mlep管中，標(biāo)記為s。

留下沉淀，與1ml溶液c混勻，置于65℃水浴鍋，溫育60min后，取出，12000轉(zhuǎn)離心10min，收集上清液于2mlep管中，標(biāo)記為c。

4)去除蛋白質(zhì)：

將步驟3)中的標(biāo)記為s和c的上清液與等體積的酚氯仿混勻，12000轉(zhuǎn)離心5min，收集上層水相，分別轉(zhuǎn)移至兩個(gè)新的1.5mlep管中。

5)dna沉淀：

將步驟4)收集的水相按相同體積添加異丙醇，搖勻，12000轉(zhuǎn)離心5min，丟棄上清液。

6)dna洗滌：

加入700ml70％乙醇，用槍頭輕刮管壁，使管壁上的dna沉落于管底，12000轉(zhuǎn)離心5min，該步驟重復(fù)2次。

7)dna保存

步驟6)處理完畢之后，風(fēng)干，加入60μl含有0.01g/ml的rna酶的1×te緩沖液溶液溶解沉淀的dna。

如圖1所示，第2泳道和第3泳道分別為標(biāo)記為s和c，s中共獲得2.3μg，c中共獲得3.5μg，a260/a230在2.0與2.5之間，碳水化合物污染較少。

【實(shí)施例2】

1)預(yù)處理：

將青霉菌接種在液體培養(yǎng)基(察氏培養(yǎng)基)中，28℃下培養(yǎng)6天，然后將菌體收集，抽濾，盡最大可能的去除水分，稱重后，取50mg菌體放入研磨器中，加入石英砂77mg，隨后加入研磨器容量約1/2v的液氮。在液氮揮發(fā)時(shí)，用研磨棒按壓菌體，待液氮揮發(fā)干凈后，利用其中石英砂將凍實(shí)的菌體研磨成粉末。該操作重復(fù)4次，總用時(shí)大約2min。

2)細(xì)胞洗滌：

將已經(jīng)研磨成粉末的菌體用勺子盛入2mlep管中，加入1ml溶液a(10％sds，50mmedta,100mmtris，0.48mnacl，ph9-10)，顛倒4次后，12000轉(zhuǎn)離心10min，留下沉淀，丟棄上清液。

3)細(xì)胞裂解：

將上一步的沉淀與1ml溶液b混勻，置于65℃水浴鍋中，溫育30min后，取出，12000轉(zhuǎn)離心10min，收集上清液于2mlep管中，標(biāo)記為s。

留下沉淀，與1ml溶液c混勻，置于65℃水浴鍋，溫育30min后，取出，12000轉(zhuǎn)離心10min，收集上清液于2mlep管中，標(biāo)記為c。

4)去除蛋白質(zhì)：

將步驟3)中的標(biāo)記為s和c的上清液與等體積的酚氯仿混勻，12000轉(zhuǎn)離心5min，收集上層水相，分別轉(zhuǎn)移至兩個(gè)新的1.5mlep管中。

5)dna沉淀：

將步驟4)收集的水相按相同體積添加異丙醇，搖勻，12000轉(zhuǎn)離心5min，丟棄上清液。

6)dna洗滌：

加入700ml70％乙醇，用槍頭輕刮管壁，使管壁上的dna沉落于管底，12000轉(zhuǎn)離心5min，該步驟重復(fù)2次。

7)dna保存

步驟6)處理完畢之后，風(fēng)干，加入60μl含有0.01g/ml的rna酶的1×te緩沖液溶液溶解沉淀的dna。

如圖2所示，第2泳道和第3泳道分別為標(biāo)記為s和c，s中共獲得2.2μg，c中共獲得1.5μg，a260/a230在2.0與2.5之間，碳水化合物污染較少。

【實(shí)施例3】

1)預(yù)處理：

將青霉菌接種在液體培養(yǎng)基(察氏培養(yǎng)基)中，30℃下培養(yǎng)6天，然后將菌體收集，抽濾，盡最大可能的去除水分，稱重后，取134mg菌體放入研磨器中，加入石英砂134mg，隨后加入研磨器容量約1/4v的液氮。在液氮揮發(fā)時(shí)，用研磨棒按壓菌體，待液氮揮發(fā)干凈后，利用其中石英砂將凍實(shí)的菌體研磨成粉末。該操作重復(fù)6次，總用時(shí)大約3min。

2)細(xì)胞洗滌：

將已經(jīng)研磨成粉末的菌體用勺子盛入2mlep管中，加入1ml溶液a(15％sds，50mmedta,100mmtris，ph9-10)，顛倒8次后，12000轉(zhuǎn)離心10min，留下沉淀，丟棄上清液。

3)細(xì)胞裂解：

將上一步的沉淀與1ml溶液b混勻，置于65℃水浴鍋中，溫育30min后，取出，12000轉(zhuǎn)離心5min，收集上清液于2mlep管中，標(biāo)記為s。

留下沉淀，與1ml溶液c混勻，置于65℃水浴鍋，溫育60min后，取出，12000轉(zhuǎn)離心10min，收集上清液于2mlep管中，標(biāo)記為c。

4)去除蛋白質(zhì)：

將步驟3)中的標(biāo)記c的上清液與等體積的酚氯仿混勻，12000轉(zhuǎn)離心5min，收集上層水相，分別轉(zhuǎn)移至新的1.5mlep管中。

5)dna沉淀：

將步驟4)收集的水相按相同體積添加異丙醇，搖勻，12000轉(zhuǎn)離心10min，丟棄上清液。

6)dna洗滌：

加入1ml70％乙醇，用槍頭輕刮管壁，使管壁上的dna沉落于管底，12000轉(zhuǎn)離心5min，該步驟重復(fù)2次。

7)dna保存

步驟6)處理完畢之后，風(fēng)干，加入60μl含有0.01g/ml的rna酶的1×te緩沖液溶液溶解沉淀的dna。

如圖3所示，第2泳道為標(biāo)記為c的管中的dna，其中共獲得3.9μg，a260/a230在2.0與2.5之間，碳水化合物污染較少。

【實(shí)施例4】本發(fā)明方法與傳統(tǒng)的ctab法、某公司基因組提取試劑盒dnaisoreagent和某公司的ezup柱式真菌基因組dna抽提試劑盒進(jìn)行比較

將本實(shí)驗(yàn)方法(圖4，a)與傳統(tǒng)的ctab法(圖4，b)、某公司基因組提取試劑盒dnaisoreagent(圖4，c)和某公司的ezup柱式真菌基因組dna抽提試劑盒(圖4，d)進(jìn)行比較。

dnaisoreagent試劑盒的說明書中并未闡述青霉菌的基因組dna提取的特殊處理，便按照其說明書上革蘭氏陽性菌的操作方法進(jìn)行使用，對(duì)應(yīng)圖4c可以看到，該試劑盒可較好的提取基因組dna,但是存在明顯的降解現(xiàn)象，無法保證高質(zhì)量的dna。

ezup柱式真菌基因組dna抽提試劑盒的說明書中表明，該試劑盒用于提取新鮮大型真菌(如蘑菇)，按其說明書步驟進(jìn)行基因組dna提取，如圖4d可以看到，該試劑盒無法提取青霉菌的基因組dna。

傳統(tǒng)的ctab法應(yīng)用廣泛，不僅可以提取植物的基因組dna也可以提取大部分細(xì)菌的基因組dna，但是對(duì)于青霉菌的基因組dna的提取卻顯得不理想。如圖4b。

經(jīng)過改進(jìn)的青霉菌基因組dna的提取方法不僅可以減少基因組dna的降解，并且可以保證較高的產(chǎn)量，如圖4a。與其他三種方法的最大不同之處，可以結(jié)合實(shí)例1-3便可看出，主要利用溶液a的洗滌作用，將青霉菌進(jìn)行一次洗滌，以利于后期的裂解處理和dna的質(zhì)量保證。