本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及在研究和治療應(yīng)用中使用的對pd-1和tem-8同時具有高親和力的雙特異性抗體、或其變體、或功能性片段，并進(jìn)一步涉及編碼所涉及的抗體、或其變體、或功能性片段的核酸分子，用于表達(dá)所述抗體、或其變體、或功能性片段的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞，以及所述抗體、或其變體、或功能性片段的制備方法。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的雙特異性抗體、或其變體、或功能性片段的方法，包含其的治療性組合物，以及其用于增強(qiáng)免疫細(xì)胞的功能、上調(diào)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和用于治療免疫細(xì)胞功能失調(diào)性病癥，例如腫瘤免疫，以及用于治療癌癥的用途。
背景技術(shù)：
：雙特異性抗體是指含有2種特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)的人工抗體，其能夠在靶細(xì)胞和功能分子(細(xì)胞)之間架起橋梁，激發(fā)具有導(dǎo)向性的免疫反應(yīng)，是基因工程抗體的一種。雙特異性抗體現(xiàn)已成為抗體工程領(lǐng)域的熱點(diǎn)，在腫瘤的免疫治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。目前，這種抗體的制備主要有三種方法：化學(xué)偶聯(lián)法、雜交-雜交瘤法和基因工程抗體制備法，其中基因工程抗體制備法最常用，也最先進(jìn)。一般來說，雙特異性結(jié)合蛋白分子可以分成兩大類：一類是含有fc區(qū)，另一類是缺乏fc區(qū)，后者通常為小于免疫球蛋白且含有fc區(qū)的igg雙特異性分子。fc區(qū)有利于采用已建立的針對igg分子的流程來對雙特異性抗體進(jìn)行純化，并且能改善其溶解性和穩(wěn)定性。此外，fc區(qū)還對fc-介導(dǎo)的效應(yīng)功能有影響，這可能是一些治療應(yīng)用所需的附加效應(yīng)，例如抗體依賴的細(xì)胞毒性(adcc)、補(bǔ)體結(jié)合(cdc)和由于其具有更大的分子量和fc新生兒受體(fcrn)介導(dǎo)的循環(huán)過程而導(dǎo)致的長半衰期。這些功能可以通過基因工程的手段進(jìn)一步被利用，例如，通過消除adcc和/或cdc同時保留長半衰期。相比之下，缺乏fc區(qū)的雙特異性結(jié)合蛋白分子完全依賴其抗原結(jié)合能力來發(fā)揮治療效力。程序性細(xì)胞死亡因子1(programmeddeath1，pd-1)是一種主要在活化免疫細(xì)胞上表達(dá)的抑制性受體。在腫瘤患者中，通過pd-1的高表達(dá)介導(dǎo)t細(xì)胞免疫負(fù)性調(diào)控信號，參與腫瘤免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)(liuj，etal.,plasmacellsfrommultiplemyelomapatientsexpressb7-h1(pd-l1)andincreaseexpressionafterstimulationwithifn-γandtlrligandsviaamyd88-，traf6-，andmek-dependentpathway[j].blood，2007，110(1)：296-304)。程序性細(xì)胞死亡因子配體1(programmeddeath1-ligand，pd-l1)和程序性細(xì)胞死亡因子配體2(programmeddeath2-ligand，pd-l2)是pd-1結(jié)合配體(keirme，etal.,pd-1anditsligandsintoleranceandimmunity[j].annurevimmunol，2008，26：677-704)。pd-l1與pd-1胞外區(qū)結(jié)合后，通過pd-1胞質(zhì)區(qū)尾部的免疫受體酪氨酸抑制模體，下調(diào)cd3(cd28)誘導(dǎo)的磷脂酰肌醇3激酶和蛋白激酶b的活性，抑制t細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)t細(xì)胞凋亡；同時還招募蛋白酪氨酸磷酸酶1，使與其結(jié)合的信號分子去磷酸化，從而抑制t細(xì)胞的增殖活化和功能(jinht，etal.,roleofpd-1inregulatingtcellimmunity[j].currtopmicrobiolimmunol，2011，350(1)：17-37)。t細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的主要組成部分(ahmadzadehm，etal.,tumorantigen-specificcd8tcellsinfiltratingthetumorexpresshighlevelsofpd-1andarefunctionallyimpaired[j].blood，2009，114(8)：1537-1544)。pd-1在腫瘤侵潤淋巴細(xì)胞、腫瘤特異性t細(xì)胞及一些損傷相關(guān)的t細(xì)胞中高表達(dá)(quezadasa，etal.,exploitingctla-4，pd-1andpd-l1toreactivatethehostimmuneresponseagainstcancer[j].brjcancer，2013，108(8)：1560-1565)，其配體pd-l1在多種腫瘤細(xì)胞(如各類非淋巴系腫瘤，如黑色素瘤、肝癌、胃癌、腎細(xì)胞癌等)中均有表達(dá)，表明pd-1/pd-l信號通路可能參與腫瘤免疫逃逸(simeonee，etal.,immunomodulatingantibodiesinthetreatmentofmetastaticmelanoma：theexperiencewithanti-ctla-4，anti-cd137andanti-pd1[j].jimmunotoxicol，2012，9(3)：241-247)。因此，阻斷pd-1/pd-l可通過在腫瘤環(huán)境中抑制免疫反應(yīng)而有效地進(jìn)行抗癌治療。近兩年來，美國臨床腫瘤年會最令人興奮的臨床試驗(yàn)大概就是pd-1抗癌抗體帶來的黑色旋風(fēng)。pd-1抗體帶來的臨床抗癌效果是前所未有的。它可以控制50％的皮膚癌病人的癌癥進(jìn)展，治愈10％左右的皮膚癌病人。對于頑固的非小細(xì)胞肺癌病人，多年來醫(yī)學(xué)上束手無策，但pd-1抗體對24％的病人有臨床控制效果。由于其廣譜抗癌作用，對腎癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌、血癌、頭頸癌、腸癌和腦瘤等癌癥的臨床療效也正在臨床二期或三期試驗(yàn)之中。腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物(tumorendotheliamarker，tem1-9)是通過對腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞和臨近正常組織血管內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行基因串連比對分析(serialanalysisgeneexpress，sage)發(fā)現(xiàn)的9個在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)的基因或蛋白(stcroixb，eta1.,genesexpressedinhumantumorendothelium[j].science(washdc),2000,289(5482):1197-1202)。tem-8是tem家族的一種，與其它tem和vegfr相比，tem-8在腫瘤血管內(nèi)皮表達(dá)更為特異，在腫瘤血管中存在，而正常組織中極少或不存在。更為重要的是，tem-8隨后被鑒定為炭疽毒素的一種受體。tem-8本身具有重要的生物學(xué)功能，高表達(dá)的tem-8能促進(jìn)細(xì)胞的粘附和遷移，但這些作用可以被重組的胞外區(qū)蛋白所阻斷(hotchkisska,etal.,tem-8expressionstimulatesendothelialcelladhesionandmigrationbyregulatingcell-matrixinteractionsoncollagen.expcellres,2005,305(2):133-144)；同時，腫瘤浸潤和血管生長必須的細(xì)胞因子之一—il-1β能明顯誘導(dǎo)tem-8的表達(dá)(rmalika,etal.,upregulationoftumorendothelialmarker-8byinterleukin-1βanditsimpactinil-1βinducedangiogenesis.intjmolmed,2004,14(1):75-80)。此外，針對tem-8的抗腫瘤抗體樣蛋白，即人tem-8胞外區(qū)與人iggfc片段的融合蛋白tem-8fc具有顯著地抑制腫瘤生長活性和抗腫瘤效果，說明tem-8是一個潛在的抗腫瘤靶點(diǎn)(duanhf，etal.,antitumoractivitiesoftem8-fc:anengineeredantibody-likemoleculetargetingtumorendothelialmarker8.jnatlcancerinst,2007,99(2):1551-1555)。雖然pd-1抗體藥物由于其靶向免疫檢查點(diǎn)而對多種腫瘤具有強(qiáng)大的廣譜抗癌活性，但同時也存在多種潛在的副作用，而且單一的靶向性抗體療法雖然最初存在一定的療效，在隨后的治療中通常會產(chǎn)生由其它信號傳導(dǎo)級聯(lián)的上調(diào)所致的治療抗性，因此有必要進(jìn)一步提高pd-1抗體藥物抗腫瘤的靶向性，降低治療副作用的風(fēng)險(xiǎn)，同時提高有效性。而隨著計(jì)算機(jī)科學(xué)的迅猛發(fā)展，近年來計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)成為研究與開發(fā)新藥的嶄新技術(shù)，明顯加快了新藥設(shè)計(jì)的速度和效率?；诘鞍踪|(zhì)空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)藥物研究倍受重視，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不斷解析，pdb數(shù)據(jù)不斷增長，使計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)藥物成為可能。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)中pd-1抗體藥物存在的缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有顯著提高的抗癌活性的新型pd-1抗體藥物。經(jīng)過大量的篩選試驗(yàn)和優(yōu)化研究，本發(fā)明人出人意料地發(fā)現(xiàn)了一種具有顯著提高的抗腫瘤靶向性，降低的治療副作用風(fēng)險(xiǎn)，同時具有顯著提高的有效性的抗pd-1和tem-8的雙特異性抗體。最重要的是，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與其它腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物的抗體相比，將抗pd-1抗體與抗tem-8抗體進(jìn)行組合所形成的雙特異性抗體產(chǎn)生了明顯的協(xié)同效果，即其療效相比兩種單一抗體的療效具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著提高，這是本發(fā)明之前的現(xiàn)有技術(shù)所無法預(yù)料的。本發(fā)明用于解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：一種抗pd-1和tem-8雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段，其包括：a.特異性識別和結(jié)合免疫細(xì)胞表面抗原pd-1的結(jié)構(gòu)域，其包括抗pd-1特異性抗體的重鏈可變區(qū)(抗pd-1vh)；以及b.特異性識別和結(jié)合腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物tem-8的結(jié)構(gòu)域，其包括抗tem-8特異性抗體的重鏈可變區(qū)(抗tem-8vh)。優(yōu)選地，所述特異性識別和結(jié)合免疫細(xì)胞表面抗原pd-1的結(jié)構(gòu)域由依次連接的抗pd-1特異性抗體的輕鏈可變區(qū)(抗pd-1vl)、重鏈可變區(qū)(抗pd-1vh)、鉸鏈區(qū)和fc片段(抗pd-1ch2-ch3)組成，或由一組抗pd-1特異性抗體的輕鏈(抗pd-1vl-cl)和重鏈(抗pd-1vh-ch1-鉸鏈區(qū)-ch2-ch3)組成，或由兩組抗pd-1特異性抗體的輕鏈(抗pd-1vl-cl)和重鏈(抗pd-1vh-ch1-鉸鏈區(qū)-ch2-ch3)組成，或由抗pd-1特異性抗體的輕鏈可變區(qū)(抗pd-1vl)和重鏈可變區(qū)(抗pd-1vh)組成。優(yōu)選地，所述特異性識別和結(jié)合腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物tem-8的結(jié)構(gòu)域由依次連接的抗tem-8特異性抗體的輕鏈可變區(qū)(抗tem-8vl)、重鏈可變區(qū)(抗tem-8vh)、鉸鏈區(qū)和fc片段(抗tem-8ch2-ch3)組成，或由一組抗tem-8特異性抗體的輕鏈(抗tem-8vl-cl)和重鏈(抗tem-8vh-ch1-鉸鏈區(qū)-ch2-ch3)組成，或由兩組抗tem-8特異性抗體的輕鏈(抗tem-8vl-cl)和重鏈(抗tem-8vh-ch1-鉸鏈區(qū)-ch2-ch3)組成，或由抗tem-8特異性抗體的輕鏈可變區(qū)(抗tem-8vl)和重鏈可變區(qū)(抗tem-8vh)組成。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實(shí)施方案，所述抗pd-1和tem-8雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段包括：a’.特異性識別和結(jié)合免疫細(xì)胞表面抗原pd-1的結(jié)構(gòu)域，其由一組抗pd-1特異性抗體的輕鏈(抗pd-1vl-cl)和重鏈(抗pd-1vh-ch1-鉸鏈區(qū)-ch2-ch3)組成；以及b’.特異性識別和結(jié)合腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物tem-8的結(jié)構(gòu)域，其由一組抗tem-8特異性抗體的輕鏈(抗tem-8vl-cl)和重鏈(抗tem-8vh-ch1-鉸鏈區(qū)-ch2-ch3)組成。優(yōu)選地，所述特異性識別和結(jié)合免疫細(xì)胞表面抗原pd-1的結(jié)構(gòu)域與所述特異性識別和結(jié)合腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物tem-8的結(jié)構(gòu)域通過一個或多個二硫鍵，例如一個或多個位于鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實(shí)施方案，所述抗pd-1和tem-8雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段包括：a”.特異性識別和結(jié)合免疫細(xì)胞表面抗原pd-1的結(jié)構(gòu)域，其由一組抗pd-1特異性抗體的輕鏈(抗pd-1vl-cl)和重鏈(抗pd-1vh-ch1-鉸鏈區(qū)-ch2-ch3)組成；以及b”.特異性識別和結(jié)合腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物tem-8的結(jié)構(gòu)域，其由依次連接的抗tem-8特異性抗體的輕鏈可變區(qū)(抗tem-8vl)、重鏈可變區(qū)(抗tem-8vh)、鉸鏈區(qū)和fc片段(抗tem-8ch2-ch3)組成。優(yōu)選地，所述特異性識別和結(jié)合免疫細(xì)胞表面抗原pd-1的結(jié)構(gòu)域與所述特異性識別和結(jié)合腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物tem-8的結(jié)構(gòu)域通過一個或多個二硫鍵，例如一個或多個位于鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實(shí)施方案，所述抗pd-1和tem-8雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段包括：a”’.特異性識別和結(jié)合免疫細(xì)胞表面抗原pd-1的結(jié)構(gòu)域，其由依次連接的抗pd-1特異性抗體的輕鏈可變區(qū)(抗pd-1vl)、重鏈可變區(qū)(抗pd-1vh)、鉸鏈區(qū)和fc片段(抗pd-1ch2-ch3)組成；以及b”’.特異性識別和結(jié)合腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物tem-8的結(jié)構(gòu)域，其由一組抗tem-8特異性抗體的輕鏈(抗tem-8vl-cl)和重鏈(抗tem-8vh-ch1-鉸鏈區(qū)-ch2-ch3)組成。優(yōu)選地，所述特異性識別和結(jié)合免疫細(xì)胞表面抗原pd-1的結(jié)構(gòu)域與所述特異性識別和結(jié)合腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物tem-8的結(jié)構(gòu)域通過一個或多個二硫鍵，例如一個或多個位于鉸鏈區(qū)的二硫鍵連接。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實(shí)施方案，所述抗pd-1和tem-8雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段包括：a””.特異性識別和結(jié)合免疫細(xì)胞表面抗原pd-1的結(jié)構(gòu)域，其由兩組抗pd-1特異性抗體的輕鏈(抗pd-1vl-cl)和重鏈(抗pd-1vh-ch1-鉸鏈區(qū)-ch2-ch3)組成；以及b””.特異性識別和結(jié)合腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物tem-8的結(jié)構(gòu)域，其由兩組抗tem-8特異性抗體的輕鏈可變區(qū)(抗tem-8vl)和重鏈可變區(qū)(抗tem-8vh)組成。優(yōu)選地，所述特異性識別和結(jié)合免疫細(xì)胞表面抗原pd-1的結(jié)構(gòu)域中的每個抗pd-1特異性抗體的重鏈(抗pd-1vh-ch1-鉸鏈區(qū)-ch2-ch3)的ch3分別與所述特異性識別和結(jié)合腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物tem-8的結(jié)構(gòu)域中的每個抗tem-8特異性抗體的重鏈可變區(qū)(抗tem-8vh)通過化學(xué)鍵連接。優(yōu)選地，所述的抗pd-1和/或所述tem-8雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段是嵌合抗體、人源化抗體或全人抗體。優(yōu)選地，所述特異性識別和結(jié)合pd-1的結(jié)構(gòu)域中的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno:1、5、9或25所示；輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno:3、7、11或27所示。優(yōu)選地，所述特異性識別和結(jié)合tem-8的結(jié)構(gòu)域中的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno:13、17、21或29所示；輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno:15、19、23或31所示。優(yōu)選地，所述抗pd-1特異性抗體的重鏈(抗pd-1vh-ch1-鉸鏈區(qū)-ch2-ch3)的氨基酸序列為seqidno:33，核苷酸序列為seqidno:34；所述抗pd-1特異性抗體的輕鏈(抗pd-1vl-cl)的氨基酸序列為seqidno:35，核苷酸序列為seqidno:36；所述由依次連接的抗pd-1特異性抗體的輕鏈可變區(qū)(抗pd-1vl)、重鏈可變區(qū)(抗pd-1vh)、鉸鏈區(qū)和fc片段(抗pd-1ch2-ch3)組成的所述特異性識別和結(jié)合免疫細(xì)胞表面抗原pd-1的結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為seqidno:37，核苷酸序列為seqidno:38。優(yōu)選地，所述抗tem-8特異性抗體的重鏈(抗tem-8vh-ch1-鉸鏈區(qū)-ch2-ch3)的氨基酸序列為seqidno:39，核苷酸序列為seqidno:40；所述抗tem-8特異性抗體的輕鏈(抗tem-8vl-cl)的氨基酸序列為seqidno:41，核苷酸序列為seqidno:42；所述由依次連接的抗tem-8特異性抗體的輕鏈可變區(qū)(抗tem-8vl)、重鏈可變區(qū)(抗tem-8vh)、鉸鏈區(qū)和fc片段(抗tem-8ch2-ch3)組成的所述特異性識別和結(jié)合腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物tem-8的結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為seqidno:43，核苷酸序列為seqidno:44；所述由抗tem-8特異性抗體的輕鏈可變區(qū)(抗tem-8vl)和重鏈可變區(qū)(抗tem-8vh)組成的所述特異性識別和結(jié)合腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物tem-8的結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為seqidno:45，核苷酸序列為seqidno:46。另一方面，本發(fā)明還提供了一種編碼所述抗pd-1和tem-8雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段的核酸分子，或者一種包含所述核酸分子的表達(dá)載體，或者一種包含所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，所述特異性識別和結(jié)合pd-1的結(jié)構(gòu)域中的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seqidno:2、6、10或26所示；輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seqidno:4、8、12或28所示。優(yōu)選地，所述特異性識別和結(jié)合tem-8的結(jié)構(gòu)域中的重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seqidno:14、18、22或30所示；輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seqidno:16、20、24或32所示。再一方面，本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包括所述抗pd-1和tem-8雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段，或者所述核酸分子，或者所述表達(dá)載體，或者所述宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，所述藥物組合物還包括可藥用的載體和/或輔料；優(yōu)選地，所述藥物組合物還包括其它活性劑，例如化療藥物，如替加氟、氟尿嘧啶和奧沙利鉑等；癌癥輔助治療藥物，如胸腺肽α1、胸腺五肽、亞葉酸鈣、格拉司瓊和托烷司瓊等；細(xì)胞毒劑，如阿里他汀、卡奇霉素、美登素和倍癌霉素等；免疫細(xì)胞，如nk細(xì)胞，t細(xì)胞和dc-cik細(xì)胞等。所述藥物組合物的劑型可以為液體注射劑型或固體栓劑劑型。又一方面，本發(fā)明還提供了所述抗pd-1和tem-8雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段、所述的核酸分子、所述的表達(dá)載體或所述的宿主細(xì)胞在制備治療癌癥、感染性疾病或炎性疾病的藥物中的應(yīng)用。具體地，其中所述癌癥選自胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、食道癌、小腸癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、黑素瘤、腎癌、前列腺癌、乳癌、結(jié)腸癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚或眼內(nèi)惡性黑素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、腎上腺癌、肛區(qū)癌、陰戶癌、尿道癌、陰莖癌、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎盂癌、表皮樣癌、鱗狀細(xì)胞癌、何杰金氏病、非何杰金氏淋巴瘤、內(nèi)分泌系統(tǒng)的癌癥、軟組織肉瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的贅生物、原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤、腫瘤血管發(fā)生、脊髓軸腫瘤、腦干膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤、t細(xì)胞淋巴瘤、慢性或急性白血病(其包括急性髓細(xì)胞樣白血病、慢性髓細(xì)胞樣白血病、急性淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病)、兒童期實(shí)體瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤中的一種或多種；所述感染性疾病選自hiv，流行性感冒，皰疹，賈第蟲病，瘧疾，利什曼病，或以下病毒引起的感染：肝炎病毒(例如甲型、乙型或丙型肝炎病毒)、皰疹病毒(例如vzv、hsv-1、hav-6、hsv-ii、cmv或埃巴二氏病毒)、腺病毒、流感病毒、牛痘病毒、htlv病毒、登革熱病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病病毒、黃病毒、艾柯病毒、鼻病毒、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、細(xì)小病毒、jc病毒和蟲媒病毒性腦炎病毒，或以下細(xì)菌引起的感染：衣原體、立克次氏體、肺炎球菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、腦膜炎球菌、conococci、沙雷氏菌、克雷伯氏菌、變形菌、假單胞菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、白喉?xiàng)U菌、肉毒桿菌、炭疽桿菌、破傷風(fēng)梭菌、軍團(tuán)菌、鼠疫桿菌、鉤端螺旋體病或萊姆氏病細(xì)菌，以下真菌引起的感染：曲霉(例如煙曲霉、黑曲霉等)、假絲酵母(例如白色假絲酵母)、克魯斯假絲酵母、光滑假絲酵母、熱帶假絲酵母、新型隱球酵母、皮炎芽酵母、毛霉目的屬(例如毛霉屬，犁頭霉屬或根霉屬)、申克氏孢子絲菌、巴西副球孢子菌、粗球孢菌或加膜組織胞漿菌，以下寄生蟲引起的感染：痢疾內(nèi)變形蟲、結(jié)腸腸袋蟲、福納氏蟲、棘變形蟲、間日瘧原蟲、田鼠巴貝蟲、吸吮賈第蟲、隱孢子蟲、卡氏肺囊蟲、布魯斯錐蟲、克魯茲錐蟲、多氏利什曼蟲、鼠弓漿蟲或巴西日圓線蟲；所述炎性疾病選自急性播散性腦脊髓炎、阿狄森病、強(qiáng)直性脊柱炎、抗磷脂抗體綜合征、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、關(guān)節(jié)炎、貝切特病、恰加斯病、克羅恩病、大皰性類天皰瘡、腹部疾病、皮肌炎、移植物抗宿主病、格雷夫斯病、1型糖尿病、肺出血-腎炎綜合征、格-巴二氏綜合征、橋本病、超ige綜合征、特發(fā)性血小板減少性紫癜、紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無力、天皰瘡、惡性貧血、多肌炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變、銀屑病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、斯耶格倫綜合征、顳動脈炎、血管炎或韋格納肉芽腫病。本發(fā)明還提供了所述抗pd-1和tem-8雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段的制備方法，其包括在能夠產(chǎn)生所述抗pd-1和tem-8雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段的條件下培養(yǎng)本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞，以及回收所產(chǎn)生的抗pd-1和tem-8雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段。本發(fā)明提供了能夠同時特異性結(jié)合程序性死亡因子1(pd-1)和腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物8(tem-8)的雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段。本發(fā)明的雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段具有以下特性的至少一種：a.能夠與pd-1以高特異性結(jié)合，阻斷pd-1和pd-l1的相互作用；b.與其它c(diǎn)d28家族成員(如icos、ctla-4和cd28)不發(fā)生結(jié)合；c.能夠與tem-8以高特異性結(jié)合；d.與其他血管內(nèi)皮生長因子(如vegfr1-3)不發(fā)生結(jié)合；e.激活免疫細(xì)胞(如腫瘤特異性t細(xì)胞)，并特異性識別tem-8陽性腫瘤，促進(jìn)cd8+進(jìn)入實(shí)體瘤組織，使ifnγ等免疫效應(yīng)物的水平大大增加，從而實(shí)現(xiàn)靶向殺傷腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明還提供了人源化pd-1/tem-8雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段。所述人源化抗體由免疫小鼠產(chǎn)生的鼠源抗體經(jīng)由計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)并結(jié)合噬菌體展示技術(shù)而得到，并且根據(jù)其與不同物種的pd-1和tem-8蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特性，鑒定其相應(yīng)的結(jié)合表位。本發(fā)明所述的人源化抗pd-1/tem-8雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段具備上述pd-1/tem-8雙特異性抗體、或其變體、或其功能性片段的有利特性。本發(fā)明所述的雙特異抗體、或其變體、或其功能性片段可以是全長抗體，或僅包含兩抗原結(jié)合部分，如重鏈可變區(qū)(vh)、單鏈(scfv)，或全長抗體與抗原結(jié)合部分組成的融合蛋白(如圖2)，如上所述任何形式組合所形成的雙特異結(jié)合蛋白分子均在本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。本發(fā)明所述的變體或功能性片段包括通過化學(xué)修飾或通過摻入脂質(zhì)體中能夠增加半壽期的任何片段，修飾后的片段保留與其來源抗體相同的結(jié)合特異性和親和力，這樣獲得的新的具有雙特異結(jié)合特性的蛋白分子也在本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。在不實(shí)質(zhì)性影響抗體活性的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明的序列替換、添加和/或缺失一個或更多個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個或更多個)氨基酸，以獲得所述抗體或其功能性片段之序列的變體。它們都被視為包括在本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以將編碼本發(fā)明所述pd-1/tem-8雙特異性抗體的dna分子克隆到載體中，進(jìn)而轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。因此，本發(fā)明還提供了以圖1a-d所示雙特異抗體為例的重組dna載體。編碼圖2所示pd-1/tem-8雙特異抗體的變體及功能性片段的載體及宿主細(xì)胞也在本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞可以為原核宿主細(xì)胞、真核宿主細(xì)胞或噬菌體。所述原核宿主細(xì)胞可以為大腸桿菌、枯草桿菌、乳酸菌、鏈霉菌或奇異變形菌等。所述真核宿主細(xì)胞可以為如巴斯德畢赤酵母、釀酒酵母、裂殖酵母、木霉等的真菌，如草地粘蟲等的昆蟲細(xì)胞，如煙草等的植物細(xì)胞，如bhk細(xì)胞、cho細(xì)胞、cos細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞等的哺乳動物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選為哺乳動物細(xì)胞，更優(yōu)選bhk細(xì)胞、cho細(xì)胞、nso細(xì)胞或cos細(xì)胞。本文使用的術(shù)語“藥物組合物”表示組合在一起以實(shí)現(xiàn)某種特定目的的至少一種藥物以及任選的可藥用載體、輔料或治療性細(xì)胞的組合。在某些實(shí)施方案中，所述藥物組合物包括在時間和/或空間上分開的組合，只要其能夠共同作用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。例如，所述藥物組合物所含的成分(例如根據(jù)本發(fā)明的抗體、核酸分子、核酸分子的組合和/或綴合物)可以以整體施用于對象，或者分開施用于對象。當(dāng)所述藥物組合物所含的成分分開地施用于對象時，所述成分可以同時或依次施用于對象。優(yōu)選地，所述可藥用載體是水、緩沖溶液、等滲鹽溶液如pbs(磷酸鹽緩沖液)、葡萄糖、甘露醇、右旋葡萄糖、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、纖維素、碳酸鎂、0.3％甘油、透明質(zhì)酸、乙醇、聚亞烷基二醇如聚丙二醇或甘油三酯等。所用可藥用載體的類型尤其依賴于根據(jù)本發(fā)明的組合物是否配制為用于口服、鼻、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或靜脈施用。根據(jù)本發(fā)明的組合物可包含潤濕劑、乳化劑或緩沖液物質(zhì)作為添加劑。根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可通過任何適宜的途徑施用，例如可口服、鼻、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)施用。在一個相關(guān)方面，本發(fā)明提供了所述pd-1/tem-8雙特異性抗體與第二治療劑組合的藥物組合物。在一個實(shí)施方案中，所述第二治療劑是有利地與pd-1/tem-8雙特異性抗體組合的任意試劑。可有利地與所述pd-1/tem-8雙特異性抗體組合的示例性試劑包括但不限于抑制pd-1活性的其他試劑(包括其他抗體或其抗原結(jié)合片段、肽抑制劑、小分子拮抗劑等)和/或干擾pd-1上游或下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的試劑。本發(fā)明提供了一種所述pd-1/tem-8雙特異性抗體與其他治療方法聯(lián)合使用的方法。在一個實(shí)施方案中，所述其他療法是有利地與所述pd-1/tem-8雙特異性抗體組合的任意治療方法?？捎欣嘏c所述pd-1/tem-8雙特異性抗體組合的示例性治療方法包括但不限于具有治療本發(fā)明適應(yīng)癥的其他療法(包括手術(shù)、化療、放療、細(xì)胞免疫治療等)。本發(fā)明提供的pd-1/tem-8雙特異性抗體對pd-1和tem-8同時具有高親和力，一方面可以可與活化t細(xì)胞的pd-1特異性結(jié)合，有效封閉pd-l1蛋白與t細(xì)胞中pd-1受體的結(jié)合，進(jìn)而阻斷pd-1/pd-l通路所造成癌細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制，激活t細(xì)胞殺傷腫瘤活性；另一方面可以靶向tem-8陽性表達(dá)腫瘤，即與特異性表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)皮tem-8特異結(jié)合，抑制腫瘤生長活性和抗腫瘤，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷，使得該雙特異性抗體的殺傷腫瘤效果明顯優(yōu)于pd-1和tem-8單克隆抗體所介導(dǎo)的殺傷腫瘤效果。附圖說明以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：圖1為本發(fā)明所述抗pd-1/tem-8雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本發(fā)明所述抗pd-1/tem-8雙特異性抗體的功能性片段或變體的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為純化人源化pd-1、tem-8胞外結(jié)構(gòu)域的sds-page檢測結(jié)果。圖4為抗pd-1單克隆抗體與抗tem-8單克隆抗體的elisa檢測結(jié)果。圖5分別顯示抗pd-1單克隆3、21、45與77與cd28家族蛋白的結(jié)合。圖6分別顯示抗pd-1單克隆3、21、45與77對pd-l1蛋白與人t細(xì)胞的pd-1結(jié)合的封閉作用。圖7顯示抗tem-8單克隆1、5與69分別與tem-8蛋白的特異性結(jié)合。圖8顯示本發(fā)明的雙特異性抗體的編碼基因的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。圖9顯示編碼本發(fā)明的雙特異抗體的重組質(zhì)粒圖譜。圖10顯示本發(fā)明的pd-1/tem-8雙特異性抗體對pd-1和tem-8的特異結(jié)合。圖11顯示本發(fā)明的pd-1/tem-8雙特異性抗體分別對pd-l1蛋白與人t細(xì)胞的pd-1結(jié)合的封閉作用。圖12顯示本發(fā)明的pd-1/tem-8雙特異性抗體對人t細(xì)胞的體外激活作用。圖13顯示本發(fā)明的pd-1/tem-8雙特異性抗體的體內(nèi)抗腫瘤效果。圖14顯示圖2所示的本發(fā)明所述pd-1/tem-8雙特異性抗體的功能性片段或變體的體內(nèi)抗腫瘤效果。具體實(shí)施方式以下參照具體的實(shí)施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產(chǎn)品。實(shí)施例1pd-1/tem-8雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)本發(fā)明提供了一些可同時特異性結(jié)合pd-1與tem-8胞外結(jié)構(gòu)域的雙特異性抗體的結(jié)構(gòu)模型，此類抗體4種主要實(shí)例的結(jié)構(gòu)如圖1所示，圖1a-c中3種異源二聚體的形成均基于本領(lǐng)域技術(shù)員所熟知的ch3結(jié)構(gòu)域突變技術(shù)(knobandholemutation)(vonkreudensteinetal.，mabs.20135(5):646-54)。其中，(a)抗pd-1特異性抗體的輕鏈(抗pd-1vl-cl)-重鏈(抗pd-1vh-ch1-鉸鏈區(qū)-ch2-ch3)對與抗tem-8特異性抗體的輕鏈(抗pd-1vl-cl)-重鏈(抗pd-1vh-ch1-鉸鏈區(qū)-ch2-ch3)對組成的雙特異性結(jié)合蛋白；(b)抗pd-1特異性抗體的輕鏈-重鏈對與抗tem-8輕鏈可變區(qū)(抗tem-8vl)、重鏈可變區(qū)(抗tem-8vh)、鉸鏈區(qū)和fc片段(抗tem-8ch2-ch3)融合蛋白組成的雙特異性結(jié)合蛋白；(c)抗pd-1輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、鉸鏈區(qū)和fc片段融合蛋白與抗tem-8特異性抗體的輕鏈-重鏈對組成的雙特異性結(jié)合蛋白；(d)抗pd-1特異性抗體的輕鏈與抗pd-1特異性抗體的重鏈，以及抗tem-8輕鏈可變區(qū)(抗tem-8vl)和重鏈可變區(qū)(抗tem-8vh)融合蛋白組成的雙特異性結(jié)合蛋白。pd-1/tem-8雙特異性抗體的變體及功能性片段的實(shí)施例如圖2所示，圖2e-h中的雙特異抗體變體及功能性片段的形成基于本領(lǐng)域技術(shù)員所熟知的融合肽技術(shù)(以多肽鏈或蛋白質(zhì)將不同結(jié)構(gòu)域連接，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)融合表達(dá))，圖2i中異源二聚體的形成基于本領(lǐng)域技術(shù)員所熟知的ch3結(jié)構(gòu)域突變技術(shù)(同圖1a-c)(e)抗pd-1的重鏈可變區(qū)(抗pd-1vh)與抗tem-8重鏈可變區(qū)(抗tem-8vh)的融合蛋白；(f)抗pd-1的單鏈可變片段(scfv)與抗tem-8的scfv組成的融合蛋白；(g)抗pd-1的單鏈可變片段(scfv)與抗tem-8的scfv組成的非免疫球蛋白融合蛋白；(h)抗pd-1輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、鉸鏈區(qū)、fc片段與抗tem-8輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)組成的四價融合蛋白；(i)抗pd-1輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、鉸鏈區(qū)和fc片段融合蛋白與抗tem-8輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)、鉸鏈區(qū)和fc片段融合蛋白組成的雙特異性結(jié)合蛋白(注：圖中特異性識別pd-1與tem-8的功能片段位置可互換)。實(shí)施例2抗pd-1/tem-8雙特異性抗體抗原(人pd-1和tem-8胞外可溶結(jié)構(gòu)域)的制備在uniprot數(shù)據(jù)庫獲得人源pd-1和tem-8胞外結(jié)構(gòu)域的編碼基因序列，通過全基因合成的方式獲得編碼基因pd-1ed-cds和tem-8ed-cds，合成產(chǎn)物在經(jīng)bamhi、ecori(pd-1ed-cds)和bamhi、xbai(tem-8ed-cds)雙酶切后，克隆到pcdna3.1載體，利用293t細(xì)胞(atcc)作為宿主細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)，利用親和層析、離子交換層析等純化技術(shù)對目的蛋白進(jìn)行純化。圖3為人源pd-1與tem-8胞外結(jié)構(gòu)域蛋白純化并進(jìn)行去糖基化處理后的sds-page檢測結(jié)果圖。實(shí)施例3抗人pd-1與tem-8抗體的獲得1.免疫動物將1mg/ml已純化的人pd-1或tem-8胞外結(jié)構(gòu)域蛋白100μl分別與等體積弗氏完全佐劑在室溫下均勻混合后，腹部皮下多點(diǎn)注射到5只6-8周balb/c小鼠體內(nèi)。7天后，將1mg/ml蛋白100μl與等體積弗氏不完全佐劑在室溫下均勻混合后，腹部皮下多點(diǎn)注射到小鼠體內(nèi)。七天后，重復(fù)上述步驟。七天后，重復(fù)上述步驟。第四次注射后三天，斷鼠尾尖取血15μl，室溫靜置2h，以25℃、6000-8000rpm離心10-15min，取上清，通過elisa實(shí)驗(yàn)檢測效價。若效價檢測可用即眼部取全血，室溫靜置2h，以25℃、6000-8000rpm離心10min，取上清，-80℃保存。若效價不可用，繼續(xù)免疫一次。2.細(xì)胞融合無菌取小鼠脾細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液，將1×108個脾細(xì)胞與2-5×107個骨髓瘤(sp2/0-ag14)細(xì)胞融合，以50％peg作融合劑，以hat選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)3-10天后，以ht培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5％co2，37℃。3.陽性克隆篩選利用elisa反應(yīng)篩選單克隆雜交瘤細(xì)胞中可分泌結(jié)合pd-1或tem-8胞外結(jié)構(gòu)域蛋白抗體的克隆，其中結(jié)合pd-1的優(yōu)選克隆4株(克隆3、21、45、77)，結(jié)合tem-8的優(yōu)選克隆3株(克隆1、5、69)，以上克隆分泌抗體的elisa檢測結(jié)果如圖4a和b所示，篩選出的克隆均可特異性識別相應(yīng)的抗原蛋白。實(shí)施例4抗pd-1抗體與其他cd28家族蛋白結(jié)合的鑒定為鑒定篩選出的pd-1抗體的特異性，將cd28家族的成員蛋白pd-1、cd28、ctla-4和icos(r&dsysterm)于酶標(biāo)板中在37℃溫箱中靜置包被2h；4℃封閉過夜；洗滌后加入100μl侯選抗體(1μg/ml)，37℃下孵育1h；洗滌5次后加入稀釋的hrp標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體(abcam)，室溫孵育1h；洗滌5次后加入opd底物溶液100μl/孔，顯色5min后加入50μl/孔的2mh2so4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定490nm下各孔的吸光值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5，候選克隆分泌的抗體不結(jié)合除pd-1外的cd28家族成員蛋白。實(shí)施例5抗pd-1抗體對人t細(xì)胞的pd-1受體與pd-l1結(jié)合的封閉實(shí)驗(yàn)1.人外周血t細(xì)胞的分離抽取健康志愿者外周血10ml，向管中加入等體積pbs，輕輕吹打成細(xì)胞懸液20ml，以吸管將細(xì)胞懸液緩慢加于20mllts1077淋巴細(xì)胞分層液的頂層，以2000轉(zhuǎn)/分離心20min，吸去最上層的血漿，并吸取血漿層下的單核細(xì)胞置入離心管中，以pbs洗滌3次，獲得人外周血單核細(xì)胞pbmc。分離得到的pbmc以pbs緩沖液制成懸液，加入100μl/mlcd3抗體(invitrogen)，輕吹混勻，室溫孵育15min；加入5μl/ml免疫磁珠(invitrogen)，4℃下孵育60min，每10分鐘震蕩一次；以pbs沖洗并稀釋，將細(xì)胞懸液注入填有不銹鋼毛的特制試管中，放入分離器進(jìn)行分離純化，強(qiáng)磁場下t細(xì)胞不能通過分離器，得以純化，圖6a為分離出的t細(xì)胞純度的鑒定結(jié)果。2.人pd-l1胞外結(jié)構(gòu)域與綠色熒光蛋白融合蛋白的制備在uniprot數(shù)據(jù)庫獲得人pd-l1胞外結(jié)構(gòu)域的編碼基因序列，通過全基因合成的方式獲得編碼基因，合成產(chǎn)物在經(jīng)ecori、xhoi雙酶切后，克隆到pegfp-n1載體中，利用293t細(xì)胞(atcc)作為宿主細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)，利用親和層析、離子交換層析等純化技術(shù)對目的蛋白進(jìn)行純化，獲得綠色熒光蛋白融合表達(dá)的人源pd-l1胞外結(jié)構(gòu)域蛋白rh-pd-l1-gfp，圖6b為融合蛋白的表達(dá)與純化并進(jìn)行去糖基化處理后的sds-page結(jié)果。3.抗pd-1抗體對人t細(xì)胞的pd-1受體與pd-l1結(jié)合的封閉實(shí)驗(yàn)將優(yōu)選4株克隆產(chǎn)生的抗體(1μg/ml)與rh-pd-l1-gfp(1μg/ml)在室溫下輕柔混合30min，然后將混合蛋白溶液加入分離純化出的人外周血t細(xì)胞，室溫孵育15分鐘后以pbs清洗3次，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。圖6c-g顯示克隆3、21和77可阻礙pd-l1與人t細(xì)胞上的pd-1受體的結(jié)合，而克隆45的阻斷效果較差。實(shí)施例6抗tem-8抗體與efgr、her2和vegfr的結(jié)合的鑒定將tem-8、efgr、her2和vegfr(r&dsysterm)于酶標(biāo)板中在37℃溫箱中靜置包被2h；4℃封閉過夜；洗滌后加入100μl侯選抗體(1μg/ml)，37℃下孵育1h；洗滌5次后加入稀釋的hrp標(biāo)記山羊抗小鼠抗體(abcam)，室溫孵育1h；洗滌5次后加入opd底物溶液100μl/孔，顯色5min后加入50μl/孔的2mh2so4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定490nm下各孔的吸光值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，候選克隆分泌的抗體不結(jié)合efgr、her2和vegfr蛋白。實(shí)施例7抗pd-1和tem-8候選抗體的可變區(qū)序列的獲得分別擴(kuò)大培養(yǎng)抗pd-1克隆3、21、77和抗tem-8克隆1、5、69，培養(yǎng)至細(xì)胞量為109個，離心收集細(xì)胞，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，以預(yù)冷的pbs緩沖液(6-8ml)輕輕洗滌細(xì)胞兩次；以trizol試劑盒(takara)提取總rna，以紫外分光光度計(jì)檢測rna的純度與濃度；以總rna為模板，逆轉(zhuǎn)錄獲得cdna，逆轉(zhuǎn)錄體系為20μl，其中5×逆轉(zhuǎn)錄buffer(4μl)，dntp(1μl)，mgcl2(2.4μl)，pd(n6)隨機(jī)引物(1.5μl)，rna模板(2μg)，逆轉(zhuǎn)錄酶(1μl)，depc水(至20μl)。以cdna為模板，擴(kuò)增雜交瘤中可變區(qū)的dna序列，擴(kuò)增引物序列與抗體可變區(qū)第一框架區(qū)和恒定區(qū)互補(bǔ)(orlandir,etal.,cloningimmunoglobulinvariabledomainsforexpressionbypolymerasechainreaction.proc.natl.acad.sci.usa,1989,86：3833)，擴(kuò)增體系為50μl，其中5×pcrbuffer(10μl)，dntp(4μl)，引物(2μl)，cdna模板(1μl)，pcr酶(0.5μl)，pcr水(至50μl)。擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pmd19載體中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選后進(jìn)行重組子測序，獲得抗pd-1克隆3、21、77的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別為seqidno:1和3，5和7，9和11；編碼相應(yīng)氨基酸的核苷酸序列分別為seqidno:2和4，6和8，10和12。獲得抗tem-8克隆1、5、69的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別為seqidno:13和15，17和19，21和23；編碼相應(yīng)氨基酸的核苷酸序列分別為seqidno:14和16，18和20，22和24。實(shí)施例8抗pd-1與tem-8抗體的人源化改造根據(jù)獲得的抗pd-1與tem-8抗體的可變區(qū)氨基酸序列(實(shí)施例7獲得的序列)利用imgt/v-quest在線服務(wù)器分析抗體亞型，綜合kabat、chothia及imgt三種抗體的cdr區(qū)的numbering方案確定抗體輕鏈與重鏈的六個cdr區(qū)序列；利用ds軟件進(jìn)行小鼠親本抗體fab及其嵌合人源化抗體fab的空間結(jié)構(gòu)，獲得嵌合抗體的分子模型后，對親本fab和嵌合抗體fab初始模型采用分子動力學(xué)模擬進(jìn)行全面的優(yōu)化，提取穩(wěn)定的平均構(gòu)象；利用表位掃描檢驗(yàn)設(shè)計(jì)的人源化抗體可能存在的線性表位與構(gòu)象表位，確定必須保留的框架區(qū)氨基酸位點(diǎn)后，設(shè)計(jì)不同的氨基酸突變位點(diǎn)獲得人源化抗體。在此基礎(chǔ)上，我們得到了多個人源化抗體，其中評分最高的抗pd-1和抗tem-8抗體序列分別為克隆81和克隆76，克隆81的重鏈和輕鏈氨基酸序列分別為seqidno:25和27，編碼相應(yīng)氨基酸的核苷酸序列分別為seqidno:26和28；克隆76的重鏈和輕鏈氨基酸序列分別為seqidno:29和31，編碼相應(yīng)氨基酸的核苷酸序列分別為seqidno:30和32。實(shí)施例9抗pd-1/tem-8雙特異性抗體表達(dá)載體的構(gòu)建本發(fā)明的抗pd-1/tem-8雙特異性抗體中抗pd-1(克隆81，制備方法見實(shí)施例8)的可變區(qū)編碼核苷酸為pd-1-vh和pd-1-vl，抗tem-8(克隆76，制備方法見實(shí)施例8)的可變區(qū)編碼核苷酸為tem-8-vh和tem-8-vl，igg1重鏈恒定區(qū)ch1、鉸鏈區(qū)、fc和fc-knob和fc-hole編碼核苷酸，以及輕鏈恒定區(qū)cl的kappa鏈編碼核苷酸，以及鏈接scfv的多肽(ggggs)3編碼基因得自于lifetechnologiesinc.(carlsbad，ca)。圖1中所示4種結(jié)構(gòu)的雙特異性抗體中的各個不同鏈，vl和cl、vh和ch1、ch1和fc(fc-knob、fc-hole)、scfv和fc(fc-knob、fc-hole)、fc和scfv通過重疊pcr的方式獲得。pcdna3.1和pires作為表達(dá)載體以制備雙特異性抗體，根據(jù)載體多克隆位點(diǎn)及編碼基因序列設(shè)計(jì)引物(見表1)。表1pcr引物序列pd-1-vh、pd-1-vl、tem-8-vh、tem-8-vl、ch1、鉸鏈區(qū)(hinge)、fc、fc-knob、fc-hole和cl的擴(kuò)增體系為50μl，其中5×pcrbuffer(10μl)，dntp(4μl)，引物(2μl)，cdna模板(1μl)，pcr酶(0.5μl)，pcr水(至50μl)。擴(kuò)增條件為：98℃孵育3分鐘，然后25個循環(huán)：98℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分鐘；以72℃閉合延伸10分鐘。圖8a為pcr產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果圖。使用重疊pcr將pd-1-vl和cl；pd-1-vh、ch1、鉸鏈區(qū)(hinge)和fc-knob/fc-hole；tem-8-vl和cl；tem-8-vh、ch1、鉸鏈區(qū)和fc-hole/fc-knob；pd-1scfv(pd-1-vl、(ggggs)3、pd-1-vh)、鉸鏈區(qū)(hinge)和fc-knob/fc-hole；tem-8scfv(tem-8-vl、(ggggs)3、tem-8-vh)、鉸鏈區(qū)和fc-hole/fc-knob；pd-1-vh、ch1、鉸鏈區(qū)(hinge)、fc和tem-8scfv鏈接成圖1所示的各抗體鏈的編碼基因，pcr體系50μl，其中5×pcrbuffer(10μl)，dntp(4μl)，引物(2μl)，cdna模板(pcr產(chǎn)物各1μl)，pcr酶(0.5μl)，pcr水(至50μl)擴(kuò)增條件為：98℃孵育3分鐘，然后30個循環(huán)：98℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸1分鐘；以72℃閉合延伸10分鐘。圖8b為pcr產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果圖。各個鏈編碼序列為seqidno:34、36、38、40、42、44、46。將目的片段酶切后構(gòu)建至表達(dá)載體pcdna3.1，圖1所示的4種雙特異抗體的重組質(zhì)粒圖譜見圖9a-g，其中圖9a重組質(zhì)粒pcdna3.1-pd-1-lc為編碼pd-1-vl和cl(抗pd-1輕鏈)圖譜；圖9b重組質(zhì)粒pcdna3.1-tem-8-lc為編碼tem-8-vl和cl(抗tem-8輕鏈)圖譜；圖9c重組質(zhì)粒pcdna3.1-pd-1-hc為編碼pd-1-vh、ch1、鉸鏈區(qū)(hinge)和fc-knob/fc-hole(抗pd-1重鏈)圖譜；圖9d重組質(zhì)粒pcdna3.1-tem-8-hc為編碼tem-8-vh、ch1、鉸鏈區(qū)(hinge)和fc-knob/fc-hole(抗tem-8重鏈)圖譜；圖9e重組質(zhì)粒pcdna3.1-pd-1scfv-fc為編碼pd-1scfv和fc-knob/fc-hole圖譜；圖9f重組質(zhì)粒pcdna3.1-tem-8scfv-fc為編碼tem-8scfv和fc-knob/fc-hole圖譜；圖9g重組質(zhì)粒pcdna3.1-pd-1-hc-tem-8scfv為編碼pd-1-vh、ch1、鉸鏈區(qū)(hinge)、fc和tem-8scfv圖譜。實(shí)施例10pd-1/tem-8雙特異性抗體的制備1.利用293f宿主細(xì)胞表達(dá)雙特異性抗體在轉(zhuǎn)染之前24小時，將1×106個的293f細(xì)胞接種于燒瓶中的293freestyle培養(yǎng)基中，37℃、8％co2、130rpm條件下培養(yǎng)。將100μl293fectin加至1ml的optimem中，攪拌條件下，室溫下孵育5分鐘。同時，將重組質(zhì)粒按表2所示組合，溶解于1mloptimem中，dna總量為30μg。將上述dna與293fectin完全混合，并且總體積為2ml，在室溫孵育20分鐘。然后將該混合物加入至細(xì)胞培養(yǎng)物中。在37℃下培養(yǎng)細(xì)胞，且培養(yǎng)箱中有5％co2，以130rpm培養(yǎng)5天。表2轉(zhuǎn)染體系各載體組分抗體編號載體組合圖1apd-1-lc：pd-1-hc：tem-8-hc：tem-8-lc＝1:2:2:1圖1bpd-1-lc：pd-1-hc：tem-8-scfv-fc＝1:2:3圖1cpd-1-scfv-fc：tem-8-vh：tem-8-vl＝3:2:1圖1dpd-1-lcd：pd-1-hc-tem-8-scfv＝1:32.抗體純化將細(xì)胞培養(yǎng)基于2000×g離心，收集上清并用0.22μm過濾器過濾。將收集的液體用10倍(以體積算)結(jié)合緩沖液(9.5mmnah2po4+40.5mmna2hpo4，ph7.0)稀釋，然后通過sepharosefastflowproteina親和色譜柱(購自ge公司，5ml體積)、fabaffinitykbpagarose親和填料(購自acrobiosystems公司，5ml體積)，和sp陽離子交換色譜柱(購自ge公司，10ml)進(jìn)行純化，依使用手冊操作。實(shí)施例11pd-1/tem-8雙特異性抗體特異性結(jié)合的鑒定將pd-1、ctla-4、tem-8和vegfr(r&dsysterm)于酶標(biāo)板中在37℃溫箱中靜置包被2h；4℃封閉過夜；洗滌后加入純化后4種抗體(序列參見實(shí)施例8，結(jié)構(gòu)參見圖1a-d)(100μg/ml)的梯度稀釋液(pbs連續(xù)稀釋(1：102，1：103，1：104，1：105，1：106，1：107，1：108，1：109)，100μl/孔，37℃下孵育1h；洗滌5次后加入稀釋的hrp標(biāo)記山羊抗小鼠抗體(abcam)，室溫孵育1h；洗滌5次后加入opd底物溶液100μl/孔，顯色5min后加入50μl/孔的2mh2so4終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀測定490nm下各孔的吸光值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示，4種雙特異性抗體可同時特異性識別pd-1和tem-8。實(shí)施例12抗pd-1/tem-8雙特異性抗體對人t細(xì)胞的pd-1受體與pd-l1結(jié)合的封閉實(shí)驗(yàn)將4種雙特異性抗體(序列參見實(shí)施例8，結(jié)構(gòu)參見圖1a-d)(1μg/ml)與rh-pd-l1-gfp(1μg/ml)在室溫下輕柔混合30min，然后將混合蛋白溶液加入分離純化出的人外周血t細(xì)胞，室溫孵育15分鐘后以pbs清洗3次，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。如圖11所示，4種雙特異性抗體均可阻礙pd-l1與人t細(xì)胞上的pd-1受體的結(jié)合。實(shí)施例13pd-1/tem-8雙特異性抗體體外激活t細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)將新鮮制備人外周血的pbmc鋪板至96孔平底板中，孵育過夜后，加入10ug/ml的抗體及100ng/ml的破傷風(fēng)毒素(tt)，培養(yǎng)3天后收集上清液，用lifetechnology公司的luminex儀與emd公司的cd8+細(xì)胞因子檢測試劑盒檢測雙特異抗體及對照組的il2分泌水平(結(jié)果見圖12)。結(jié)果顯示，所述人源化抗體均可刺激t細(xì)胞的功能，圖1所示的4種形式的pd-1/tem-8雙特異性抗體(序列參見實(shí)施例8)均可有效激活t細(xì)胞功能，其中圖1d形式的雙特異抗體激活效果相對較好，對照組與4種形式的pd-1/tem-8雙特異性抗體導(dǎo)致的il-2分泌量的增率分別為115.2％，291.5％，278.2％，322.2％和341.7％。表3激活t細(xì)胞功能的試驗(yàn)注：與對照組比較**p<0.01。實(shí)施例14抗pd-1/tem-8雙特異抗體的體內(nèi)腫瘤殺傷實(shí)驗(yàn)1.異植瘤模型建立將處于對數(shù)生長期的ct-26細(xì)胞重懸于無血清的rpmi1640培養(yǎng)液，使得細(xì)胞濃度為1×107個細(xì)胞/ml。將細(xì)胞注射于小鼠的左肩背部，每只200μl，記為實(shí)驗(yàn)0天。每兩天測一次荷瘤的最長直徑和最短直徑，荷瘤的體積用公式：體積(mm3)＝長×寬2/2。實(shí)驗(yàn)第30天，腫瘤的體積達(dá)到了500mm3，處死小鼠，分離腫瘤。2.抗pd-1/tem-8雙特異性抗體殺傷腫瘤實(shí)驗(yàn)將種植瘤小鼠分為4組，每組4只，以純化的pd-1/tem-8雙特異性抗體(序列參見實(shí)施例8，由圖1d所示的)尾靜脈注射至成瘤小鼠體內(nèi)，用量分別為a組：0mg/kg，b組：5mg/kg，c組：50mg/kg和d組：100mg/kg。每隔一周注射1次，連續(xù)注射4次，記錄小鼠體內(nèi)腫瘤大小變化。pd-1/tem-8雙特異性抗體不僅抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的生長，同時還具有縮小腫瘤的作用，以50mg/kg和500mg/kg劑量注射6周后，腫瘤體積分別縮小至初始體積的54.7％和41.7％(見圖13a)。表4雙抗對腫瘤的抑制作用結(jié)果組別腫瘤大小腫瘤體積增率對照組1120±54mg1178.9％5mg/kg組389±40mg**413.8％50mg/kg組52±20mg**54.7％500mg/kg組40±22mg**41.7％注：與對照組比較**p<0.01。3.pd-1單克隆抗體、tem-8單克隆抗體與抗pd-1/tem-8雙特異性抗體腫瘤殺傷效率比較實(shí)驗(yàn)將種植瘤小鼠分為4組，每組4只，以純化的pd-1單克隆抗體(實(shí)施例8制備的克隆81)、tem-8單克隆抗體(實(shí)施例8制備的克隆76)與抗pd-1/tem-8雙特異性抗體(序列參見實(shí)施例8，圖1d所示的雙抗)尾靜脈注射至成瘤小鼠體內(nèi)，用量分別為a組：pbs，b組：50mg/kgpd-1單抗(克隆81)，c組：50mg/kgtem-8單抗(克隆76)和d組：50mg/kg抗pd-1/tem-8雙特異性抗體(圖1d所示的雙抗)。每隔一周注射1次，連續(xù)注射4次，記錄小鼠體內(nèi)腫瘤大小變化。抗pd-1/tem-8雙特異性抗體縮小腫瘤的作用明顯優(yōu)于pd-1單抗和tem-8單抗，在pd-1單抗、tem-8單抗和抗pd-1/tem-8雙抗的作用下，腫瘤體積分別縮小至初始體積的64.9％，81.8％和51.1％(見圖13b，p＜0.01)。表5不同抗體對腫瘤的抑制作用結(jié)果組別腫瘤大小腫瘤體積增率對照組1239±49mg1264.3％pd-1單抗組61±22mg**64.9％tem-8單抗組81±25mg**81.8％抗pd-1/tem-8雙抗組48±20mg**#&51.1％注：與對照組比較**p<0.01。與pd-1單抗組比較#p<0.05。與tem-8單抗組比較&p<0.05。實(shí)施例15抗pd-1/tem-8雙特異抗體的變體(圖2所示5種變體)體內(nèi)腫瘤殺傷實(shí)驗(yàn)將種植瘤小鼠分為6組，每組4只，以純化的5種抗pd-1/tem-8雙特異抗體的變體(圖2e-i所示的雙抗變體，序列參見克隆81和克隆76，制備方法見實(shí)施例8)尾靜脈注射至成瘤小鼠體內(nèi)，用量分別為a組：pbs，b組：50mg/kg變體1(圖2e)，c組：50mg/kg變體2(圖2f)，d組：50mg/kg變體3(圖2g)，e組：50mg/kg變體4(圖2h)，和f組：50mg/kg變體5(圖2i)。每隔一周注射1次，連續(xù)注射4次，記錄小鼠體內(nèi)腫瘤大小變化。5種抗pd-1/tem-8雙特異性抗體的變體同樣具備抑制腫瘤生長的功效，在變體1-5的作用下，腫瘤體積分別發(fā)展至初始體積的100.5％，71.1％，72.1％，69.6％，64.2％和65.5％(見圖14，p＜0.01)。表6不同抗體的變體對腫瘤的抑制作用結(jié)果注：與對照組比較**p<0.01。<110>順昊細(xì)胞生物技術(shù)（天津）股份有限公司<120>抗pd-1和tem-8雙特異性抗體及其應(yīng)用<130>shunhobimab-pd-1xtem-8<160>46<170>patentinversion3.3<210>1<211>120<212>prt<213>人工序列<220><223>克隆3重鏈的氨基酸序列<400>1glnglyglnleuvalglnserglyglygluvallyslysproglyala151015serleuargleuaspcyslysalaserglytyrthrphethrasntyr202530tyrmethistrpvalargglnalaproglyglnglyleuglutrpmet354045glyglyiletrptyraspglyserlysargtyrtyrasnglulysphe505560lysasnargvalthrilethralaasplysserthrserthralatyr65707580metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargargasptyrphepheasptrptyrpheasptyrtrpglygln100105110glythrthrvalthrvalserser115120<210>2<211>360<212>dna<213>人工序列<220><223>克隆3重鏈可變區(qū)的核苷酸序列<400>2cagggccagctggtgcagagcggcggcgaggtgaagaagcccggcgccagcctgaggctg60gactgcaaggccagcggctacaccttcaccaactactacatgcactgggtgaggcaggcc120cccggccagggcctggagtggatgggcggcatctggtacgacggcagcaagaggtactac180aacgagaagttcaagaacagggtgaccatcaccgccgacaagagcaccagcaccgcctac240atggagctgagcagcctgaggagcgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggagggac300tacttcttcgactggtacttcgactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagc360<210>3<211>111<212>prt<213>人工序列<220><223>克隆3輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列<400>3gluilevalleuthrglnserproalathrleuserleuserprogly151015gluargalaserilesercysargalaserglnservalserthrser202530glytyrsertyrleualatrptyrglnglnlysproglyglnalapro354045argleuleuiletyraspalasertyrleugluserglyileproala505560argpheserglyserglyserglythraspphethrleulysileser65707580serleugluprogluaspvalglyvaltyrtyrcysglnhisserser859095asntrpproleuthrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105110<210>4<211>333<212>dna<213>人工序列<220><223>克隆3輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列<400>4gagatcgtgctgacccagagccccgccaccctgagcctgagccccggcgagagggccagc60atcagctgcagggccagccagagcgtgagcaccagcggctacagctacctggcctggtac120cagcagaagcccggccaggcccccaggctgctgatctacgacgccagctacctggagagc180ggcatccccgccaggttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaagatcagc240agcctggagcccgaggacgtgggcgtgtactactgccagcacagcagcaactggcccctg300accttcggccagggcaccaagctggagatcaag333<210>5<211>114<212>prt<213>人工序列<220><223>克隆21重鏈可變區(qū)的氨基酸序列<400>5glnvalglnleuvalgluserglyalagluvalvalglnproglyarg151015serleuargleuaspcyslysalaserglytyrilethrpheserasp202530tyrtyrmettyrtrpvalargglnalaproglyhisglyleuglutrp354045ileglytyrileasnproserasnglyglythrasnpheasnglulys505560phelysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleu65707580pheleuglnmetasnserleuglnpheaspaspthralavaltyrtyr859095cysalathrasnaspasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrval100105110serser<210>6<211>342<212>dna<213>人工序列<220><223>克隆21重鏈可變區(qū)的核苷酸序列<400>6caggtgcagctggtggagagcggcgccgaggtggtgcagcccggcaggagcctgaggctg60gactgcaaggccagcggctacatcaccttcagcgactactacatgtactgggtgaggcag120gcccccggccacggcctggagtggatcggctacatcaaccccagcaacggcggcaccaac180ttcaacgagaagttcaagggcaggttcaccatcagcagggacaacagcaagaacaccctg240ttcctgcagatgaacagcctgcagttcgacgacaccgccgtgtactactgcgccaccaac300gacgactactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagc342<210>7<211>107<212>prt<213>人工序列<220><223>克隆21輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列<400>7aspilevalmetthrglnserproalathrleuserleuserprogly151015gluargalaserilesercysargalaserlysglyvalsersertyr202530leuhistrptyrglnglnlysproglyglnserproargleuleuile354045tyrleualasertyrleugluserglyvalproaspargphesergly505560serglyserglythraspphethrleulysileserargvalgluala65707580gluaspphealavaltyrtyrcysglnglnserargaspleuprotyr859095thrpheglyglnglythrlysleugluilelys100105<210>8<211>321<212>dna<213>人工序列<220><223>克隆21輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列<400>8gacatcgtgatgacccagagccccgccaccctgagcctgagccccggcgagagggccagc60atcagctgcagggccagcaagggcgtgagcagctacctgcactggtaccagcagaagccc120ggccagagccccaggctgctgatctacctggccagctacctggagagcggcgtgcccgac180aggttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaagatcagcagggtggaggcc240gaggacttcgccgtgtactactgccagcagagcagggacctgccctacaccttcggccag300ggcaccaagctggagatcaag321<210>9<211>115<212>prt<213>人工序列<220><223>克隆77重鏈可變區(qū)的氨基酸序列<400>9glnglyglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala151015thrcysthrvalthrglytyrserilethrserasptyrsertrpasn202530trpileargglnalaproilehisglyleuglutrpileglytyrile354045asntyralaglyserthrsertyrasnproserleuglualavalthr505560ilethralaasplysserthrserthralatyrmetgluleuserser65707580leuargsergluaspthralavaltyrtyrcysalaargtrpphegly859095serthralatrptyrileaspvaltrpglyglnglythrthrvalthr100105110valserser115<210>10<211>345<212>dna<213>人工序列<220><223>克隆77重鏈可變區(qū)的核苷酸序列<400>10cagggccagctggtg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