本發(fā)明涉及干細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，特別涉及一種猴胚胎干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem cell,ESC)是從早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner Cell Mass,ICM)或原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells,PGCs)分離出的、能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的細(xì)胞，其可分化為3個(gè)胚層來源的各種組織和細(xì)胞類型的永久細(xì)胞系。目前普遍認(rèn)為，胚胎干細(xì)胞對體外研究動(dòng)物和人的胚胎發(fā)生發(fā)育、新基因發(fā)現(xiàn)、藥物篩選等領(lǐng)域?qū)a(chǎn)生重要的影響。

盡管人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell,hESC)在再生醫(yī)學(xué)、藥物篩選和發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值，但人胚胎干細(xì)胞及初胚的使用主要涉及到道德倫理問題。至今很多國家已制訂法律或者法規(guī)明令禁止克隆人的研究，使用人胚胎干細(xì)胞株前仍需要經(jīng)過嚴(yán)格的審查批準(zhǔn)，很多實(shí)驗(yàn)無法真正在人體內(nèi)開展，如四倍體嵌合等體內(nèi)發(fā)育方面的實(shí)驗(yàn)，這就需要在非人靈長類動(dòng)物模型體內(nèi)首先進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。非人靈長類是和人類親緣性最近的模式動(dòng)物，可以很好地模擬人體內(nèi)情況，胚胎干細(xì)胞在進(jìn)行臨床應(yīng)用之前，在非人靈長類動(dòng)物模型體內(nèi)的臨床前研究是必不可少的。即開展非人靈長類動(dòng)物胚胎干細(xì)胞研究具有重要的理論意義和比較醫(yī)學(xué)價(jià)值。

建立一個(gè)理想的非人靈長類胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)體系是利用它的前提。非人靈長類胚胎干細(xì)胞來源主要是獼猴、食蟹猴、恒河猴、絨猴等。猴的胚胎干細(xì)胞(monkey embryonic stem cells,mESC)形態(tài)類似人胚胎干細(xì)胞形態(tài)，成單層扁平克隆樣生長，胚胎干細(xì)胞個(gè)小，核質(zhì)比大，排列致密，邊界光滑，和周圍飼養(yǎng)層細(xì)胞分界明顯。目前猴胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)方式主要借鑒于人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)方式，培養(yǎng)基也和人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基一致，但和人胚胎干細(xì)胞相比，猴胚胎干細(xì)胞更容易分化。這可能和猴胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)體系尚不成熟有關(guān)，尤其是在無飼養(yǎng)層體系培養(yǎng)中。目前市場上無血清培養(yǎng)基主要是針對人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)，還沒有一種商品化培養(yǎng)基能較長時(shí)間內(nèi)維持猴胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)和全能性。

公開于該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應(yīng)當(dāng)被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決猴胚胎干細(xì)胞難培養(yǎng)的問題，本發(fā)明的目的是提供一種猴胚胎干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基能在較長時(shí)間內(nèi)維持猴胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)和全能性，其既適合在無飼養(yǎng)層體系中培養(yǎng)猴胚胎干細(xì)胞，也適合在飼養(yǎng)層體系中培養(yǎng)猴胚胎干細(xì)胞。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

一種猴胚胎干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和溶解在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加物，其中：所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括DMEM-F12培養(yǎng)基，所述添加物包括的組分及各組分在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度如下：

上述猴胚胎干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基在另一種實(shí)施方式中，所述添加物包括的組分及各組分在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度如下：

上述猴胚胎干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基在另一種實(shí)施方式中，所述猴胚胎干細(xì)胞可選的為獼猴胚胎干細(xì)胞、食蟹猴胚胎干細(xì)胞、恒河猴胚胎干細(xì)胞或絨猴胚胎干細(xì)胞。

上述猴胚胎干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基在另一種實(shí)施方式中，所述非必需氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、酪氨酸中的一種或多種。

上述猴胚胎干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基在另一種實(shí)施方式中，所述添加物還包括丙酮酸鈉和血小板衍生因子-BB(即PDGF-BB)，其中：所述丙酮酸鈉在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為1-5mM，所述血小板衍生因子-BB在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為1-10ng/ml。

上述猴胚胎干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基在另一種實(shí)施方式中，所述丙酮酸鈉在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為1mM，所述血小板衍生因子-BB在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度為10ng/ml。

上述猴胚胎干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基在另一種實(shí)施方式中，所含各種蛋白質(zhì)和各種生長因子皆來自人源。

本發(fā)明還提供了上述無血清培養(yǎng)基在猴胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1、使用本發(fā)明無血清培養(yǎng)基在體外培養(yǎng)猴胚胎干細(xì)胞，不僅可以維持猴胚胎干細(xì)胞的自我更新，并且能在較長時(shí)間內(nèi)維持猴胚胎干細(xì)胞的未分化狀態(tài)和全能性。

2、本發(fā)明無血清培養(yǎng)基不僅適合在無飼養(yǎng)層體系培養(yǎng)猴胚胎干細(xì)胞，也適合在飼養(yǎng)層體系培養(yǎng)，從而有利于飼養(yǎng)層體系向無飼養(yǎng)層體系轉(zhuǎn)變。

3、本發(fā)明無血清培養(yǎng)基排除了動(dòng)物來源的病原體污染的可能性，并且成分確定，因此可以保證在體外培養(yǎng)的猴胚胎干細(xì)胞的安全性，所獲得的干細(xì)胞可用于干細(xì)胞臨床治療研究中。

附圖說明

圖1為實(shí)施例2在飼養(yǎng)層體系培養(yǎng)獲得的獼猴胚胎干細(xì)胞形態(tài)圖。

圖2為實(shí)施例3在無飼養(yǎng)層體系培養(yǎng)獲得的獼猴胚胎干細(xì)胞形態(tài)圖。

圖3為實(shí)施例4中連續(xù)培養(yǎng)獼猴胚胎干細(xì)胞15代后核型分析結(jié)果。

圖4為實(shí)施例5中連續(xù)培養(yǎng)獼猴胚胎干細(xì)胞15代后EB球形成。

圖5為實(shí)施例6中連續(xù)培養(yǎng)獼猴胚胎干細(xì)胞15代后注入小鼠，獲取臍胎瘤切片，進(jìn)行HE染色的圖片。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受具體實(shí)施方式的限制。

實(shí)施例1、培養(yǎng)基的配制

本實(shí)施例提供了一種猴胚胎干細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，其以DMEM-F12為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加以下添加物組分，各添加物組分在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的濃度也如下所示：

其中非必需氨基酸由等濃度的丙氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸和酪氨酸組成。

本實(shí)施例中使用的細(xì)胞培養(yǎng)試劑和細(xì)胞因子廠家和貨號(hào)見下表：

上述配好的完全培養(yǎng)基用0.22μm的濾器過濾除菌，-20℃避光保存。

上述培養(yǎng)基各參數(shù)如下：

pH:7.4

滲透壓:340mosm

細(xì)菌、真菌檢測:陰性

衣原體、支原體檢測:陰性

內(nèi)毒素:<0.5EU/mL

實(shí)施例2、獼猴胚胎干細(xì)胞系在飼養(yǎng)層體系中的培養(yǎng)

1、試驗(yàn)材料：獼猴胚胎干細(xì)胞系。

2、試驗(yàn)方法：將試驗(yàn)材料分為試驗(yàn)組和對照組，其中：

試驗(yàn)組：將P25代獼猴胚胎干細(xì)胞按5×10⁴/well的密度種植到預(yù)先鋪好飼養(yǎng)層細(xì)胞的6孔板中，所述飼養(yǎng)層細(xì)胞是小鼠胚胎成纖維細(xì)胞經(jīng)10μg/ml絲裂酶素-C處理2-2.5小時(shí)后所得的單層細(xì)胞，并向6孔板的孔中加入實(shí)施例1所得的猴胚胎干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，每天更換一次培養(yǎng)基，大約5天繼代培養(yǎng)一次。繼代培養(yǎng)時(shí)采用Collagenase IV消化3min，用無菌玻璃吸管將獼猴胚胎干細(xì)胞集落切割成大小合適、均勻的小塊，然后按1:5的比例繼代培養(yǎng)。

對照組：方法同試驗(yàn)組，將試驗(yàn)組中所使用的猴胚胎干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基換成培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞(hES/iPS)的無血清培養(yǎng)基(廠家：賽貝生物貨號(hào)：CA1001500)。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：如圖1所示，圖1表明使用本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)的獼猴胚胎干細(xì)胞的核質(zhì)比大，排列致密，邊界光滑，和周圍飼養(yǎng)層細(xì)胞分界明顯，并且能穩(wěn)定傳代下去。用對照組培養(yǎng)基培養(yǎng)的獼猴胚胎干細(xì)胞排列疏散，細(xì)胞邊界不易分清，隨著傳代次數(shù)增加細(xì)胞嚴(yán)重分化。

實(shí)施例3、獼猴胚胎干細(xì)胞系在無飼養(yǎng)層體系中的培養(yǎng)

1、試驗(yàn)材料：獼猴胚胎干細(xì)胞系。

2、試驗(yàn)方法：將試驗(yàn)材料分為試驗(yàn)組和對照組，其中：

試驗(yàn)組：將P25代獼猴胚胎干細(xì)胞按5×10⁴/well的密度種植到預(yù)先用Matrigel包被過夜的6孔板中，并加入實(shí)施例1所得的猴胚胎干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，每天更換一次培養(yǎng)基，大約5天繼代培養(yǎng)一次。繼代培養(yǎng)采用EDTA消化3min，用1mL槍輕輕吹打獼猴胚胎干細(xì)胞系克隆為均勻的小塊，然后按1:5的比例繼代培養(yǎng)。

對照組：方法同試驗(yàn)組，將試驗(yàn)組中所使用的猴胚胎干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基換成培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞(ES/iPS)的無血清培養(yǎng)基(廠家：賽貝生物貨號(hào)：CA1001500)。

3、試驗(yàn)結(jié)果：如圖2所示，圖2表明使用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增的猴胚胎干細(xì)胞呈克隆集落樣生長，與對照組相比，試驗(yàn)組所獲得的猴胚胎干細(xì)胞的形態(tài)更加均一，排列致密，細(xì)胞生長更加旺盛，隨著傳代次數(shù)增加能較好的維持mESC的未分化狀態(tài)。

實(shí)施例4：獼猴胚胎干細(xì)胞的核型檢測

(1)按照實(shí)施例3中的方法將P25代獼猴胚胎干細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)到P40代時(shí)，在mES細(xì)胞培養(yǎng)液中加入20μg/mL秋水仙素至其終濃度為0.1μg/mL，處理2～4h。

(2)將細(xì)胞消化轉(zhuǎn)移至15mL離心管，1000r/min離心10min，棄上清。細(xì)胞沉淀中加入事先預(yù)熱至37℃的0.56％KCl低滲液4mL，用滴管吹打成單細(xì)胞懸液，37℃低滲處理15～20min。

(3)加入1mL預(yù)冷的固定液，輕輕吹勻后1000r/min離心10min。棄上清，再加4mL新鮮預(yù)冷的固定液，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，放入4℃冰箱固定30min以上。1000r/min離心10min。

(4)重復(fù)第(3)步兩次。棄上清，加入少量固定液(0.2～0.6mL)重懸細(xì)胞。

(5)取一潔凈載片，用滴管吸取細(xì)胞懸液于載片垂直上方50cm以上處滴片，將載片傾斜放置，自然晾干(1h以上)。

(6)用Giemsa染液對載片在室溫下染色1h后，用自來水沖洗、自然晾干。

(7)顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖3所示：圖3表明獼猴胚胎干細(xì)胞在本發(fā)明的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)15代后仍保持正常的核型,其染色體數(shù)目與正常獼猴的一樣，均為42條。

實(shí)施例5：擬胚體(Embryroid body，EB)的形成

EB的形成實(shí)驗(yàn)是用來檢測多能性細(xì)胞的分化能力。按照實(shí)施例3中的方法將P25代獼猴胚胎干細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)到P40代時(shí)，用Collagenase IV把6孔板的mESC克隆消化成小塊(比傳代的塊稍大)，1000r/min，3min離心后棄上清后種到一個(gè)T25培養(yǎng)瓶，T25培養(yǎng)瓶加5-6mL不加bFGF的培養(yǎng)液(該培養(yǎng)液的組成為：DMEM-F12培養(yǎng)基+20％Knock out SR+1mM NEAA)，第2天進(jìn)行換液，4-5天后就可發(fā)現(xiàn)EB形成。

擬胚體(Embryroid body，EB)的形成結(jié)果如圖4所示：圖4表明mESC在本發(fā)明的培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)15代后，將細(xì)胞懸浮培養(yǎng)4日后，可以觀察到懸浮培養(yǎng)的EB，形成的EB球邊界光滑，折光性好，說明了用本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)mESC 15代后仍具有多能性細(xì)胞分化能力。

實(shí)施例6：畸胎瘤形成和成瘤后HE染色

按照實(shí)施例3中的方法將P25代獼猴胚胎干細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)到P40代時(shí)，消化成單細(xì)胞懸液，取同性別的免疫缺陷小鼠，腹股溝注射細(xì)胞懸液，每只鼠注射1×10⁷個(gè)細(xì)胞。飼養(yǎng)小鼠，兩周后可見腫塊。4～5周后處死小鼠，剝離腫塊。固定，切片，染色，觀察三胚層結(jié)構(gòu)?；チ鲂纬珊统闪龊驢E染色結(jié)果如圖5所示：圖5是用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的P40代獼猴胚胎干細(xì)胞系細(xì)胞注入免疫缺陷小鼠中，經(jīng)過4-6周后可以形成具有不同胚層組織的畸胎瘤。說明經(jīng)過本發(fā)明培養(yǎng)基擴(kuò)增mES細(xì)胞維持了良好的體內(nèi)分化潛能。

前述對本發(fā)明的具體示例性實(shí)施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變和變化。對示例性實(shí)施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實(shí)施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。