本發(fā)明涉及高通量dna測(cè)序儀的核心元件納米孔的制備，尤其涉及納米孔單分子傳感器以及用該傳感器制造納米孔陣列的方法。

背景技術(shù)：

dna測(cè)序可以揭示人及其它所有物種的遺傳密碼，對(duì)個(gè)性化醫(yī)療有著巨大意義，是人類(lèi)健康的藍(lán)本。

目前dna測(cè)序技術(shù)的主流是基于邊合成邊測(cè)序的二代測(cè)序技術(shù)。illumina公司的bridgeamplification高通量測(cè)序技術(shù)為其代表，該測(cè)序技術(shù)通過(guò)對(duì)被測(cè)目標(biāo)核酸進(jìn)行平行擴(kuò)增，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，克隆出上百萬(wàn)種固相化單鏈核酸片段模板，進(jìn)行高通量并行序列測(cè)定。第二代測(cè)序技術(shù)存在問(wèn)題：（1）dna測(cè)序文庫(kù)制備需要較大量的起始dna樣本；（2）樣本的平行擴(kuò)增還可能導(dǎo)致測(cè)序文庫(kù)制備的偏性；（3）制備測(cè)序文庫(kù)需要大量的分子生物學(xué)操作，測(cè)序文庫(kù)制備時(shí)間較長(zhǎng)，成本較高；（4）由于單次讀取高度碎片化的片段，后期生物信息學(xué)重組原始序列計(jì)算成本很高。

以pacbio為代表的第三代單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)，針對(duì)上述問(wèn)題作出了重大技術(shù)改革，其特點(diǎn)是：（1）實(shí)現(xiàn)單分子dna測(cè)序，能夠克服由基因擴(kuò)增引起的測(cè)序偏向性；（2）實(shí)現(xiàn)連續(xù)測(cè)序，也就是dna鏈上堿基的閱讀是不間斷的，無(wú)需對(duì)測(cè)序?qū)ο筮M(jìn)行高度碎片化，也會(huì)使dna的讀長(zhǎng)大幅度增加；（3）直接讀出堿基修飾如甲基化等。但測(cè)序成本還很高由于使用熒光標(biāo)記試劑，儀器成本昂貴，通量有待提高。

以納米孔為代表的第四代單分子實(shí)時(shí)電學(xué)測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)具有低儀器和測(cè)序成本的優(yōu)勢(shì)。納米孔測(cè)序方法是單鏈dna分子在電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下穿過(guò)納米尺度的微孔，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)過(guò)孔離子電流的變化而識(shí)別過(guò)孔dna單鏈上的堿基。制備納米孔的材料可以采用天然的或經(jīng)過(guò)改造過(guò)的蛋白質(zhì)分子(如α溶血素、mpsa蛋白)，也可以是用微加工制備的固態(tài)納米孔(如氮化硅、二維材料)。以oxfordnanopore公司將生物孔商業(yè)化，推出usb大小納米孔測(cè)序儀。生物孔的厚度在4-5堿基（2-3納米），不能完全實(shí)現(xiàn)單堿基分辨。最近，單層二維固體，如石墨烯，二硫化鉬，氮化硼等由于其單原子級(jí)厚度有望現(xiàn)實(shí)單堿基分辨率。傳統(tǒng)的成孔方法是用高分辨電子顯微鏡的聚焦電子束在固體薄膜上轟擊出單個(gè)納米尺寸的孔。該方法效率低且價(jià)格昂貴，只適合研究用途，不適合商業(yè)化批量生產(chǎn)。作為第四代測(cè)序儀的核心元件，批量生產(chǎn)固體納米孔一直是制約固體納米孔商業(yè)應(yīng)用的瓶頸。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于：克服現(xiàn)有的dna測(cè)序技術(shù)中制備納米孔只能單孔成孔，效率低，無(wú)法滿足高通量要求的缺陷，提供一種納米孔單分子傳感器以及制造納米孔陣列的方法，可以批量制備納米孔，制成納米孔陣列，效率高，滿足高通量要求。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出下列技術(shù)方案：一種納米孔單分子傳感器，其包括固態(tài)支撐膜、固態(tài)薄膜、若干第一電極對(duì)、第二電極對(duì)；

在固態(tài)支撐膜上開(kāi)設(shè)有若干個(gè)窗口；

固態(tài)薄膜附在固態(tài)支撐膜上；

固態(tài)薄膜的材料是厚度為1納米到3納米的氮化硅或者原子厚度單層二維材料石墨烯、氮化硼或二硫化鉬；

若干第一電極對(duì)安裝在固態(tài)薄膜上位于若干個(gè)窗口附近，第一電極對(duì)包括兩個(gè)分別安裝在固態(tài)薄膜的兩側(cè)而不與該固態(tài)薄膜物理接觸的電極，第一電極對(duì)的材料為銀/氯化銀，或者是鉑；

第二電極對(duì)安裝在固態(tài)薄膜上，第二電極對(duì)包括兩個(gè)安裝在固態(tài)薄膜同一側(cè)的電極，該兩個(gè)電極的材料為惰性金屬銅、汞、鈀、銀、鉑和金以及以上金屬的合金。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提出下列技術(shù)方案：一種用所述的納米孔單分子傳感器制造納米孔陣列的方法，包括下列步驟：

步驟1：制備固態(tài)支撐膜；

步驟2：把固態(tài)薄膜附到固態(tài)支撐摸上；

步驟3：把若干第二電極對(duì)安裝到固態(tài)薄膜上；

步驟4：第二電極對(duì)通過(guò)外接電路，施加10mv到1v電壓于第二電極對(duì)之間；

步驟5：通過(guò)若干第一電極對(duì)，施加100mv到50v的跨膜直流電位，在固態(tài)薄膜上開(kāi)孔得到納米孔陣列。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有下列有益效果：

本發(fā)明可以成批量的開(kāi)設(shè)納米孔，制成納米孔陣列，效率高，能滿足高通量的要求；

本發(fā)明用于dna測(cè)序的優(yōu)勢(shì)是多通道平行測(cè)序，純電學(xué)信號(hào)，無(wú)需光學(xué)標(biāo)記和擴(kuò)增，長(zhǎng)讀長(zhǎng)，降低序列組裝計(jì)算成本。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明所用的半導(dǎo)體基材的固態(tài)支撐膜及固態(tài)薄膜的示意圖。

圖2為本發(fā)明所用絕緣基材的固態(tài)支撐膜及固態(tài)薄膜的制備過(guò)程示意圖。

圖3為開(kāi)納米孔的示意圖。

圖4為橫電流開(kāi)納米孔的流程圖。

圖5為橫電壓開(kāi)納米孔的流程圖。

圖6為陣列示意圖。

具體實(shí)施方式

下文所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。

請(qǐng)參閱圖1至圖6，本發(fā)明提出一種納米孔單分子傳感器，其包括固態(tài)支撐膜1、固態(tài)薄膜2、兩個(gè)流體通道（圖未示）、若干第一電極對(duì)（圖未示）、第二電極對(duì)（圖未示）。

固態(tài)支撐膜1可為半導(dǎo)體基材或者絕緣基材。

如圖2所示，絕緣基材的固態(tài)支撐膜1可以通過(guò)以下方法制備:在雙面拋光的石英晶片111的上下表面，使用低壓氣相化學(xué)沉積(lowpressurechemicalvapordeposition,lpcvd)或等離子增強(qiáng)化學(xué)沉積(pecvd)的方法依次沉積100納米氮化硅層113和100納米的多晶硅層115。涂覆光刻膠117后用模板曝光顯影形成待刻蝕窗口圖形，然后用等離子刻蝕(rie)刻蝕，在背面刻蝕出幾百微米的正方形的刻蝕窗，49%hf濕刻石英晶片直到氮化硅層113，正面光刻膠117和多晶硅層115依次用丙酮和氫氧化鉀去除。

在固態(tài)支撐膜1上可以用聚焦離子束（fib）或者光刻（photolithgraphy）和干刻蝕(rie)得到若干個(gè)50納米到500納米尺寸的窗口3。

固態(tài)薄膜2的材料是厚度為1納米到3納米的氮化硅或者原子厚度單層二維材料石墨烯、氮化硼或二硫化鉬及其它二維材料。

固態(tài)薄膜2附在固態(tài)支撐膜1上，有下列兩種方法：第一種方法是用等離子增強(qiáng)化學(xué)沉積(pecvd)、有機(jī)金屬化學(xué)氣相沉積法（mocvd）、低壓氣相化學(xué)沉積（lpcvd）等方法得到，用聚合物輔助（如聚甲基丙烯酸甲酯）轉(zhuǎn)移的方法制到固態(tài)支撐膜1上，第二種方法是直接在固態(tài)支撐膜1上生長(zhǎng)出固態(tài)薄膜2。

如圖1所示，半導(dǎo)體基材的固態(tài)支撐膜1以及固態(tài)薄膜2通過(guò)以下方法制備：在雙面拋光的硅晶片101的上下表面，熱氧化生長(zhǎng)形成兩層60-270納米厚的二氧化硅薄膜103，使用低壓氣相化學(xué)沉積(lowpressurechemicalvapordeposition,lpcvd)或等離子增強(qiáng)化學(xué)沉積(pecvd)的方法在兩層二氧化硅薄膜103的外表面沉積一層5-50nm的氮化硅薄膜105，涂覆光刻膠后用模板曝光顯影形成待刻蝕窗口圖形，然后用等離子刻蝕(rie)刻蝕，在氮化硅薄膜105上刻蝕出幾百微米的正方形的刻蝕窗，緊接著用重量百分比30%（w/w）的氫氧化鉀(koh)溶液在90°c條件下腐蝕硅基底，直到下面的一層氮化硅薄膜105停止，最終形成一個(gè)低應(yīng)力自支撐氮化硅薄膜（即固態(tài)薄膜2）的窗口。

兩個(gè)流體通道（圖未示）被固體薄膜2分隔開(kāi)。

若干第一電極對(duì)（圖未示）安裝在固態(tài)薄膜2附近位于若干個(gè)窗口附近。

第一電極對(duì)包括兩個(gè)分別安裝在固態(tài)薄膜2的兩側(cè)而不與固定薄膜2接觸的電極，該第一電極對(duì)的材料為銀/氯化銀，或者是鉑。

第一電極對(duì)（圖未示）的作用是施加跨越固態(tài)薄膜2的電位（簡(jiǎn)稱：跨膜電位），第一電極對(duì)（圖未示）通過(guò)外接電路獨(dú)立施加電場(chǎng)到第一電極對(duì)（圖未示）之間。

制備納米孔陣列，需要在固定薄膜2上安裝若干第二電極對(duì)（圖未示），安裝的方法是：首先用旋涂電子束刻蝕膠（pmma或zep），以設(shè)定的密度均勻地分布該若干第二電極對(duì)（圖未示），然后圖案在電子束下曝光，顯影，再蒸發(fā)金屬，最后去除未曝光的電子束刻蝕膠。

跨膜電位，可以通過(guò)氧化還原電極（銀/氯化銀）施加到獨(dú)立的成孔區(qū)域。反饋系統(tǒng)與恒電流源連接，通過(guò)調(diào)整跨膜電位保持恒定跨膜電流?？讖降恼{(diào)控可用電壓閾值來(lái)控制。

離子濃度1mm-4m的電解液，ph值3-11。

第二電極對(duì)（圖未示）安裝在固態(tài)薄膜2上，第二電極對(duì)（圖未示）包括兩個(gè)安裝在固態(tài)薄膜同一側(cè)的電極（圖未示），該兩個(gè)電極的材料為惰性金屬銅、汞、鈀，銀、鉑和金以及以上金屬的合金。

第二電極對(duì)（圖未示）的作用是施加固態(tài)薄膜2平面的橫向電位。

用上述納米孔單分子傳感器來(lái)制造納米孔陣列的方法是：

步驟1：制備固態(tài)支撐膜1；

步驟2：把固態(tài)薄膜2附到固態(tài)支撐摸1上；

步驟3：把若干第二電極對(duì)（圖未示）安裝到固態(tài)薄膜2上；

步驟4：第二電極對(duì)（圖未示）通過(guò)外接電路，施加10mv到1v電壓于第二電極對(duì)（圖未示）之間；

步驟5：通過(guò)若干第一電極對(duì)（圖未示），施加100mv到50v的跨膜直流電位，在固態(tài)薄膜2上開(kāi)孔得到納米孔陣列，開(kāi)孔過(guò)程由跨膜電位和一個(gè)反饋系統(tǒng)控制，確保納米孔徑在指定范圍1.5納米到20納米。

為了把納米孔形成在指定位置，以密度1到1000000/mm²的密度，間距10nm到100nm，把若干第一電極對(duì)（圖未示）安裝在固態(tài)薄膜2的表面。

成孔后，電極對(duì)可用高頻交流（1khz-1mhz，1mv-10v）信號(hào)富集生物樣品到納米孔附近，使得檢出限低于1皮摩爾。

應(yīng)用實(shí)例1

恒電流模式成孔2.5納米

設(shè)定恒定電流輸入20納安，設(shè)定電極對(duì)間電壓為1伏，通過(guò)提高輸入電壓保持電流在20納安，未成孔前輸入電壓為25伏，將閾值設(shè)在0.8伏，當(dāng)成孔開(kāi)始時(shí)，電壓迅速降低，在達(dá)到閾值0.8伏時(shí)，反饋開(kāi)啟，所有輸入歸零。通過(guò)電流電壓關(guān)系校準(zhǔn)孔徑。

應(yīng)用實(shí)例2

恒電壓模式成孔2.5納米

將輸入電壓設(shè)定在10伏，設(shè)定電流閾值為200納安，保持一分鐘，如電流保持在20納安以內(nèi)沒(méi)有跳躍，將電壓增到11伏，保持一分鐘，以此類(lèi)推，直到電流發(fā)生跳躍到閾值200納安，反饋開(kāi)啟，所有輸入歸零。通過(guò)電流電壓關(guān)系校準(zhǔn)孔徑。

應(yīng)用實(shí)例3

低濃度生物樣品富集在納米孔區(qū)域。

通過(guò)金屬電極對(duì)實(shí)施交流信號(hào)，使樣品被捕獲區(qū)域大大增大，當(dāng)游離生物樣品進(jìn)入該區(qū)域，馬上被跨膜電位捕獲而穿過(guò)納米孔得到電學(xué)信號(hào)。

本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明可以成批量的開(kāi)設(shè)納米孔，制成納米孔陣列，效率高，能滿足高通量的要求；本發(fā)明用于dna測(cè)序的優(yōu)勢(shì)是多通道平行測(cè)序，純電學(xué)信號(hào)，無(wú)需光學(xué)標(biāo)記和擴(kuò)增，長(zhǎng)讀長(zhǎng)，降低序列組裝計(jì)算成本。