本發(fā)明屬于化學(xué)合成領(lǐng)域，涉及一組用于標(biāo)記羧基的同位素標(biāo)記試劑及其合成方法。
背景技術(shù)：
：：隨著質(zhì)譜(massspectrometry)技術(shù)的不斷發(fā)展和蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入，用于定量分析的穩(wěn)定同位素標(biāo)記(stableisotopelabeling)技術(shù)獲得了飛速發(fā)展。該方法中所涉及的同位素及其標(biāo)記試劑是一種具有高技術(shù)含量和高附加值的商品。通過(guò)對(duì)目標(biāo)分析物中的可反應(yīng)基團(tuán)進(jìn)行修飾并引入同位素標(biāo)記物，結(jié)合lc-ms可以實(shí)現(xiàn)高效準(zhǔn)確的相對(duì)或絕對(duì)定量。自上世紀(jì)70年代以來(lái)，該方法被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品安全、生命科學(xué)、環(huán)境、臨床醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域。對(duì)于含有羧基的目標(biāo)分析物，可選擇對(duì)羧基進(jìn)行修飾，通過(guò)縮合反應(yīng)將含有同位素的標(biāo)記試劑聯(lián)接到目標(biāo)物上。在眾多修飾試劑中，帶伯氨基的試劑是應(yīng)用最為廣泛的修飾試劑之一，可通過(guò)與目標(biāo)物中的羧基形成酰胺鍵實(shí)現(xiàn)修飾。在制備同位素修飾試劑的過(guò)程中，本發(fā)明選用了含同位素的碘甲烷作為同位素來(lái)源試劑，通過(guò)其與叔胺基的親核取代反應(yīng)，將同位素引入到最終的目標(biāo)產(chǎn)物上，即用于羧基標(biāo)記的同位素標(biāo)記試劑。在對(duì)樣品進(jìn)行分析時(shí)，先用該標(biāo)記試劑與樣品中的目標(biāo)分析物進(jìn)行反應(yīng)，將帶有同位素標(biāo)記的季銨引入到原分析物中，再用lc-ms對(duì)標(biāo)記后的產(chǎn)物進(jìn)行分析。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明主要內(nèi)容為合成一組新型的同位素標(biāo)記試劑，以n,n-二甲基乙二胺及其同系物為原料，通過(guò)親核取代反應(yīng)，將同位素引入到最終的目標(biāo)產(chǎn)物。為得到所期望的產(chǎn)物，在進(jìn)行親核取代反應(yīng)時(shí)，需要將其伯胺進(jìn)行屏蔽，阻止伯胺被甲基化；親核取代反應(yīng)完成后，再將原來(lái)伯胺基上的保護(hù)基團(tuán)去除，復(fù)原得到用于與羧基反應(yīng)的伯胺基。本發(fā)明的技術(shù)方案為：一組用于羧基標(biāo)記的同位素標(biāo)記試劑，所述的同位素標(biāo)記試劑的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是一端為伯胺，另一端為三甲基銨鹽，伯胺與三甲基銨鹽之間通過(guò)多個(gè)碳鏈相連，中部碳鏈上碳原子個(gè)數(shù)為2-7個(gè)，結(jié)構(gòu)式如下：上述同位素標(biāo)記試劑的合成方法，合成過(guò)程先用二碳酸二叔丁酯((boc)2o)對(duì)伯氨基進(jìn)行保護(hù)，然后在堿性條件下與碘甲烷或同位素取代的碘甲烷(氘及碳13)等反應(yīng)，最后在酸性條件脫去保護(hù)基團(tuán)得到(2-氨基乙基)三甲基銨的系列類似化合物，所述的系列類似化合物為同位素標(biāo)記試劑。具體包括以下步驟：第一步：以n,n‐二甲基乙二胺及其同系物(n＝1‐6)為反應(yīng)原料，采用二碳酸二叔丁酯((boc)2o)對(duì)伯氨基進(jìn)行保護(hù)，反應(yīng)式如下：具體步驟為：1.1)在反應(yīng)瓶中加入摩爾比為1:1‐1:3的水和有機(jī)溶劑后，再依次加入反應(yīng)原料和堿，室溫下攪拌均勻后得到混合溶液。所述的反應(yīng)原料在水中的濃度為0.5-5mmol/ml；所述的堿為氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉或三乙胺，堿在水中的濃度為0.75-25mmol/ml；所述的有機(jī)溶劑為四氫呋喃、1，4-二氧六環(huán)、二氯甲烷中的一種。1.2)在0-5℃條件下，將二碳酸二叔丁酯(boc)2o逐滴加入步驟1.1)得到的混合溶液中，冰水浴反應(yīng)10-30min，再常溫反應(yīng)2-4h得到反應(yīng)溶液。所述的反應(yīng)原料與(boc)2o的摩爾比為1:1.-3。第二步：反應(yīng)體系中引入碘甲烷或同位素取代的碘甲烷，得到相應(yīng)的季銨產(chǎn)物；該步驟中引入同位素的方式是借助含同位素的碘甲烷與叔氨基之間的親核取代反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。具體步驟：調(diào)節(jié)步驟1.2)得到的反應(yīng)溶液ph到中性左右，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑后，在反應(yīng)瓶中依次加入溶劑、堿和碘甲烷或同位素取代的碘甲烷試劑，在60-80℃條件下，加熱回流反應(yīng)2-4h后得到反應(yīng)溶液。所述的堿為氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸鉀中的一種；所述的溶劑為乙腈、丙酮、dmf中的一種；所述的反應(yīng)原料、碘甲烷或同位素取代的碘甲烷、堿的摩爾比為1:1.1-2:1.5-10；所述同位素取代的碘甲烷為ch2di、chd2i、cd3i、13ch3i、13ch2di、13chd2i、13cd3i。以不含同位素的碘甲烷為例，反應(yīng)式如下：第三步：在酸性條件脫去保護(hù)基團(tuán)得到相應(yīng)的三甲基銨鹽用鹽酸調(diào)節(jié)第二步得到的反應(yīng)溶液的ph至6-8，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，在反應(yīng)瓶中加入氯化氫的乙酸乙酯溶液，氯化氫的濃度為1-4mol/l，磁力攪拌，在20-40℃條件下反應(yīng)20-60min后，析出相應(yīng)的三甲基銨的鹽酸鹽，旋蒸干燥后就得到目標(biāo)產(chǎn)品，結(jié)構(gòu)式為：其中r為ch3、ch2d、chd2、cd3、13ch3、13ch2d、13chd2、13cd3；n＝1-6，即目標(biāo)產(chǎn)物中間碳鏈的碳原子個(gè)數(shù)可以為2-7個(gè)。本發(fā)明選用了含同位素的碘甲烷作為同位素源頭試劑，以n,n‐二甲基乙二胺同系物(中間碳鏈上碳原子數(shù)為2‐7個(gè))為原料，通過(guò)含同位素的碘甲烷與原料中叔胺基的親核取代反應(yīng)，將同位素引入到最終的目標(biāo)產(chǎn)物上。通過(guò)這種帶有同位素標(biāo)記的季銨鹽與含有羧基的物質(zhì)進(jìn)行酰胺化反應(yīng)，可以對(duì)羧基進(jìn)行標(biāo)記，得到其相應(yīng)的同位素內(nèi)標(biāo)物。本發(fā)明的有益效果為，通過(guò)以價(jià)格較為低廉的d或13c取代的碘甲烷，用高效的親核取代反應(yīng)合成了一組新型的可用于高效標(biāo)記羧基的同位素標(biāo)記試劑。當(dāng)用ms或lc-ms對(duì)含有羧基的目標(biāo)物進(jìn)行定量分析時(shí)，無(wú)需借助為各自的同位素內(nèi)標(biāo)?？蓪悠芳耙阎獫舛鹊拇郎y(cè)目標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)品分別用所合成的標(biāo)記試劑進(jìn)行衍生，將其轉(zhuǎn)化為帶有同位素的目標(biāo)物。經(jīng)過(guò)標(biāo)記之后，目標(biāo)物的羧基被轉(zhuǎn)化為季銨，在ms或lc-ms的分析中，其檢測(cè)模式由常用的負(fù)離子模式轉(zhuǎn)變?yōu)檎x子模式，離子化效率變高，可提高分析的靈敏度及檢測(cè)能力。當(dāng)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行相對(duì)定量或絕對(duì)定量時(shí)，同時(shí)對(duì)5-8個(gè)樣品平行進(jìn)行標(biāo)記處理，在完成標(biāo)記反應(yīng)之后對(duì)這些樣品進(jìn)行混合，用ms或lc-ms一次完成分析，儀器分析時(shí)間縮減至原始方面的1/5-1/8。與每個(gè)樣品單次進(jìn)樣分析相比，利用該系列同位素試劑進(jìn)行標(biāo)記后可顯著提高分析的效率及準(zhǔn)確性。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例1：(1)將1ml水和1ml四氫呋喃加入25ml圓底燒瓶中，再加入1.5mmoln,n-二甲基乙二胺和7.5mmolnaoh水溶液，混合均勻并置于0℃冰水浴中。在混合溶液中緩慢滴加2.5mmol(boc)2o溶液，磁力攪拌下反應(yīng)20min后，再室溫反應(yīng)2h。(2)反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑真空干燥，依次加入3ml乙腈，2mmolch3i和6mmolnaoh水溶液，在65℃下磁力攪拌反應(yīng)3h。(3)用鹽酸調(diào)節(jié)第二步得到的反應(yīng)溶液的ph為7，旋蒸干燥溶劑后，在反應(yīng)瓶中加入3ml氯化氫的乙酸乙酯溶液(濃度為1mol/l)，磁力攪拌，在25℃的反應(yīng)溫度下反應(yīng)25min。(4)反應(yīng)完成后，析出(2-氨基乙基)三甲基氯化銨的鹽酸鹽，旋蒸干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)品。實(shí)施例2：(1)取1ml水和2ml四氫呋喃于25ml圓底燒瓶中，加入1.5mmoln,n-二甲基乙二胺和6mmol三乙胺水溶液，混合均勻，并置于2℃冰水浴中。往混合溶液中緩慢滴加3mmol(boc)2o溶液，在磁力攪拌下反應(yīng)10min，后室溫下反應(yīng)2h。(2)反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑真空干燥，依次加入3ml乙腈，1.7mmolcd3i和6mmolnaoh水溶液，在70℃下磁力攪拌反應(yīng)4h。(3)將第二步反應(yīng)中的溶液用鹽酸調(diào)節(jié)ph＝6，旋轉(zhuǎn)蒸干，往反應(yīng)瓶中加入3ml氯化氫的乙酸乙酯溶液(2mol/l)，反應(yīng)溫度25℃，磁力攪拌進(jìn)行反應(yīng)30min。(4)反應(yīng)完成后，有(2-氨基乙基)三甲基氯化銨的鹽酸鹽析出，旋蒸干燥后就得到目標(biāo)產(chǎn)品。實(shí)施例3：(1)取1.5ml水和1.5ml四氫呋喃于25ml圓底燒瓶中，加入1.5mmoln,n-二甲基乙二胺和6mmolnaoh水溶液，混合均勻，并置于3℃冰水浴中。往混合溶液中緩慢滴加3.5mmol(boc)2o溶液，在磁力攪拌下反應(yīng)15min，后室溫下反應(yīng)3h。(2)反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑真空干燥，依次加入3ml乙腈，2mmolch2di和6mmolnaoh水溶液，在65℃下磁力攪拌反應(yīng)3h。(3)將第二步反應(yīng)中的溶液用鹽酸調(diào)節(jié)ph＝6.5，旋轉(zhuǎn)蒸干，往反應(yīng)瓶中加入3ml氯化氫的乙酸乙酯溶液(3mol/l)，反應(yīng)溫度30℃，磁力攪拌進(jìn)行反應(yīng)35min。(4)反應(yīng)完成后，有(2-氨基乙基)三甲基氯化銨的鹽酸鹽析出，旋蒸干燥后就得到目標(biāo)產(chǎn)品。實(shí)施例4：(1)取1ml水和1ml1，4-二氧六環(huán)于25ml圓底燒瓶中，加入1.5mmoln,n-二甲基乙二胺和7.5mmolnaoh水溶液，混合均勻，并置于4℃冰水浴中。往混合溶液中緩慢滴加3mmol(boc)2o溶液，在磁力攪拌下反應(yīng)25min，后室溫下反應(yīng)3h。(2)反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑真空干燥，依次加入3ml丙酮，2mmolchd2i和6mmolnaoh水溶液，在75℃下磁力攪拌反應(yīng)4h。(3)將第二步反應(yīng)中的溶液用鹽酸調(diào)節(jié)ph＝7.5，旋轉(zhuǎn)蒸干，往反應(yīng)瓶中加入3ml氯化氫的乙酸乙酯溶液(4mol/l)，反應(yīng)溫度40℃，磁力攪拌進(jìn)行反應(yīng)30min。(4)反應(yīng)完成后，有(2-氨基乙基)三甲基氯化銨的鹽酸鹽析出，旋蒸干燥后就得到目標(biāo)產(chǎn)品。實(shí)施例5：(1)取1ml水和3ml四氫呋喃于25ml圓底燒瓶中，加入1.5mmol4-二甲基氨基丁胺和7.5mmol三乙胺水溶液，混合均勻，并置于3℃冰水浴中。往混合溶液中緩慢滴加3mmol(boc)2o溶液，在磁力攪拌下反應(yīng)20min，后室溫下反應(yīng)3h。(2)反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑真空干燥，依次加入3mldmf，2mmolch3i和7mmol碳酸鈉水溶液，在80℃下磁力攪拌反應(yīng)3h。(3)將第二步反應(yīng)中的溶液用鹽酸調(diào)節(jié)ph＝6.5，旋轉(zhuǎn)蒸干，往反應(yīng)瓶中加入3ml氯化氫的乙酸乙酯溶液(3mol/l)，反應(yīng)溫度35℃，磁力攪拌進(jìn)行反應(yīng)40min。(4)反應(yīng)完成后，有相應(yīng)的三甲基氯化銨的鹽酸鹽析出，旋蒸干燥后就得到目標(biāo)產(chǎn)品。實(shí)施例6：(1)取1ml水和2ml1，4-二氧六環(huán)于25ml圓底燒瓶中，加入1.5mmoln,n-二甲基乙二胺和10mmol三乙胺水溶液，混合均勻，并置于1℃冰水浴中。往混合溶液中緩慢滴加4mmol(boc)2o溶液，在磁力攪拌下反應(yīng)20min，后室溫下反應(yīng)2h。(2)反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑真空干燥，依次加入3ml乙腈，1.8mmol13ch3i和6mmolnaoh水溶液，在75℃下磁力攪拌反應(yīng)4h。(3)將第二步反應(yīng)中的溶液用鹽酸調(diào)節(jié)ph＝7，旋轉(zhuǎn)蒸干，往反應(yīng)瓶中加入3ml氯化氫的乙酸乙酯溶液(3mol/l)，反應(yīng)溫度30℃，磁力攪拌進(jìn)行反應(yīng)30min。(4)反應(yīng)完成后，有(2-氨基乙基)三甲基氯化銨的鹽酸鹽析出，旋蒸干燥后就得到目標(biāo)產(chǎn)品。實(shí)施例7：(1)取1ml水和3ml四氫呋喃于25ml圓底燒瓶中，加入1.5mmoln,n-二甲基乙二胺和5mmolnaoh水溶液，混合均勻，并置于0℃冰水浴中。往混合溶液中緩慢滴加2.8mmol(boc)2o溶液，在磁力攪拌下反應(yīng)20min，后室溫下反應(yīng)2h。(2)反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑真空干燥，依次加入3ml丙酮，2mmol13cd3i和6mmolnaoh水溶液，在70℃下磁力攪拌反應(yīng)3h。(3)將第二步反應(yīng)中的溶液用鹽酸調(diào)節(jié)ph＝7，旋轉(zhuǎn)蒸干，往反應(yīng)瓶中加入3ml氯化氫的乙酸乙酯溶液(3mol/l)，反應(yīng)溫度25℃，磁力攪拌進(jìn)行反應(yīng)50min。(4)反應(yīng)完成后，有(2-氨基乙基)三甲基氯化銨的鹽酸鹽析出，旋蒸干燥后就得到目標(biāo)產(chǎn)品。實(shí)施例8：(1)將1ml水和2ml四氫呋喃加入25ml圓底燒瓶中，再加入1.5mmol6-(二甲胺基)己胺和8mmolnaoh水溶液，混合均勻并置于0℃冰水浴中。在混合溶液中緩慢滴加2.5mmol(boc)2o溶液，磁力攪拌下反應(yīng)15min后，再室溫反應(yīng)2h。(2)反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑真空干燥，依次加入3mldmf，2mmolcd3i和7mmolnaoh水溶液，在70℃下磁力攪拌反應(yīng)4h。(3)將第二步反應(yīng)中的溶液用鹽酸調(diào)節(jié)ph＝6，旋轉(zhuǎn)蒸干，往反應(yīng)瓶中加入3ml氯化氫的乙酸乙酯溶液(4mol/l)，反應(yīng)溫度30℃，磁力攪拌進(jìn)行反應(yīng)40min。(4)反應(yīng)完成后，有相應(yīng)的三甲基氯化銨的鹽酸鹽析出，旋蒸干燥后就得到目標(biāo)產(chǎn)品。實(shí)施例9：(1)將1ml水和2ml1，4-二氧六環(huán)加入25ml圓底燒瓶中，加入1.5mmol7-(二甲氨基)庚胺和7mmolnaoh水溶液，混合均勻并置于0℃冰水浴中。在混合溶液中緩慢滴加2.5mmol(boc)2o溶液，磁力攪拌下反應(yīng)20min后，再室溫反應(yīng)4h。(2)反應(yīng)結(jié)束后，將溶劑真空干燥，依次加入3ml乙腈，2mmolch3i和7mmolnaoh水溶液，在75℃下磁力攪拌反應(yīng)4h。(3)將第二步反應(yīng)中的溶液用鹽酸調(diào)節(jié)ph＝7，旋轉(zhuǎn)蒸干，往反應(yīng)瓶中加入3ml氯化氫的乙酸乙酯溶液(4mol/l)，反應(yīng)溫度30℃，磁力攪拌進(jìn)行反應(yīng)50min。(4)反應(yīng)完成后，有相應(yīng)的三甲基氯化銨的鹽酸鹽析出，旋蒸干燥后就得到目標(biāo)產(chǎn)品。當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12