本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用表面固定化技術(shù)反復(fù)批次發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法。

背景技術(shù)：

L-乳酸是合成多種手性物質(zhì)的前體，在食品、醫(yī)藥和化妝品等方面的應(yīng)用十分廣泛。L-乳酸最主要的功能是可以用于合成聚乳酸的前體，聚乳酸具有與聚苯乙烯相似的光澤度和加工性能。由聚乳酸制成的產(chǎn)品具有很好的生物相容性，可以用于制作骨內(nèi)固定物、手術(shù)縫合線(xiàn)和藥物控釋載體等醫(yī)用材料；還可以替代聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯等材料生產(chǎn)新型環(huán)保包裝材料。

目前發(fā)酵法是生產(chǎn)乳酸的主要方法，但高純度L-乳酸的生產(chǎn)規(guī)模相對(duì)較小，傳統(tǒng)的游離細(xì)胞發(fā)酵方式有一些不足。一方面，發(fā)酵過(guò)程大都為鈣鹽法中和乳酸，即采用定期添加碳酸鈣作為中和劑控制pH，而且是采用發(fā)酵開(kāi)始預(yù)加過(guò)量的方式，不僅pH控制的不是很準(zhǔn)確，而且會(huì)給后續(xù)分離提取中的活性炭和納濾膜帶來(lái)很大壓力。因?yàn)槿樗徕}溶液中含有少量的殘?zhí)呛桶被?，在分離的沉降絮凝時(shí)會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，生成水溶性黑精，使乳酸鈣溶液呈黃褐色，極難去除。另一方面，傳統(tǒng)游離細(xì)胞的分批發(fā)酵的細(xì)胞濃度低、周期長(zhǎng)、底物轉(zhuǎn)化率低、產(chǎn)酸率不高。同時(shí)，初始底物濃度過(guò)高，培養(yǎng)基滅菌后抑制菌體生長(zhǎng)，從而使生產(chǎn)成本升高。

近年來(lái)越來(lái)越多的人將固定化技術(shù)應(yīng)用于乳酸發(fā)酵。傳統(tǒng)的固定化方法主要存在傳質(zhì)問(wèn)題，到發(fā)酵后期會(huì)造成死細(xì)胞大量累積影響發(fā)酵速率。美國(guó)俄亥俄州立大學(xué)的楊尚天教授等人于1992年發(fā)明了一種新型的細(xì)胞固定化反應(yīng)器——纖維床生物反應(yīng)器用于固定化發(fā)酵，主要是使菌體吸附于載體表面形成高密度培養(yǎng)，但固定化載體單一，主要以棉織物為主，現(xiàn)階段應(yīng)用范圍小而且僅限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的操作，目前還沒(méi)有將該固定化技術(shù)應(yīng)用于L-乳酸的文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種利用表面固定化技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中L-乳酸固定化發(fā)酵產(chǎn)量少的問(wèn)題。

一種利用表面固定化技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法，包括如下步驟：

(1)菌種固定化：將凝結(jié)芽孢桿菌種子液接入發(fā)酵罐中，溫度40～60℃、發(fā)酵液pH值為5.5～7.0、攪拌速度50～200rpm培養(yǎng)48～108h，最后將發(fā)酵罐中的培養(yǎng)物打入固定化反應(yīng)器中，循環(huán)流速為30～100mL/min，循環(huán)時(shí)間為72～132h；

所述的固定化反應(yīng)器中設(shè)有中空的纖維固定架，所述的纖維固定架外包裹有纖維材料，所述的纖維材料為無(wú)紡布、棉纖維、竹炭纖維中的任意一種或幾種；

或者，所述的纖維固定架內(nèi)填充有纖維材料，所述的纖維材料為：秸稈、甘蔗渣、玉米芯、棉纖維、麻纖維、竹纖維、無(wú)紡布、靜電紡絲、活性炭纖維、細(xì)菌纖維素膜、聚乙烯醇纖維、聚砜纖維中的任意一種或幾種；

(2)發(fā)酵：將發(fā)酵罐和固定化反應(yīng)器中的培養(yǎng)基泵出，再泵入新的發(fā)酵培養(yǎng)基開(kāi)始固定化發(fā)酵。

步驟(1)中，所述的凝結(jié)芽孢桿菌為凝結(jié)芽孢桿菌CCTCC M 2012156，該菌株的保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2012156，該菌株的詳細(xì)信息已經(jīng)在申請(qǐng)?zhí)枮?01210172600.7的中國(guó)專(zhuān)利中詳細(xì)公開(kāi)。

步驟(1)中，發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米淀粉120～180g/L，酵母膏12～18g/L，七水硫酸鎂0.5～1g/L，蛋白胨0.5～1g/L，無(wú)水乙酸鈉3～5g/L。

所述的發(fā)酵培養(yǎng)基利用如下方法配置：

將玉米淀粉溶于水中，加入液化酶，處理50～100min，然后加入酵母膏、七水硫酸鎂、蛋白胨、無(wú)水乙酸鈉，加入糖化酶，處理10～300min。所述的糖化酶購(gòu)自諾維信，所述的液化酶為蘇宏牌α淀粉酶。

其中，所述糖化酶的處理溫度為80～100℃，所述液化酶的處理溫度為40～60℃。

步驟(2)中，固定化發(fā)酵方式為單批補(bǔ)料發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵或同步糖化發(fā)酵中的任意一種。

有益效果：

本發(fā)明具有如下優(yōu)勢(shì)：

(1)本發(fā)明不使用碳酸鈣作為中和劑，而是通過(guò)中間流加氨水等液體堿性物質(zhì)，中和不斷產(chǎn)生的乳酸，維持發(fā)酵所需要的適宜酸度，避免了在發(fā)酵結(jié)束時(shí)會(huì)形成高濃度的乳酸鈣固體，從而給后續(xù)分離提取中的活性炭和納濾膜帶來(lái)很大壓力，造成下罐困難，清洗、取樣不便。同時(shí)利用氨水作為中和劑在后期分離中產(chǎn)生的NH4SO4有較高的經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值，可以提高L-乳酸生產(chǎn)鏈的經(jīng)濟(jì)效益。

(2)固定化反應(yīng)器中細(xì)胞吸附于纖維材料表面，很大程度上提高了細(xì)胞密度，而纖維材料作為固定化載體具有高空隙率和比表面積的特點(diǎn)，使其傳質(zhì)效率明顯高于傳統(tǒng)固定化方式，可以有效避免固定化后期堵塞的問(wèn)題。

(3)改進(jìn)優(yōu)化了纖維材料的固定方式，避開(kāi)傳統(tǒng)的鐵絲網(wǎng)+纖維+鐵絲網(wǎng)三明治形式的固定方式，將纖維材料直接縫接在特定的支架上或者是填充在分三層設(shè)計(jì)的鋼絲網(wǎng)槽中，增加了發(fā)酵液中的菌體與纖維材料的接觸面積，利于發(fā)酵液中的菌體更好地吸附在纖維材料上。

(4)在反復(fù)批次過(guò)程中，通過(guò)分批補(bǔ)料和同步糖化發(fā)酵控制較低濃度的碳源，可以減小底物抑制，提高底物利用率和發(fā)酵效率。

(5)利用表面固定化技術(shù)進(jìn)行反復(fù)批次發(fā)酵的特點(diǎn)在于每一批次結(jié)束后不需要保留發(fā)酵液作為下一批次的種子液，而是直接利用纖維材料固定的菌體直接進(jìn)行發(fā)酵，上一批次發(fā)酵過(guò)程中纖維床反應(yīng)器固定菌體可以直接作為下一批次發(fā)酵的種子，略去了種子培育的時(shí)間，極大地節(jié)省了種子培養(yǎng)的時(shí)間和勞動(dòng)力。

(6)本發(fā)明的單批發(fā)酵與傳統(tǒng)的單批游離細(xì)胞發(fā)酵相比，發(fā)酵速率提高了0.62～0.88g/L/h，發(fā)酵時(shí)間由144～168h縮短至72～132h，產(chǎn)物得率(乳酸產(chǎn)量/葡萄糖消耗)提高了1.74％～15.42％(w/w)。

附圖說(shuō)明

圖1是將纖維材料固定于不銹鋼支架構(gòu)成細(xì)胞固定化載體的一種方式的示意圖。

圖2是將纖維材料固定于不銹鋼支架構(gòu)成細(xì)胞固定化載體的另一種方式的示圖。

圖3為固定化反應(yīng)器系統(tǒng)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的示意圖。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

如圖1和圖2展示了兩種不同的纖維固定架結(jié)構(gòu)，圖1中在中間的支撐桿上360°錯(cuò)落焊接帶有小孔的不銹鋼鐵片，將纖維材料如無(wú)紡布、棉纖維、竹炭纖維等是通過(guò)小孔繞一圈縫接在不銹鋼鐵片上。

圖2是將不銹鋼絲網(wǎng)槽焊接在四根細(xì)不銹鋼管上并附有不銹鋼絲網(wǎng)蓋子，將纖維材料如玉米芯、秸稈顆粒、甘蔗渣等填充在分三層的不銹鋼網(wǎng)槽內(nèi)。

圖1～3中，1表示不銹鋼支架；2表示不銹鋼鐵片上的小孔；3表示纖維材料；4表示焊有網(wǎng)槽的不銹鋼支架；5表示可拆卸的不銹鋼絲網(wǎng)蓋子；6表示恒溫水浴鍋；7表示固定化反應(yīng)器(內(nèi)有固定化載體)；8表示發(fā)酵罐；9表示發(fā)酵罐控制箱；10表示磁力攪拌槳；11表示pH電極；12表示溫度電極；13表示堿液瓶；14表示補(bǔ)料瓶；15表示氮?dú)馊肟冢?6表示尾氣出口；17表示蠕動(dòng)泵；18表示蠕動(dòng)泵。

以下各實(shí)施例中的分析方法如下：

(1)生物量的測(cè)定：

將發(fā)酵液樣品稀釋?zhuān)糜饶峥?200分光光度計(jì)于600nm處測(cè)量其吸光度，其吸光度OD600與每升的細(xì)胞干重(DW/L)的轉(zhuǎn)化值為:1OD600＝0.436g DW/L。

(2)乳酸和葡萄糖含量的測(cè)定：

將各發(fā)酵液樣品進(jìn)行離心，測(cè)定菌體干重，取上清稀釋后，采用Agilent1260高效液相色譜儀測(cè)定L-乳酸含量(HPLC)。色譜柱為日本住友公司的Sumichiral OA-5000(150×4.6mm)，柱溫30℃，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm，流動(dòng)相為95％的2mM的Cu2SO4水溶液和5％的異丙醇溶液的混合物；流速1mL/min；進(jìn)樣量：10μL。

(3)L-乳酸光學(xué)純度測(cè)定：手性分離柱Sumichiral OA-5000(150×4.6mm I.D.,Sumika chemical Analysis Service,Osaka,/Japan)，95％的2mM的Cu2SO4水溶液和5％的異丙醇溶液的混合物作為流動(dòng)相，流速：1ml/min，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm，操作溫度：30℃，L-乳酸標(biāo)品購(gòu)于Sigma-Aldrich公司。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例以玉米淀粉為原料，采用同步糖化發(fā)酵的補(bǔ)料形式進(jìn)行固定化反復(fù)批次發(fā)酵，方法步驟如下：

平板培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖5g/L，酵母膏3g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，七水硫酸鎂0.5g/L，碳酸鈣3g/L；

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉150g/L，酵母膏15g/L，七水硫酸鎂0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，無(wú)水乙酸鈉3g/L。

(1)平板培養(yǎng)：將凍存保藏的菌株接種到平板培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)箱中50℃靜置培養(yǎng)48h活化。

(2)種子培養(yǎng)：從活化的平板挑取菌體接入100ml種子培養(yǎng)基中，50℃下100rpm培養(yǎng)24h形成一級(jí)種子液。再將一級(jí)種子液轉(zhuǎn)接于裝有500ml種子培養(yǎng)基中，接種量8％，50℃下150rpm培養(yǎng)24h形成二級(jí)種子液。

(3)固定化反復(fù)批次發(fā)酵：

①固定化反應(yīng)體系的構(gòu)建：將麻纖維3固定在不銹鋼支架1外圍(如圖1所示)放入帶夾套的不銹鋼柱中構(gòu)建固定化反應(yīng)器7，固定化反應(yīng)器通過(guò)循環(huán)管路與發(fā)酵罐8相連(如圖3所示)，發(fā)酵罐的調(diào)控系統(tǒng)9和循環(huán)管路保證固定化反應(yīng)器的液體混勻以及調(diào)控反應(yīng)器的pH，并且在固定化反應(yīng)器的夾套內(nèi)通過(guò)蠕動(dòng)泵18循環(huán)通入由恒溫水浴鍋控溫6的水以控制反應(yīng)器的溫度。

②發(fā)酵培養(yǎng)基的預(yù)處理：將玉米淀粉用液化酶90℃液化80min后加入糖化酶以及滅過(guò)菌的其他發(fā)酵培養(yǎng)基成分，打入發(fā)酵罐。

③固定化過(guò)程：將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(培養(yǎng)時(shí)間24h)的種子液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10％，發(fā)酵罐內(nèi)的工作體積為4L，培養(yǎng)溫度50℃，攪拌速度100rpm，并流加NaOH將pH控制在6.0，培養(yǎng)28h至菌懸液吸光度(OD600)達(dá)到10.0左右，通過(guò)蠕動(dòng)泵17將發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基打入固定化反應(yīng)器，將循環(huán)流速設(shè)置為30mL/min，在FBB反應(yīng)器內(nèi)開(kāi)始菌體的固定化過(guò)程，這個(gè)過(guò)程進(jìn)行72h。

④反復(fù)批次發(fā)酵過(guò)程：固定化過(guò)程結(jié)束之后將發(fā)酵罐和固定化反應(yīng)器中的培養(yǎng)基泵出，通過(guò)蠕動(dòng)泵將含有新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基打入發(fā)酵罐，然后開(kāi)啟循環(huán)管路的蠕動(dòng)泵，將循環(huán)流速設(shè)置為80mL/min，利用固定化反應(yīng)器內(nèi)麻纖維固定的菌體發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，當(dāng)殘?zhí)菨舛鹊陀?0g/L時(shí)，放出發(fā)酵罐和固定化反應(yīng)器內(nèi)的料液(保留麻纖維)，然后將新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基通過(guò)蠕動(dòng)泵打入發(fā)酵罐并且通過(guò)循環(huán)管路與固定化反應(yīng)器接通，開(kāi)始反復(fù)批次發(fā)酵的第二批發(fā)酵，共進(jìn)行了3個(gè)批次的發(fā)酵。HPLC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 同步糖化發(fā)酵結(jié)果

實(shí)施例2：

本實(shí)施例以單批補(bǔ)料的形式進(jìn)行固定化反復(fù)批次發(fā)酵，具體方法步驟如下：

平板培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實(shí)施例1。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖150g/L，酵母膏15g/L，七水硫酸鎂0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，無(wú)水乙酸鈉3g/L。

(1)平板培養(yǎng)：同實(shí)施例1；

(2)種子培養(yǎng)：同實(shí)施例1；

(3)固定化反復(fù)批次發(fā)酵：

①固定化反應(yīng)體系的構(gòu)建：將玉米芯填充在帶有網(wǎng)槽的不銹鋼支架4內(nèi)放入帶夾套的不銹鋼柱中構(gòu)建固定化反應(yīng)器，其他步驟同實(shí)施例1的步驟①。

②固定化過(guò)程同實(shí)施例1的步驟③。

③反復(fù)批次發(fā)酵過(guò)程：固定化過(guò)程結(jié)束之后將發(fā)酵罐和固定化反應(yīng)器中的培養(yǎng)基泵出，通過(guò)蠕動(dòng)泵將高糖濃度的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基打入發(fā)酵罐，然后開(kāi)啟循環(huán)管路的蠕動(dòng)泵，將循環(huán)流速設(shè)置為80mL/min，利用固定化反應(yīng)器內(nèi)玉米芯固定的菌體發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，通過(guò)流加氨水將pH控制在5.8，當(dāng)殘?zhí)菨舛鹊陀?0g/L時(shí)，放出發(fā)酵罐和固定化反應(yīng)器內(nèi)的料液(保留玉米芯)，然后將新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基通過(guò)蠕動(dòng)泵打入發(fā)酵罐并且通過(guò)循環(huán)管路與FBB反應(yīng)器接通，開(kāi)始反復(fù)批次發(fā)酵的第二批發(fā)酵，共進(jìn)行了5個(gè)批次的發(fā)酵。HPLC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 單批補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果

實(shí)施例3：

本實(shí)施例以玉米淀粉水解糖液為原料，采用補(bǔ)料分批的形式進(jìn)行固定化反復(fù)批次發(fā)酵，具體方法步驟如下：

平板培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)同實(shí)施例1。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉水解糖液60g/L，酵母膏15g/L，七水硫酸鎂0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，無(wú)水乙酸鈉3g/L。

(1)平板培養(yǎng)：同實(shí)施例1；

(2)種子培養(yǎng)：同實(shí)施例1；

(3)固定化反復(fù)批次發(fā)酵：

①固定化反應(yīng)體系的構(gòu)建：將活性炭纖維固定在不銹鋼支架外圍放入帶夾套的不銹鋼柱中構(gòu)建固定化反應(yīng)器，其他步驟同實(shí)施例1的步驟①。

②發(fā)酵培養(yǎng)基的預(yù)處理：將玉米淀粉用液化酶90℃液化80min后用糖化酶60℃處理250min，得到玉米淀粉水解糖液，然后加入滅過(guò)菌的其他發(fā)酵培養(yǎng)基成分，打入發(fā)酵罐。

③固定化過(guò)程同實(shí)施例1的步驟③。

④反復(fù)批次發(fā)酵過(guò)程：固定化過(guò)程結(jié)束之后將發(fā)酵罐和固定化反應(yīng)器中的發(fā)酵培養(yǎng)基泵出，通過(guò)蠕動(dòng)泵將含有低濃度玉米淀粉水解糖液的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基打入發(fā)酵罐，然后開(kāi)啟循環(huán)管路的蠕動(dòng)泵，將循環(huán)流速設(shè)置為70mL/min，利用固定化反應(yīng)器內(nèi)活性炭纖維固定的菌體發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，當(dāng)殘?zhí)菨舛鹊陀?0g/L時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料(只補(bǔ)加玉米淀粉水解糖液60g/L，培養(yǎng)基其他成分不補(bǔ)加)，每一批都補(bǔ)加兩次。當(dāng)糖耗大于135g/L時(shí)，放出發(fā)酵罐和固定化反應(yīng)器內(nèi)的料液(保留活性炭纖維)，然后將新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基通過(guò)蠕動(dòng)泵打入發(fā)酵罐并且通過(guò)循環(huán)管路與固定化反應(yīng)器接通，開(kāi)始反復(fù)批次發(fā)酵的新一批的發(fā)酵。共進(jìn)行5個(gè)批次的發(fā)酵，HPLC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 玉米淀粉水解糖液為原料進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵結(jié)果

實(shí)施例4：

本實(shí)施例以葡萄糖為原料，采用補(bǔ)料分批的形式進(jìn)行固定化反復(fù)批次發(fā)酵，具體方法步驟如下：

平板培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實(shí)施例1。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60g/L，酵母膏7g/L，七水硫酸鎂0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，無(wú)水乙酸鈉3g/L。

(1)平板培養(yǎng)：同實(shí)施例1；

(2)種子培養(yǎng)：同實(shí)施例1；

(3)固定化反復(fù)批次發(fā)酵：

①固定化反應(yīng)體系的構(gòu)建：將甘蔗渣填充在帶有網(wǎng)槽的不銹鋼支架內(nèi)放入帶夾套的不銹鋼柱中構(gòu)建固定化反應(yīng)器，其他步驟同實(shí)施例1的步驟①。

②固定化過(guò)程同實(shí)施例1的步驟③。

③反復(fù)批次發(fā)酵過(guò)程：固定化過(guò)程結(jié)束之后將發(fā)酵罐和固定化反應(yīng)器中的培養(yǎng)基泵出，通過(guò)蠕動(dòng)泵將含有低濃度葡萄糖的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基打入發(fā)酵罐，然后開(kāi)啟循環(huán)管路的蠕動(dòng)泵，將循環(huán)流速設(shè)置為90mL/min，利用固定化反應(yīng)器內(nèi)甘蔗渣固定的菌體發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，當(dāng)殘?zhí)菨舛鹊陀?0g/L時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料(只補(bǔ)加葡萄糖60g/L和酵母膏7g/L，培養(yǎng)基其他成分不補(bǔ)加)，每一批都補(bǔ)加兩次。當(dāng)糖耗大于135g/L時(shí)，放出發(fā)酵罐和FBB反應(yīng)器內(nèi)的料液(保留甘蔗渣)，然后將新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基通過(guò)蠕動(dòng)泵打入發(fā)酵罐并且通過(guò)循環(huán)管路與FBB反應(yīng)器接通，開(kāi)始反復(fù)批次發(fā)酵的新一批的發(fā)酵。共進(jìn)行5個(gè)批次的發(fā)酵，HPLC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 以葡萄糖為原料采用補(bǔ)料分批發(fā)酵結(jié)果

實(shí)施例5：

本實(shí)施例以玉米淀粉為原料，采用同步糖化發(fā)酵的補(bǔ)料形式進(jìn)行固定化反復(fù)批次發(fā)酵，方法步驟如下：

平板培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實(shí)施例1。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉150g/L，酵母粉15g/L，七水硫酸鎂0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，無(wú)水乙酸鈉3g/L。

(1)平板培養(yǎng)：同實(shí)施例1；

(2)種子培養(yǎng)：同實(shí)施例1；

(3)固定化反復(fù)批次發(fā)酵：

①固定化反應(yīng)體系的構(gòu)建：將秸稈填充在帶有網(wǎng)槽的不銹鋼支架內(nèi)放入帶夾套的不銹鋼柱中構(gòu)建固定化反應(yīng)器，其他步驟同實(shí)施例1的步驟①。

②發(fā)酵培養(yǎng)基的預(yù)處理同實(shí)施例1的步驟②。

③固定化過(guò)程同實(shí)施例1的步驟③。

④反復(fù)批次發(fā)酵過(guò)程：固定化過(guò)程結(jié)束之后將發(fā)酵罐和固定化反應(yīng)器中的培養(yǎng)基泵出，通過(guò)蠕動(dòng)泵將新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基打入發(fā)酵罐，然后開(kāi)啟循環(huán)管路的蠕動(dòng)泵，將循環(huán)流速設(shè)置為100mL/min，利用固定化反應(yīng)器內(nèi)秸稈固定的菌體發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，當(dāng)殘?zhí)菨舛鹊陀?0g/L時(shí)，放出發(fā)酵罐和固定化反應(yīng)器內(nèi)的料液(保留秸稈)，然后將新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基通過(guò)蠕動(dòng)泵打入發(fā)酵罐并且通過(guò)循環(huán)管路與固定化反應(yīng)器接通，開(kāi)始反復(fù)批次發(fā)酵的新一批的發(fā)酵。共進(jìn)行8個(gè)批次的發(fā)酵，HPLC檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 以玉米淀粉為原料采用同步糖化發(fā)酵結(jié)果

實(shí)施例6：

本實(shí)施例是傳統(tǒng)的單批游離細(xì)胞發(fā)酵，具體方法步驟如下：

平板培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基同實(shí)施例1。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖150g/L，酵母膏15g/L，七水硫酸鎂0.5g/L，蛋白胨0.05g/L，無(wú)水乙酸鈉3g/L，CaCO3 70g/L。

1)平板培養(yǎng)：同實(shí)施例1的步驟1)

2)種子培養(yǎng)同實(shí)施例1的步驟1)和步驟2)。

3)傳統(tǒng)的單批游離細(xì)胞發(fā)酵：

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(培養(yǎng)時(shí)間24h)的凝結(jié)芽孢桿菌種子液接入7.5L的發(fā)酵罐，接種量10％，發(fā)酵罐內(nèi)的工作體積為4L，培養(yǎng)溫度50℃，攪拌速度100rpm，發(fā)酵時(shí)間5天。最終乳酸產(chǎn)量73.93g/L，得率(乳酸產(chǎn)量/葡萄糖消耗)85.58％(w/w)，發(fā)酵速率0.61g/L/h，L-乳酸光學(xué)純度99.03％。