本發(fā)明涉及屬于醫(yī)學(xué)基因治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種端粒酶啟動基因表達方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥治療技術(shù)現(xiàn)狀：人類對于癌癥治療有最迫切的期望，科學(xué)界和醫(yī)學(xué)界為此堅持不懈地付出探索。癌癥是目前困擾人類健康威脅人類生命的重大疾病。雖經(jīng)發(fā)病機理的大量基礎(chǔ)研究和各種治療方法的廣泛臨床實踐，但截至目前，科學(xué)界和醫(yī)學(xué)界還沒有找到一種可治愈癌癥的技術(shù)。雖然傳統(tǒng)的手術(shù)切除加放化療技術(shù)已被普遍用癌癥治療，以及最新的腫瘤免疫療法也已被探索用于癌癥治療，但治療的效果還與病人對于健康和生命的期望相差甚遠。例如,目前應(yīng)用最廣泛且最有效的腫瘤免疫療法是pd-1/pd-l1抑制劑(如pd-1抗體)，但其目前的總體應(yīng)答率卻只有20-30％；而在血液惡性腫瘤治療上有效的car-t、tcr-t等細胞治療，在實體瘤治療方面還沒有實質(zhì)進展。因此，探索新的癌癥治療技術(shù)，在人類可真正治愈癌癥前，將始終是科學(xué)界和醫(yī)學(xué)界努力的方向。

腫瘤治療最關(guān)鍵和重要的找到在癌細胞表面表達的特定抗原。目前免疫治療中不管是抗體治療還是細胞治療，都無法避免的依賴于該類腫瘤抗原(如目前car-t治療中運用的最成功的cd16)，即腫瘤免疫治療的靶點。但目前發(fā)現(xiàn)的可資利用的這類抗原極其有限，且大多數(shù)在正常細胞上也低量表達，在應(yīng)用時往往引起car-t細胞對正常細胞/器官的攻擊，導(dǎo)致自身免疫癥狀。因此，目前該領(lǐng)域正在著力運用二代測序技術(shù)尋找更多的新抗原。此外，即使找到這類新抗原，car-t治療的個體化細胞生產(chǎn)也因高昂的成本和潛在的新癌化風(fēng)險嚴重阻礙其應(yīng)用，因此不得不訴諸通用型t細胞的創(chuàng)制。但通用型t細胞也并非完全通用，而僅僅是一種可用于罹患某種同一類型抗原型腫瘤患者的t細胞，對于不同抗原型的腫瘤，仍需制備其特異的t細胞。盡管如此，該類通用型car-t的研制，仍代表了腫瘤免疫療法最新的實用化探索。因此，醫(yī)學(xué)界正努力實現(xiàn)通用型t細胞的研制和臨床應(yīng)用，并已取得顯著進展。例如，最近(2017年3月)美國fda已經(jīng)批準針對腫瘤抗原cd123的通用型car-tucart123(cellectis)進入臨床試驗。cd123抗原在急性骨髓性白血病(aml)細胞與母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞瘤(bpdcn)細胞上高度表達。這兩種疾病都往往在骨髓中發(fā)病，且能在短期內(nèi)威脅到患者的生命。通用型car-tucart123可用于治療這兩種癌癥的免疫治療。

必須指出，任何將病人細胞分離出來，進行體外培養(yǎng)、遺傳操作等之后，再回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)的治療方案，都存在體外操作帶來的風(fēng)險，尤其是遺傳操作。

因此，癌癥治療技術(shù)的探索需要另辟蹊徑的原創(chuàng)性設(shè)想。

基因編輯技術(shù)用于癌癥治療：近幾十年來，隨著全基因組測序技術(shù)的不斷成熟，科學(xué)家們在各種細菌和古細菌(archaea)中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了很多成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(crispr序列)以及和crispr序列相關(guān)基因(cas)。研究發(fā)現(xiàn)，這些crispr序列與很多病毒或者質(zhì)粒的dna序列互補，很多crispr-cas系統(tǒng)需要多種蛋白的參與，但只要一種細菌編碼的內(nèi)切酶cas9可以利用向?qū)na(核糖核酸)分子對特定的dna片段進行定向切割，這種基因組編輯技術(shù)就被稱為crispr-cas9。crispr-cas9能夠?qū)蚪M進行特異性定點改造，對細胞乃至整個生物體進行基因組改造。目前科學(xué)家已經(jīng)利用這種技術(shù)對細菌、植物(農(nóng)作物)、人體細胞以及斑馬魚進行過成功的遺傳學(xué)改造工作?；蚓庉嫙o疑將成為下一代生物技術(shù)的核心。

基因編輯技術(shù)在人類遺傳病及癌癥治療上具有巨大的應(yīng)用價值。因此，各國科學(xué)家及醫(yī)學(xué)界已著手其醫(yī)療價值的開發(fā)研究，如目前已經(jīng)報道的用于治療人鐮刀型型貧血病、地中海型貧血、黃斑性失明等。目前已經(jīng)報道，中美科學(xué)家開始將基因編輯技術(shù)用于癌癥治療。2016年，英國《自然》(nature)報道中國科學(xué)家已經(jīng)開始將crispr-cas9基因編輯技術(shù)用于腫瘤car-t療法(crisprgene-editingtestedinapersonforthefirsttime.naturedoi:10.1038/nature.2016.20988)。這是全球首例基因編輯技術(shù)治療癌癥的試驗。根據(jù)《自然》雜志的介紹，盧鈾團隊將會從招募參加臨床試驗的患者血液中采集t細胞(一種免疫細胞)，然后使用crisprcas9技術(shù)來敲除細胞中的一個基因，即pd-1蛋白編碼基因。pd-1蛋白通常是細胞免疫反應(yīng)的一個檢查點，可以防止免疫細胞攻擊健康的細胞。經(jīng)過基因編輯的細胞會在實驗室進行培養(yǎng)增殖，然后回輸?shù)交颊叩难褐?。改造后的細胞將在患者體內(nèi)巡視。盧鈾表示，研究團隊希望它們能對癌細胞發(fā)起攻擊。目前，美國利用基因編輯技術(shù)進行癌癥治療的研究也已經(jīng)得到批準進入實施。美國計劃中的臨床試驗也打算敲除編碼pd-1蛋白的基因，不過在將細胞回輸給患者前，還會敲除另一個基因，再加入一個新的基因。雖然2015年美國fda已批準了兩種基于抗體的阻斷pd-1的療法，用于治療肺癌，但這些抗體會在多大程度上阻斷pd-1并激活免疫反應(yīng)，對每個患者來說都是難以預(yù)測的。與之相比，以敲除基因的方法阻斷pd-1，其療效應(yīng)可能遠高于抗體治療。

但眾所周知，crispr基因編輯技術(shù)有可能會在錯誤的位置編輯基因組，從而可能出現(xiàn)有害影響。雖然在將細胞回輸給患者前可確認敲除的是正確的基因，但難以確保其他部分可能發(fā)生的所有錯誤編輯，這對該技術(shù)的應(yīng)用埋下了隱患。此外，如上所述，任何將病人細胞分離出來，進行體外培養(yǎng)、遺傳操作等之后，再回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)的治療方案，都存在體外操作帶來的風(fēng)險。運用基因編輯技術(shù)操作病人離體細胞之后再回輸，同樣無法避免這種風(fēng)險，甚至加重了這種風(fēng)險。

因此，利用基因編輯技術(shù)探索癌癥治療新技術(shù)，不一定要死盯住基因編輯技術(shù)的最誘人卻最具風(fēng)險的編輯功能，可以充分開發(fā)利用其基因組dna靶向功能和功能改性價值，以此揚起優(yōu)點避其弱點，探索利用基因編輯系統(tǒng)治療癌癥的新方法。

基因編輯工具的改性與基因表達調(diào)控：大量研究表明，并不是所有的疾病都是由于基因突變導(dǎo)致基因產(chǎn)物功能異常引起的，而是很多疾病是由于基因表達水平異常造成的。因此，調(diào)控基因的表達水平可用于治療疾病。調(diào)控基因的表達水平有兩種方法，一是向細胞導(dǎo)入目的基因的表達載體，使其在細胞表達產(chǎn)生基因產(chǎn)物(如rna或蛋白質(zhì))，達到調(diào)高細胞內(nèi)目標(biāo)基因產(chǎn)物的目的。二是向細胞內(nèi)導(dǎo)入具有基因表達調(diào)節(jié)功能的分子，使其激活或抑制細胞內(nèi)源性目的基因的表達，達到調(diào)控細胞內(nèi)目標(biāo)基因產(chǎn)物的目的。后者調(diào)控目的基因關(guān)鍵要做到兩點：一是靶向，即只調(diào)控目的基因，避免調(diào)控其他非目標(biāo)基因；二是可激活或抑制基因表達。

目前，所有用于基因編輯的工具經(jīng)過功能改性，均可以用于基因表達調(diào)控。例如，鋅指蛋白(zincfingerprotein，zfp)、轉(zhuǎn)錄因子樣效應(yīng)物(transcriptionactivator-likeeffector,tale)、crispr等。在用于基因編輯時，前兩者融合核酸酶內(nèi)切酶(常用foki)，以便切割dna，產(chǎn)生雙鏈斷裂，而crispr的cas9蛋白則自身具有核酸內(nèi)切酶活性。在用于基因表達調(diào)控的激活時，前兩者直接融合轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcriptionalactivatingdomain,tad)(如vp16、vp64、vp48、vp160、p65、vpr等)或其他具有基因轉(zhuǎn)錄激活作用的結(jié)構(gòu)(如p300、tet1等)，而crispr的cas9蛋白則須突變掉內(nèi)切酶活性(d10a&h840a)成為無核酸酶活性的cas9蛋白(nuclease-deficientcas9；也稱為deadcas9，dcas9)，并融合tad。在用于基因表達調(diào)控的抑制時，zfp、tale、dcas9均融合基因轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域(transcriptionalinhibitingdomain,tid)(如kreb)或其他具有基因轉(zhuǎn)錄抑制作用的結(jié)構(gòu)(如lsd1、dnmt3a等)。此外，zfp、tale、dcas9本身因結(jié)合dna而形成轉(zhuǎn)錄機器的路障，也可發(fā)揮基因表達調(diào)控的抑制作用(如crispri)。因此，當(dāng)這些改性的基因編輯工具用于基因表達調(diào)控時，則成為人工轉(zhuǎn)錄因子(或稱為工程化轉(zhuǎn)錄因子)。

除了對dcas9的上述改性外，還發(fā)展了dcas9-suntag的融合蛋白，該蛋白可與scfv-sfgfp-vp64融合蛋白結(jié)合，從而間接將轉(zhuǎn)錄激活蛋白vp64募集到靶基因上，激活靶基因的表達。該系統(tǒng)中，suntag是融合到dcas9上的肽表位(peptideepitope)，而scfv-sfgfp-vp64是融合sfgfp(superfolder-gfp)和vp64的單鏈可變片段(single-chainvariablefragment，scfv)抗體。scfv抗體與肽表位可互作結(jié)合。通過融合多個串聯(lián)肽表位，該系統(tǒng)可募集多達24個拷貝的scfv-sfgfp-vp64分子，可強烈激活內(nèi)源基因表達。

此外，dcas9/sgrna用于基因表達調(diào)控時，除了上述對dcas9進行改性(如融合vp16、vp64、p65、vpr、p300、kreb等)外，還可以對sgrna進行改性，使其發(fā)揮基因表達調(diào)控作用。例如，在正常sgrna的3′末端添加發(fā)卡核酸配體(hairpinaptamer)序列[如tetraloop(sgrna1.1)、stemloop2(sgrna1.2)]，通過ms2蛋白與發(fā)卡核酸配體的結(jié)合，將ms2-vp64或ms2-p65-hsf1等具有轉(zhuǎn)錄激活或抑制活性的融合蛋白募集到靶基因上，調(diào)控靶基因的表達(該系統(tǒng)被稱為sam)。除了sam方式，還發(fā)展了多任務(wù)crisprrna腳手架(multi-taskingcrisprrnascaffolds)系統(tǒng)，即將模塊化的腳手架rna(modularscaffoldrnas)(如ms2rna、pp7rna、comrna等)連接到正常sgrna上，通過腳手架rna募集具有不同功能的rna結(jié)合蛋白(即effectorprotein，效應(yīng)物蛋白)(如ms2-mcp-vp64、pp7-pcp-vp64、com-com-vp64等)，發(fā)揮基因表達調(diào)節(jié)的作用。

這些人工轉(zhuǎn)錄因子提供了人為干預(yù)基因表達的重要工具，在研究基因功能(基因過表達或敲低)、改造細胞功能(如細胞重編程)、疾病治療(如腫瘤分化療法)等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值。但目前還沒有將這些人工轉(zhuǎn)錄因子成功用于基因治療的實例。

端粒酶與癌癥治療：1985年，blackburn等從四膜蟲首次分離出端粒酶。1989年，morin自真核細胞hela細胞分離出人端粒酶，發(fā)現(xiàn)其中用于合成端粒dna的rna模板為11nt的序列5′-ccuaacccuaac-3′，可指導(dǎo)合成大量的端粒dna重復(fù)序列5′-ttaggg-3′。

腫瘤研究中人們很早就發(fā)現(xiàn)端粒酶在絕大多數(shù)人類腫瘤細胞中被重新激活。被激活的端粒酶維持了腫瘤細胞的端粒長度，因此造成腫瘤細胞的無限增殖能力。在健康的機體中，端粒酶活性在絕大多數(shù)體細胞都中被編程性關(guān)閉，僅在胚胎組織、干細胞、生殖器官和一些急性再生組織(如腸上皮)中有活性，但在這種情況下，端粒酶活性通常遠低于其在腫瘤細胞中的活性。大量的研究表明，醫(yī)學(xué)界已經(jīng)檢測各種腫瘤組織的端粒酶活性，發(fā)現(xiàn)在各種惡性腫瘤組織中端粒酶檢出率高達84％～95％，而正常組織和良性腫瘤中的檢出率僅為1％～4％。因此端粒酶活性已經(jīng)成為目前已知的最廣譜和最典型的惡性腫瘤標(biāo)志物。此外，研究發(fā)現(xiàn)在許多常見腫瘤的早期甚至是癌前階段即可檢測到端粒酶的活性。端粒酶活性的表達是癌變過程的一個早期事件，是許多惡性腫瘤發(fā)生的一個先決條件。近年來，端粒酶活性的檢測已不僅僅局限于活檢組織或切除標(biāo)本，諸如分泌物、病理性體液、吸出物、沖洗物和血液等標(biāo)本也得到了廣泛的應(yīng)用，并取得了滿意的結(jié)果。例如，檢測發(fā)現(xiàn)膀胱癌循環(huán)血腫瘤細胞的端粒酶活性100％、卵巢癌循環(huán)腫瘤細胞端粒酶活性100％、肝癌循環(huán)腫瘤細胞的端粒酶活性80％。因此，端粒酶活性不僅對腫瘤診斷特別是早期診斷具有重要意義，而且是優(yōu)良的惡性腫瘤治療靶點。正因如此，近年來如何抑制端粒酶活性不僅一直是腫瘤分子治療學(xué)的研究熱點，更有大量制藥公司進行各種端粒酶活性抑制劑的開發(fā)，如反義基因、逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、核苷類似物、核酶、蛋白激酶c抑制劑、誘導(dǎo)分化劑等。但截至目前，還沒有一例端粒酶活性抑制劑成藥。原因是各種端粒酶抑制劑均存在較嚴重的副作用，如對正常組織細胞產(chǎn)生的毒性、起效慢等。時至今日，端粒酶活性抑制在腫瘤治療領(lǐng)域已近成雞肋。

生物學(xué)研究表明，在機體內(nèi)一種生物分子的活性很難在細胞特別是組織水平上被徹底撲滅。抑制從來不是解決問題的好辦法，應(yīng)如大禹治水，采用因勢利導(dǎo)的策略，引導(dǎo)其發(fā)揮有利作用。因此，針對端粒酶活性這一最廣譜和最典型的惡性腫瘤標(biāo)志物，應(yīng)創(chuàng)制新的腫瘤治療策略。

端粒酶在80～90％的腫瘤類型存在激活，而正常的體細胞中沒有端粒酶活性，因此端粒酶一直是公認的優(yōu)良的腫瘤治療靶點。據(jù)此，已有很多制藥公司從抑制端粒酶活性抑制角度進行了大量的藥物研發(fā)，但截至目前還沒有一種端粒酶活性抑制劑成為可臨床應(yīng)用的藥品。因此，針對端粒酶這一珍貴的惡性腫瘤遍在性靶點進行癌癥的治療，需要發(fā)展新的策略與技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明名提供這一種端粒酶啟動基因表達方法(telomerase-activatinggeneexpression，tage)。端粒酶可結(jié)合并延長dna分子末端的端粒酶識別序列，合成新的端粒重復(fù)序列；基于這一特性，將端粒酶特有的生物學(xué)功能與人工轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控細胞基因表達技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展了tage新方法。

本發(fā)明還提供了一種端粒酶啟動基因表達方法的應(yīng)用。

技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述目的，如本發(fā)明所述的一種端粒酶啟動基因表達方法，包括如下步驟：

(1)將含有端粒識別序列的核酸分子與載體序列相連，構(gòu)建出攜帶有端粒酶識別序列的效應(yīng)基因表達載體并導(dǎo)入細胞，端粒酶在細胞內(nèi)結(jié)合并延長該基因表達載體，在其末端合成的端粒重復(fù)序列；

(2)同時向細胞導(dǎo)入可識別結(jié)合端粒重復(fù)序列的基因表達激活系統(tǒng)；

(3)基因表達激活系統(tǒng)識別并結(jié)合端粒重復(fù)序列，激活效應(yīng)基因表達載體上效應(yīng)基因的表達。

其中，步驟(1)所述核酸分子帶有位于其末端的粘性末端序列或帶有由核酸酶切割后產(chǎn)生的粘性末端序列。核酸酶為直接轉(zhuǎn)入細胞中的酵母同宗接合切換內(nèi)切酶(homothallicswitchingendonuclease，ho酶)或轉(zhuǎn)入細胞中的酵母同宗接合切換內(nèi)切酶表達載體表達的內(nèi)切酶(即轉(zhuǎn)入細胞中的ho酶表達載體表達的ho酶)。

所述粘性末端序列含有一段3′突出的單鏈序列。

所述3′突出的單鏈序列含有端粒酶識別序列，如5′-tgtt-3′、5′-agtt-3′，或其他可被端粒酶識別的序列。

其中，步驟(1)所述載體序列含有一種或多種基因序列及基因表達所需元件；所述基因為其表達產(chǎn)物對細胞生理可產(chǎn)生影響，或致細胞死亡的基因；所述基因表達所需元件包括各種來源的最小啟動子序列、kozack序列或polya序列。

所述基因包括cas9、tn5(轉(zhuǎn)座酶5)、核酸內(nèi)切酶、顆粒酶、凋亡酶(caspase)等基因。

其中，步驟(2)所述基因表達激活系統(tǒng)為基因轉(zhuǎn)錄激活分子或復(fù)合物，包括鋅指蛋白(zfp)、轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)物(tale)、crispr/cas9、端粒dna結(jié)合蛋白(telomere-bindingproteins，tbp)等；這些分子或復(fù)合物可識別結(jié)合端粒重復(fù)序列，并能激活效應(yīng)基因表達載體上效應(yīng)基因的表達。

所述crispr/cas9包括可靶向結(jié)合端粒重復(fù)序列及其附近序列的引導(dǎo)rna(guidedrna，grna)和無核酸酶活性的cas9(nuclease-deficientcas9；也稱為deadcas9，dcas9)，無核酸酶活性的cas9為dcas9。其中，所述引導(dǎo)rna包括單分子引導(dǎo)rna(single-guidedrna，sgrna)和雙分子引導(dǎo)rna；其中，所述雙分子grna由反式激活crisprrna(trans-activatingcrisprrna)和crisprrna(crisprrna，crrna)兩種組分構(gòu)成；其中，所述sgrna是tracrrna和crrna的人工嵌合體(也稱為singlechimericguiderna)；crispr/cas9系統(tǒng)指dcas9與sgrna的復(fù)合物，即sgrna-dcas9或sgrna/dcas9。

所述dcas9為融合蛋白，包括dcas9部分和融合蛋白部分。其中，dcas9部分包括目前已發(fā)現(xiàn)的經(jīng)人工突變失去核酸內(nèi)切酶活性的cas9蛋白，也包括其他具有類似功能的蛋白(如cpf1、c2c1、c2c2、c2c3、casx、casy、arman-1cas9、arman-4cas9等)，以及其他新發(fā)現(xiàn)的類似功能物。

所述鋅指蛋白、轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)物蛋白和端粒dna結(jié)合蛋白為融合蛋白，包括鋅指蛋白、轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)物蛋白和端粒dna結(jié)合蛋白部分及融合蛋白部分。

所述融合蛋白部分包括各種目前已知轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcriptionactivatingdomain,tad)(如p65、vp16、vp64、vpr等)、具有基因轉(zhuǎn)錄激活功能的其他蛋白(如p300、tet1等)，以及其他新發(fā)現(xiàn)的類似功能物。

具有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的分子或復(fù)合物，包括suntag系統(tǒng)、sam系統(tǒng)、腳手架rna系統(tǒng)等。suntag系統(tǒng)由dcas9-肽表位(peptideepitope)融合蛋白與單鏈可變片段抗體-轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合蛋白構(gòu)成，例如dcas9-肽表位蛋白與scfv-sfgfp-vp64蛋白；其中scfv-sfgfp-vp64為融合sfgfp(superfolder-gfp)和vp64的單鏈可變片段(single-chainvariablefragment，scfv)抗體。其中肽表位也可與tale蛋白形成融合蛋白，實現(xiàn)suntag系統(tǒng)功能。sam系統(tǒng)和腳手架rna系統(tǒng)都由改造的引導(dǎo)rna和與改造的引導(dǎo)rna結(jié)合的蛋白構(gòu)成。其中，改造的引導(dǎo)rna指通過對常規(guī)引導(dǎo)rna序列的加長，使引導(dǎo)rna分子上增加新的序列，這些序列可被其他具有轉(zhuǎn)錄激活功能的蛋白分子結(jié)合，如發(fā)卡核酸配體(hairpinaptamer)序列、腳手架rna(scaffoldrna，scrna)等。其中，與改造的引導(dǎo)rna結(jié)合的蛋白指一類可與改造的引導(dǎo)rna結(jié)合并且具有轉(zhuǎn)錄激活功能的融合蛋白分子，如ms2-vp64、ms2-p65-hsf1、ms2-mcp-vp64、pp7-pcp-vp64、com-com-vp64等。例如由發(fā)卡核酸配體tetraloop(sgrna1.1)、stemloop2(sgrna1.2)與其結(jié)合蛋白ms2-vp64、ms2-p65-hsf1等構(gòu)成的sam系統(tǒng)。

基因轉(zhuǎn)錄激活分子或復(fù)合物，既可以是直接導(dǎo)入細胞的基因轉(zhuǎn)錄激活分子或復(fù)合物，如tale-vp64蛋白或sgrna/dcas9-vp64復(fù)合物，或基因轉(zhuǎn)錄激活分子或復(fù)合物的基因表達載體(包括dna或rna表達載體)，例如向細胞導(dǎo)入tale-vp64或sgrna/dcas9-vp64的基因表達載體，這些載體在細胞內(nèi)可表達產(chǎn)生tale-vp64蛋白或sgrna/dcas9-vp64復(fù)合物。

其中，步驟(3)所述效應(yīng)基因的表達，其表達產(chǎn)物為rna或蛋白質(zhì)。

所述rna為可引起細胞生理發(fā)生改變的rna。rna包括各種功能類型的rna(如microrna等)，這些rna可引起細胞生理發(fā)生改變。

所述蛋白質(zhì)為可引起細胞生理發(fā)生改變的蛋白質(zhì)或多肽。蛋白質(zhì)包括各種功能類型的蛋白質(zhì)(如cas9、核酸內(nèi)切酶、轉(zhuǎn)座酶、顆粒酶、凋亡酶等)及多肽等；這些蛋白質(zhì)及多肽可引起細胞生理發(fā)生改變，或致細胞死亡。

所述cas9蛋白與引導(dǎo)rna結(jié)合，靶向結(jié)合并切割細胞的端粒dna序列或其他dna序列，引發(fā)細胞生長抑制或死亡；所述tn5蛋白與轉(zhuǎn)入細胞的含有me序列的dna結(jié)合，非靶向性切割細胞dna，引發(fā)生長抑制或細胞死亡；所述核酸內(nèi)切酶特異性或非特異性切割細胞dna，引發(fā)細胞生長抑制或死亡；所述顆粒酶可引發(fā)細胞凋亡，如顆粒酶b；所述凋亡酶可引發(fā)細胞凋亡，如caspase9等。

本發(fā)明所述的端粒酶啟動基因表達方法在制備殺滅腫瘤細胞的藥物中的應(yīng)用。

所述殺滅腫瘤細胞的藥物為將端粒酶啟動基因表達方法所需要的效應(yīng)基因表達載體和可識別結(jié)合端粒重復(fù)序列的基因表達激活系統(tǒng)與病毒載體或納米材料載體包裝，制備成基因治療藥物；或?qū)⑿?yīng)基因表達載體、可識別結(jié)合端粒重復(fù)序列的基因表達激活系統(tǒng)和ho酶或其表達載體，與病毒載體或納米材料載體包裝，制備成基因治療藥物；用于殺滅腫瘤細胞。

所述的腫瘤細胞包括體外培養(yǎng)的腫瘤細胞系/株等，如hepg2、a549、ht-29、hela或skov3細胞等，以及人體內(nèi)自然發(fā)生的腫瘤細胞。

本發(fā)明基于端粒酶的生物學(xué)功能提出了一種被命名為tage(端粒酶啟動基因表達方法telomerase-activatinggeneexpression，tage)的新技術(shù)。端粒酶的生物學(xué)功能是保護細胞的端粒不因dna復(fù)制而縮短，即端粒酶提供一種rna模板，使端粒末端突出的3′單鏈得以聚合延長，產(chǎn)生多重端粒重復(fù)序列(5′-ttaggg-3′)。本發(fā)明正是基于端粒酶的這一特性，將一段攜帶端粒酶識別3′突出單鏈的基因表達載體導(dǎo)入細胞，使端粒酶在細胞內(nèi)結(jié)合并延長該基因載體，在其末端合成雙鏈端粒重復(fù)序列；同時向細胞內(nèi)導(dǎo)入一種基因表達激活系統(tǒng)(如sgrna-dcas9)，使該基因表達激活系統(tǒng)識別并結(jié)合基因表達載體上被端粒酶合成的端粒重復(fù)序列，以此激活基因表達載體上的效應(yīng)基因(如cas9)的表達。該效應(yīng)基因的表達產(chǎn)物，將會對細胞的生理、生存產(chǎn)生嚴重影響，導(dǎo)致細胞生長抑制或死亡。例如，效應(yīng)基因產(chǎn)物cas9蛋白在靶向端粒dna的sgrna的幫助下，切割細胞的端粒序列，造成端粒dna損傷，導(dǎo)致細胞死亡。

有益效果：本發(fā)明充分利用腫瘤細胞的端粒酶活性特征，將端粒酶特有的生物學(xué)功能(即端粒酶可結(jié)合并延長dna分子末端的端粒酶識別序列，合成新的端粒重復(fù)序列)與人工轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控細胞基因表達技術(shù)相結(jié)合，發(fā)展了tage新技術(shù)。tage技術(shù)在細胞中可以有效發(fā)生，人工轉(zhuǎn)錄因子可激活效應(yīng)基因在端粒酶陽性細胞中的表達，效應(yīng)基因的表達產(chǎn)物可有效殺滅腫瘤細胞，本發(fā)明證明tage技術(shù)可用于殺滅腫瘤細胞，而對無端粒酶活性的細胞不產(chǎn)生影響。因此，tage技術(shù)應(yīng)用在制備殺滅腫瘤細胞藥物中，可用于癌癥治療。

附圖說明

圖1tage技術(shù)及其殺滅細胞的原理示意圖；

圖2轉(zhuǎn)錄激活物sgrna-dcas9用于tage技術(shù)及其殺滅細胞原理示意圖；

圖3酵母ho酶用于tage技術(shù)及其殺滅細胞原理示意圖；

圖4轉(zhuǎn)錄激活物tale用于tage技術(shù)及其殺滅細胞原理示意圖；

圖5細胞內(nèi)端粒酶合成端粒dna實驗；

圖6tage技術(shù)激活效應(yīng)基因gfp表達實驗(293t細胞)；

圖7tage技術(shù)激活效應(yīng)基因gfp表達實驗(hepg2細胞)；

圖8tage技術(shù)激活效應(yīng)基因gfp表達實驗(mrc-5細胞)；

圖9tage技術(shù)殺滅腫瘤細胞實驗(293t細胞)；

圖10tage技術(shù)殺滅腫瘤細胞實驗(hepg2細胞)；

圖11tage技術(shù)殺滅腫瘤細胞實驗(a549細胞)；

圖12tage技術(shù)殺滅腫瘤細胞實驗(ht-29細胞)；

圖13tage技術(shù)殺滅腫瘤細胞實驗(hela細胞)；

圖14tage技術(shù)殺滅腫瘤細胞實驗(skov3細胞)；

圖15tage技術(shù)殺滅腫瘤細胞實驗(mrc-5細胞)；

圖16tage技術(shù)殺滅腫瘤細胞實驗(阿爾瑪藍分析)；

圖17靶向端粒dna的sgrna-cas9切割端粒實驗(hepg2細胞)；

圖18靶向端粒dna的sgrna-cas9切割端粒實驗(mrc-5細胞)；

圖19靶向端粒dna的sgrna-cas9切割端粒實驗(293t細胞)；

圖20靶向端粒dna的sgrna-cas9切割端粒實驗(阿爾瑪藍分析)；

圖21ho酶用于tage技術(shù)實驗1(293t細胞)；

圖22ho酶用于tage技術(shù)實驗2(293t細胞)；

圖23tale用于tage技術(shù)實驗(293t細胞)。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1

如圖1所示，圖示說明端粒酶啟動基因表達方法的原理及流程。

端粒酶啟動基因表達方法：

(1)將含有端粒識別序列的核酸分子與載體序列相連，構(gòu)建出攜帶有端粒酶識別序列的基因表達載體并導(dǎo)入細胞，端粒酶在細胞內(nèi)結(jié)合并延長該基因表達載體，在其末端合成的端粒重復(fù)序列；

(2)同時向細胞導(dǎo)入可識別結(jié)合端粒重復(fù)序列的基因表達激活系統(tǒng)；

(3)基因表達激活系統(tǒng)識別并結(jié)合端粒重復(fù)序列，激活基因表達載體上效應(yīng)基因的表達。

實施例2

如圖2所示，圖示說明以crispr/cas9系統(tǒng)(sgrna/dcas9-vp64)為轉(zhuǎn)錄激活物實現(xiàn)端粒酶啟動基因表達方法的原理及流程。

(1)將含有端粒識別序列的外源核酸分子與載體序列相連，構(gòu)建出攜帶有酶端粒識別序列的基因表達載體并導(dǎo)入細胞，端粒酶在細胞內(nèi)結(jié)合并延長該基因表達載體，在其末端合成的端粒重復(fù)序列；

(2)同時向細胞導(dǎo)入可識別結(jié)合端粒重復(fù)序列的基因表達激活系統(tǒng)sgrna/dcas9-vp64；

(3)sgrna/dcas9-vp64識別并結(jié)合端粒重復(fù)序列，激活基因表達載體上效應(yīng)基因的表達。

實施例3

如圖3所示，圖示說明利用ho酶切割效應(yīng)基因表達載體上的ho識別序列，以此實現(xiàn)端粒酶啟動基因表達方法的原理及流程。

實施例4與實施例2步驟相同，不同在于步驟(2)導(dǎo)入細胞的基因表達載體除可表達轉(zhuǎn)錄激活物外，還可表達ho酶；所表達的ho酶可切割效應(yīng)基因表達載體上的ho識別序列，產(chǎn)生端粒酶可識別的粘性末端。

實施例4

如圖4所示，圖示說明以tale系統(tǒng)(tale-vp64)為轉(zhuǎn)錄激活物實現(xiàn)端粒酶啟動基因表達方法的原理及流程。

實施例3與實施例2步驟相同，不同在于步驟(2)導(dǎo)入細胞的基因表達激活系統(tǒng)為tale-vp64。

實施例5

1、細胞內(nèi)端粒酶合成實驗

本實驗的目的是論證在人工導(dǎo)入細胞的dna分子的末端可否發(fā)生端粒酶合成。

構(gòu)建載體：

[1]stmep：為一線性dna片段(線性表達載體)，其序列構(gòu)成為(5′→3′)：端粒酶識別序列-最小啟動子序列-egfp序列-pa(polya序列)；其中端粒酶識別序列為3′突出單鏈，序列seqidno1為：3′-ttgagacgagctgcctaagg-5′。理論上端粒酶可結(jié)合到該載體的3′突出單鏈上，并由此聚合延長，合成由大量串聯(lián)重復(fù)端粒dna構(gòu)成的新的雙鏈dna序列。

stmep：s，stickend(粘性末端)；t，telomeraserecognitionsequence(端粒酶識別序列)；m，minimalpromoter(最小啟動子序列)；e，egfp(綠色熒光蛋白編碼序列)；pa，polya(多聚a)。

[2]btmep：為一線性dna片段(線性表達載體)，其序列同stmep，但3′端為平末端，無3′端端粒酶識別3′突出單鏈。該dna片段作為stmep的陰性對照。因無3′端端粒酶識別3′突出單鏈，端粒酶不能結(jié)合該載體，也無法合成新的端粒dna序列。所以該載體作為stmep的陰性對照。

btmep：b，bluntend(平末端)。

[3]sgrna：該實驗中特指靶向人端粒dna序列的單引導(dǎo)rna(singleguidedrna，sgrna)。本實驗中構(gòu)建一單獨真核表達載體(質(zhì)粒)，sgrna在細胞內(nèi)由u6啟動子負責(zé)轉(zhuǎn)錄合成。

[4]dcas9：該實驗中指融合轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域vp64的突變掉內(nèi)切酶活性的cas9蛋白。dcas9可視為一種可借助sgrna激活基因表達的人工轉(zhuǎn)錄因子。本實驗中構(gòu)建一單獨真核表達載體(質(zhì)粒)，dcas9在細胞內(nèi)由cmv(巨細胞病毒)啟動子負責(zé)轉(zhuǎn)錄合成。

dcas9蛋白可與sgrna結(jié)合，形成sgrna-dcas9復(fù)合物，該復(fù)合物可借助sgrna識別并結(jié)合其靶序列(這里指人端粒dna序列)。

轉(zhuǎn)染細胞：

本實驗選擇使用293t、hepg2、mrc-5三種細胞，選擇依據(jù)為：

[1]hek293(humanembryonickidneycells293，人胚胎腎細胞)細胞比較容易轉(zhuǎn)染，是一個很常用的表達研究外源基因的細胞株。293細胞系是原代人胚腎細胞轉(zhuǎn)染5型腺病毒(ad5)dna的永生化細胞，表達轉(zhuǎn)染的腺病毒5的基因。293t細胞表達e1a蛋白，s40大t抗原，含有s40復(fù)制起始點與啟動子區(qū)的質(zhì)?？梢詮?fù)制。293t/17的轉(zhuǎn)染效率更高，成為研究基因功能的一個強大工具。293t細胞是實驗室中用于研究基因轉(zhuǎn)染最常用的細胞，具有很高的轉(zhuǎn)染效率；該細胞是人胚胎腎細胞轉(zhuǎn)染大t抗原后形成的一種細胞，可用于腺病毒包裝。因已有不少文獻報道，293t細胞胞內(nèi)具有端粒酶活性(據(jù)測定每個293t細胞約含有240個端粒酶單體；nucleicacidsresearch2014,42(13):8565–8577)，本實驗中視為具有端粒酶活性的非腫瘤細胞，同時用于監(jiān)控每次的細胞轉(zhuǎn)染實驗試劑及操作。

[2]hepg2細胞是人肝癌細胞株(購于中科院上海細胞庫)，是肝癌研究中用得最廣泛的細胞。經(jīng)大量實驗檢測分析，其胞內(nèi)具有很高的端粒酶活性，本實驗中作為端粒酶陽性細胞。

[3]mrc-5是人胚肺成纖維細胞(購于中科院上海細胞庫)。經(jīng)大量實驗檢測分析，其胞內(nèi)無端粒酶活性，本實驗中作為端粒酶陰性細胞。

轉(zhuǎn)染試劑：

脂質(zhì)體(lipofectin)，購于invitrogen。

實驗操作：

[1]細胞培養(yǎng)：293t、hepg2、mrc-5細胞培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)使用deme(hyclone；下同)(293t與hepg2)或rpmi1640(hyclone；下同)(mrc-5)培養(yǎng)基、胎牛血清(hyclone)、5％co2等標(biāo)準細胞培養(yǎng)條件；細胞復(fù)蘇后，按同等密度(0.5×10⁵/孔)接種到24孔微孔板中，培養(yǎng)過夜貼壁后，進行轉(zhuǎn)染。

[2]細胞轉(zhuǎn)染：細胞培養(yǎng)液換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1小時(h)。分別用stmep、btmep、stmep+sgrna-dcas9轉(zhuǎn)染三種細胞。空脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的細胞作為轉(zhuǎn)染對照。每孔細胞的總dna用量及脂質(zhì)體用量參考脂質(zhì)體產(chǎn)品說明書進行。dna-脂質(zhì)體加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4h。換為含血清新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

[3]細胞觀察：用倒置熒光顯微鏡(olympusix51-dpi71)觀測拍照各種處理的細胞，主要觀察細胞生長情況，如生長旺盛、貼壁良好、無污染等。

[4]dna提取：胰酶消化收集各種處理的細胞，用基因組dna提取試劑盒(天根)按試劑盒說明提取各種處理的細胞的基因組dna(genomicdna，gdna)。

[5]dna質(zhì)檢：所提gdna的水平瓊脂糖凝膠電泳檢測及紫外分光光度(nanodrop)測定純度、濃度。

[6]pcr擴增：用端粒dna檢測引物(seqidno2：ts：5′-aatccgtcgagcagagtt-3′；seqidno3：cx：5'-cccttacccttacccttaccctaa-3′)、taq酶(takara)、taq酶緩沖液(takara)、dntp(各2.5mm,takara)、gdna建立pcr反應(yīng)，并設(shè)置pcr陰性對照(不含gdna模板的pcr反應(yīng))。擴增程序：94℃5min；35個循環(huán)：94℃30s，58℃30s，72℃1min45s；72℃8min；4℃保存。

[7]dna電泳：將pcr產(chǎn)物用水平瓊脂糖凝膠電泳，在對凝膠進行凝膠成像系統(tǒng)成像，獲得電泳圖片。

[8]dna測序：將水平瓊脂糖凝膠上pcr擴增產(chǎn)物進行膠回收，做t載體克隆，用t載體通用引物進行序列測定。

實驗結(jié)果：

實驗結(jié)果如圖5所示。

本實驗采用的pcr引物為檢測細胞端粒酶常用方法端粒重復(fù)序列擴增法(telomererepeatamplificationprotocol，trap)實驗的pcr引物。trap實驗中提供一dna片段，該片段的3′末端為人端粒酶可識別結(jié)合的單鏈區(qū)(seqidno4：5′-aatccgtcgagcagagtt-3′)；檢測細胞端粒酶活性時，首先將細胞的核蛋白提取出來，將trapdna片段與核蛋白共孵育，在端粒酶的作用下，trapdna片段末端合成新的端粒dna重復(fù)序列，之后用一對pcr引物(seqidno2：ts：5′-aatccgtcgagcagagtt-3′；seqidno3：cx：5'-cccttacccttacccttaccctaa-3′)對合成的dna進行pcr擴增，pcr產(chǎn)物用聚丙烯酰胺電泳檢測，可看到梯狀dna條帶，據(jù)此判斷細胞內(nèi)的端粒酶活性。需說明的是，trap引物并不能擴增細胞本身的端粒dna，因為細胞本身的端粒dna上無trap引物之一(ts)的退火位點。同時證實若使用對照細胞(圖5，lipofectin)的gdna進行trap引物的pcr擴增，不會產(chǎn)生pcr產(chǎn)物。

本實驗將3′末端帶有人端粒酶識別單鏈區(qū)的已線性dna，即stmep，轉(zhuǎn)入細胞，若細胞內(nèi)有端粒酶活性，且端粒酶成功識別stmepdna，并在該dna的末端合成新的端粒dna重復(fù)序列，則提取細胞dna后用trap引物進行擴增，則應(yīng)擴增出端粒dna。若細胞內(nèi)無端粒酶活性，或端粒酶未成功識別stmepdna并在其末端合成新的端粒dna重復(fù)序列，則擴增不出產(chǎn)物。

實驗結(jié)果表明，凡用導(dǎo)入stmepdna(stmep、stmep+sgrna-dcas9)的端粒酶陽性細胞(293t與hepg2)的gdna做模板時，均擴增出產(chǎn)物(圖5)，產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上呈彌散狀(smear)，這與常規(guī)trap檢測結(jié)果是一致的。而作為stmep對照的btmep，引物端粒酶合成位點，既是轉(zhuǎn)染端粒酶陽性細胞(293t與hepg2)，也不產(chǎn)生pcr產(chǎn)物。這與實驗預(yù)期是一致的。此外，當(dāng)轉(zhuǎn)染端粒酶陰性細胞(mrc-5)時，所有轉(zhuǎn)染均不產(chǎn)生pcr產(chǎn)物。

pcr擴增產(chǎn)物的測序分析表明，pcr擴增產(chǎn)物確是人端粒dna重復(fù)序列，進一步說明在stmepdna的末端發(fā)生了胞內(nèi)端粒酶合成反應(yīng)。

這些結(jié)果，充分說明本實驗設(shè)計的人工導(dǎo)入細胞的dna分子的末端可發(fā)生端粒酶合成。這種合成僅發(fā)生在端粒酶陽性細胞內(nèi)，是一種端粒酶活性特異的胞內(nèi)dna合成反應(yīng)。

實施例6

端粒酶啟動的基因表達系統(tǒng)驗證

本實驗的目的是論證tage技術(shù)能否在真核細胞內(nèi)發(fā)生。

構(gòu)建載體：

[1]stmep：同實施例5。

[2]btmep：同實施例5。

[3]sgrna：同實施例5。

[4]dcas9：同實施例5。

[5]c1-egfp：為一真核表達載體，在cmv啟動子作用下表達綠色熒光蛋白。該載體在本實驗中用于監(jiān)控轉(zhuǎn)染，以表明轉(zhuǎn)染試劑和操作正確、成功。

轉(zhuǎn)染細胞：

本實驗仍使用293t、hepg2、mrc-5三種細胞，理由同實施例5。

轉(zhuǎn)染試劑：

脂質(zhì)體(lipofectin)，購于invitrogen。

轉(zhuǎn)染實驗：

[1]細胞培養(yǎng)：293t、hepg2、mrc5細胞培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)使用deme(293t、hepg2)或rpmi1640培養(yǎng)基(mrc5)、胎牛血清(hyclone)、5％co2等標(biāo)準細胞培養(yǎng)條件；細胞復(fù)蘇后，按同等密度(0.5×10⁵/孔)接種到24孔微孔板中，培養(yǎng)過夜貼壁后，進行轉(zhuǎn)染。

[2]細胞轉(zhuǎn)染：細胞培養(yǎng)液換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1h。分別用c1-egfp、stmep、stmep+sgrna、stmep+dcas9、btmep+sgrna-dcas9、stmep+sgrna-dcas9轉(zhuǎn)染三種細胞?？罩|(zhì)體轉(zhuǎn)染的細胞作為轉(zhuǎn)染對照。每孔細胞的總dna用量及脂質(zhì)體用量參考脂質(zhì)體產(chǎn)品說明書進行。dna-脂質(zhì)體加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4h。換為含血清新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

[3]細胞觀察：用倒置熒光顯微鏡(olympusix51-dpi71)觀測拍照各種處理的細胞，主要觀察細胞是否產(chǎn)生綠色熒光；同時觀察細胞生長情況，如生長旺盛、貼壁良好、無污染等。對各種處理的細胞進行多視野明場及綠色熒光蛋白觀察通道的照相拍攝。

[4]流式測定：胰酶消化收集各種處理的細胞，用流式儀檢測分析細胞的熒光有無及強度。

實驗結(jié)果：

實驗結(jié)果如圖6～8所示。

上面的實驗表明，只要人工導(dǎo)入細胞的dna分子的末端具有端粒酶識別序列，則細胞內(nèi)端粒酶可結(jié)合該端粒酶識別序列，進而合成出新的端粒重復(fù)序列。在上面所用的stmep分子上，在端粒酶識別序列(seqidno1：3′-ttgagacgagctgcctaagg-5′)后，設(shè)計了一個最小啟動子序列，其序列seqidno5為：5′-ttcgcatattaaggtgacgcgtgtggcctcgaacaccgagcgaccctgcagcgacccgcttaa-3′。最小啟動子序列提供了tata盒等基本元件，為rna聚合酶ii(polii)與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子(如tfiid等)的結(jié)合部分。

在本實驗中，設(shè)計了一個靶向人端粒dna序列的人工轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)，即向人端粒dna序列的sgrna(靶序列seqidno6為：3′-atcccaatcccaatcccaat-5′)與dcas9；當(dāng)將sgrna與dcas9表達載體導(dǎo)入細胞后，表達產(chǎn)生sgrna-dcas9復(fù)合物，該復(fù)合物可識別結(jié)合端粒dna序列，如stmep上新合成的端粒dna。當(dāng)sgrna-dcas9復(fù)合物與stmep上新合成的端粒dna結(jié)合時，則dcas9蛋白上融合的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域vp64可作用于最小啟動子上結(jié)合的基本轉(zhuǎn)錄機器(polii與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子的復(fù)合體)，激活最小啟動子下游基因(本實驗中編碼綠色熒光蛋白egfp的基因)的表達，使共導(dǎo)入stmep、sgrna及dcas9分子的細胞產(chǎn)生綠色熒光。

而導(dǎo)入對照載體btmep的細胞，即使同時導(dǎo)入sgrna與dcas9表達載體(btmep、sgrna、dcas9共轉(zhuǎn)染)，也因無法合成新的端粒dna序列，btmep載體上不能出現(xiàn)sgrna-dcas9的靶點，而無法激活下游基因egfp的表達，細胞因此不產(chǎn)生綠色熒光。此外，理論上，只有stmep、sgrna及dcas9三種載體分子共同轉(zhuǎn)染的細胞才會產(chǎn)生綠色熒光，而導(dǎo)入stmep與sgrna、stmep與dcas9的細胞都不會產(chǎn)生綠色熒光。

本實驗結(jié)果表明，共轉(zhuǎn)染stmep、sgrna及dcas9載體的細胞中，端粒酶陽性細胞hepg2與293t細胞中均出現(xiàn)綠色熒光，而端粒酶陰性細胞mrc-5不出現(xiàn)綠色熒光(圖6～8)。在三種細胞中，其他對照轉(zhuǎn)染(包括btmep+sgrna-dcas9，stmep+sgrna，stmep+dcas9)均不產(chǎn)生綠色熒光(圖6～8)。實驗結(jié)果符合預(yù)期，即tage技術(shù)可在端粒酶陽性細胞中表達目的基因，而在端粒酶陰性細胞中不表達目的基因。

實施例7

端粒酶啟動的基因表達系統(tǒng)殺滅腫瘤細胞驗證，tage技術(shù)及其殺滅細胞的原理示意圖如圖1所示。

本實驗的目的是論證端粒酶活性特異的基因轉(zhuǎn)錄表達系統(tǒng)能否用于殺滅腫瘤細胞。

構(gòu)建載體：

[1]stmcp：為一線性dna片段(線性表達載體)，其序列構(gòu)成為(5′→3′)：端粒酶識別序列-最小啟動子序列-cas9編碼序列-pa(polya序列)。該線性載體相當(dāng)于將stmep中的egfp編碼序列替換為cas9蛋白編碼學(xué)列，其他序列解結(jié)構(gòu)完全同stmep載體。

stmcp：s，stickend(粘性末端)；t，telomeraserecognitionsequence(端粒酶是識別序列)；m，minimalpromoter(最小啟動子序列)；c，cas9(cas9蛋白編碼基因)；p，polya(多聚a)。

[2]btmcp：為一線性dna片段(線性表達載體)，其序列結(jié)構(gòu)及組成同stmcp，但3′端為平末端，無3′端端粒酶識別3′突出單鏈。該dna片段作為stmcp的陰性對照。因無3′端端粒酶識別3′突出單鏈，端粒酶不能結(jié)合該載體，也無法合成新的端粒dna序列。因此，sgrna-dcas9-vp64復(fù)合物在該載體上沒有結(jié)合靶點，不結(jié)合該載體，從而無法啟動下游報告基因的轉(zhuǎn)錄，則細胞不顯示綠色熒光。所以該載體作為stmcp的陰性對照。btmcp：b，bluntend(平末端)。

[3]sgrna：同實施例5。

[4]dcas9：同實施例5。

[5]c1-egfp：同實施例6。

轉(zhuǎn)染細胞：

本實驗使用293t、hepg2、a549、ht-29、hela、skov3及mrc-57種細胞，選擇依據(jù)為：

293t(腎上皮細胞)、hepg2(肝癌細胞)、mrc-5(胚肺成纖維細胞)的使用理由同上。hela為人宮頸癌細胞、skov3為人卵巢癌細胞、a549為非小細胞肺癌細胞、ht-29為人結(jié)腸癌細胞。這些癌細胞代表了常見的不同臟器的癌癥。

轉(zhuǎn)染試劑：

脂質(zhì)體(lipofectin)。

實驗操作：

[1]細胞培養(yǎng)：293t、hepg2、a549、ht-29、hela、skov3及mrc5細胞培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)使用deme(293t、hela、hepg2)或rpmi1640培養(yǎng)基(a549、ht-29、skov3、mrc5)、胎牛血清(hyclone)、5％co2等標(biāo)準細胞培養(yǎng)條件；細胞復(fù)蘇后，按同等密度(0.5×10⁵/孔)接種到24孔微孔板中，培養(yǎng)過夜貼壁后，進行轉(zhuǎn)染。

[2]細胞轉(zhuǎn)染：細胞培養(yǎng)液換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1h。分別用c1-egfp、stmcp、stmcp+sgrna、stmcp+dcas9、btmcp+sgrna-dcas9、stmcp+sgrna-dcas9轉(zhuǎn)染上述細胞?？罩|(zhì)體轉(zhuǎn)染的細胞作為轉(zhuǎn)染對照。每孔細胞的總dna用量及脂質(zhì)體用量參考脂質(zhì)體產(chǎn)品說明書進行。dna-脂質(zhì)體加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4h。換為含血清新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

[3]細胞觀察：用倒置熒光顯微鏡(olympusix51-dpi71)觀測拍照各種處理的細胞，主要觀察細胞是否產(chǎn)生綠色熒光；同時觀察細胞生長情況，如生長旺盛、貼壁良好、無污染等。對各種處理的細胞進行多視野明場及綠色熒光蛋白觀察通道的照相拍攝。

[4]細胞染色：吖啶橙染色按吖啶橙產(chǎn)品說明(索萊寶；北京)進行(室溫染色10min)。染色后細胞用pbs洗滌。

[5]細胞觀察：用倒置熒光顯微鏡(olympusix51-dpi71)觀測拍照各種處理的細胞。對各種處理的細胞進行多視野明場及綠色熒光蛋白觀察通道的照相拍攝。

[6]增殖測定：按上述程序，重新培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染一批細胞，將細胞增殖檢測試劑阿爾瑪藍(alamarblue)(購自上海翊圣生物科技有限公司；yeasen)在轉(zhuǎn)染后4h加入細胞培養(yǎng)液(100μl培養(yǎng)基加10μl阿爾瑪藍)，細胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染后24h，用酶標(biāo)儀(biotek)測定熒光強度(激發(fā)：530nm；發(fā)射：590nm)；以阿爾瑪藍產(chǎn)品說明書計算各種處理細胞的增殖率。

實驗結(jié)果：

實驗結(jié)果如圖9～16所示。

上面的實驗表明，tage技術(shù)可在端粒酶陽性細胞中表達效應(yīng)基因，而在端粒酶陰性細胞中不表達效應(yīng)基因。外源目的基因的表達賦予端粒酶陽性細胞一種新的性狀，例如在該實驗中就是端粒酶陽性細胞產(chǎn)生綠色熒光。因此，隨著外源效應(yīng)基因的表達，端粒酶陽性細胞會產(chǎn)生新性狀，如致死。惡性腫瘤細胞就是典型的端粒酶陽性細胞，讓惡性腫瘤細胞生長抑制或致死，是醫(yī)學(xué)治療癌癥中施以千方百計欲達成的目的。因此，期望用上述實驗已經(jīng)證明的tage技術(shù)抑制腫瘤細胞的生長或致其死亡。

在本實驗中，上述stmep載體的基礎(chǔ)上，將egfp基因替換為cas9蛋白基因，構(gòu)建了stmcp載體。當(dāng)將stmep、sgrna與dcas9載體分子共轉(zhuǎn)染細胞后，sgrna與dcas9載體表達產(chǎn)生sgrna-dcas9復(fù)合物可與stmcp上新合成的端粒dna發(fā)生結(jié)合。dcas9蛋白上融合的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域vp64繼而作用于最小啟動子上結(jié)合的基本轉(zhuǎn)錄機器(polii與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子的復(fù)合體)，激活最小啟動子下游cas9基因的表達，使共導(dǎo)入stmcp、sgrna及dcas9載體分子的細胞產(chǎn)生cas9蛋白。該蛋白可與細胞中已表達的靶向端粒dna的sgrna結(jié)合，形成靶向端粒dna的sgrna-cas9復(fù)合物。該復(fù)合物與細胞端粒dna解結(jié)合可導(dǎo)致端粒dna的切割，造成端粒dna損傷，從而引發(fā)細胞死亡。

而導(dǎo)入對照載體btmcp的細胞，即使同時導(dǎo)入sgrna與dcas9表達載體(btmcp、sgrna、dcas9共轉(zhuǎn)染)，也因無法合成新的端粒dna序列，btmcp載體上不能出現(xiàn)sgrna-dcas9的靶點，而無法激活下游基因cas9的表達，細胞因此不產(chǎn)生cas9蛋白，細胞相應(yīng)也不會死亡。此外，理論上，只有stmcp、sgrna及dcas9三種載體分子共同轉(zhuǎn)染的細胞才發(fā)生死亡，而導(dǎo)入stmcp與sgrna、stmcp與dcas9的細胞都不發(fā)生死亡。

本實驗結(jié)果表明，共轉(zhuǎn)染stmcp、sgrna及dcas9載體的細胞中，端粒酶陽性細胞hepg2、a549、ht-29、hela及skov3均發(fā)生顯著死亡，而端粒酶陰性細胞mrc-5不發(fā)生死亡(圖9～16)。在這些細胞中，其他對照轉(zhuǎn)染(包括btmcp+sgrna-dcas9，stmcp+sgrna，stmcp+dcas9)均不發(fā)生死亡(圖9～16)。用吖啶橙染色顯微觀測的結(jié)果與阿爾瑪藍(alamarblue)定量測定的結(jié)果一致。實驗結(jié)果符合預(yù)期，即端粒酶活性特異的基因轉(zhuǎn)錄表達系統(tǒng)可用于殺滅腫瘤細胞。

本實驗中，表現(xiàn)端粒酶陽性的293t細胞并未發(fā)生顯著的死亡。因hek293細胞是來源于體外培養(yǎng)的正常人胚腎組織，后再傳代培養(yǎng)中進行了大量的腺病毒轉(zhuǎn)染，獲得可連續(xù)傳代的293細胞系，此期間的病毒轉(zhuǎn)染可能激活了其端粒酶活性，但其端粒dna結(jié)構(gòu)可能與惡性腫瘤細胞仍存在很大的差異，因此未被本實驗所使用的系統(tǒng)所殺滅。這從另一個側(cè)面反映，本實驗所使用的系統(tǒng)具有很好的惡性腫瘤細胞特異性。此外，人體內(nèi)也自然存在一些端粒酶活性陽性的非腫瘤細胞，如干細胞、分裂旺盛的上皮細胞等，293t細胞的表現(xiàn)，可能預(yù)示本實驗所使用的腫瘤殺滅系統(tǒng)不會對這些非腫瘤細胞產(chǎn)生顯著影響。

293細胞的缺陷是生長過程中貼壁強度比較小。所以在實驗過程中容易流失，從而影響實驗結(jié)果。實驗中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)用吖啶橙色時，會導(dǎo)致293t大量脫壁，因此未獲得293t細胞的吖啶橙色圖像(圖9)。

實施例8

利用crispr/cas9系統(tǒng)(即sgrna-dcas9)直接切割端粒dna實驗，轉(zhuǎn)錄激活物sgrna-dcas9用于tage技術(shù)及其殺滅細胞原理示意圖如圖2所示。

本實驗的目的是論證端粒酶活性特異的基因轉(zhuǎn)錄表達系統(tǒng)能否用否用于殺滅腫瘤細胞。

構(gòu)建載體：

[1]sgrna-cas9：為一質(zhì)粒表達載體，其中有u6啟動子控制的靶向人端粒dna序列的sgrna表達序列，以及cmv啟動子控制的cas9-2a-egfp蛋白表達序列。sgrna靶序列seqidno7為：5′-taaccctaaccctaacccta-3′；sgrna序列seqidno8為：5′-tagggttagggttagggtta-3′。

[2]c1-egfp：同實施例6。

轉(zhuǎn)染細胞：

293t、hepg2、mrc5。選擇原因同實施例5。

轉(zhuǎn)染試劑：

脂質(zhì)體(lipofectin)。

實驗操作：

[1]細胞培養(yǎng)：293t、hepg2及mrc5細胞培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)使用deme(293t、hepg2)或rpmi1640培養(yǎng)基(mrc5)、胎牛血清(hyclone)、5％co2等標(biāo)準細胞培養(yǎng)條件；細胞復(fù)蘇后，按同等密度(0.5×10⁵/孔)接種到24孔微孔板中，培養(yǎng)過夜貼壁后，進行轉(zhuǎn)染。

[2]細胞轉(zhuǎn)染：細胞培養(yǎng)液換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1h。分別用c1-egfp、sgrna-cas9轉(zhuǎn)染上述細胞?？罩|(zhì)體轉(zhuǎn)染的細胞作為轉(zhuǎn)染對照。每孔細胞的總dna用量及脂質(zhì)體用量參考脂質(zhì)體產(chǎn)品說明書進行。dna-脂質(zhì)體加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4h。換為含血清新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

[3]細胞觀察：用倒置熒光顯微鏡(olympusix51-dpi71)觀測拍照各種處理的細胞，主要觀察細胞是否產(chǎn)生綠色熒光；同時觀察細胞生長情況，如生長旺盛、貼壁良好、無污染等。對各種處理的細胞進行多視野明場及綠色熒光蛋白觀察通道的照相拍攝。

[4]細胞染色：吖啶橙染色按吖啶橙產(chǎn)品說明(索萊寶；北京)進行(室溫染色10min)。染色后細胞用pbs洗滌。

[5]細胞觀察：用倒置熒光顯微鏡(olympusix51-dpi71)觀測拍照各種處理的細胞。對各種處理的細胞進行多視野明場及綠色熒光蛋白觀察通道的照相拍攝。

實驗結(jié)果：

實驗結(jié)果如圖17～20所示。

本實驗中向細胞直接導(dǎo)入一端粒dna靶向sgrna和cas9蛋白共表達質(zhì)粒載體，該載體可在細胞內(nèi)表達sgrna及dcas9蛋白，二者形成靶向端粒dna的sgrna-cas9復(fù)合物。該復(fù)合物與細胞端粒dna結(jié)合可導(dǎo)致端粒dna的切割，造成端粒dna損傷，從而引發(fā)細胞死亡。

本實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染sgrna-cas9共表達載體的細胞中，端粒酶陽性細胞hepg2發(fā)生顯著死亡，而端粒酶陰性細胞mrc-5不發(fā)生死亡(圖17～18)。這種情況與上面的端粒酶活性特異基因表達系統(tǒng)取得的結(jié)果是一致，進一步說明上面的端粒酶活性特異基因表達系統(tǒng)作用的機理就是通過造成端粒dna的切割損傷而引發(fā)細胞死亡。

與上一個實驗相似的是，轉(zhuǎn)染sgrna-cas9共表達載體的端粒酶陽性293t細胞也未發(fā)生顯著的死亡(圖19)。這一結(jié)果證明了，即正常腎上皮細胞的293t細胞，即使其端粒酶活性因病毒感染等激活，但其端粒dna結(jié)構(gòu)與惡性腫瘤細胞存在很大的差異，因此不能被靶向端粒dna的sgrna-cas9復(fù)合物有效切割而致細胞死亡。本實驗進一步說明端粒酶活性特異基因表達系統(tǒng)所表達產(chǎn)生的端粒dna靶向sgrna-cas9復(fù)合物，對腫瘤細胞具有特異性，而對具有端粒酶活性的非腫瘤正常人體細胞不產(chǎn)生顯著影響。

在三種細胞中，用吖啶橙染色顯微觀測的結(jié)果(圖17～19)與阿爾瑪藍定量測定的結(jié)果(圖20)是一致的。

實施例9

hosite-tmep轉(zhuǎn)染實驗，酵母ho酶用于tage技術(shù)及其殺滅細胞原理示意圖如圖3所示。

本實驗的目的是論證ho酶產(chǎn)生的粘性末端用于tage技術(shù)。

構(gòu)建載體：

[1]shosite-tmep：末端含有ho酶切點3′單鏈突出的(3′-ttgt-5′)的線性載體，其他結(jié)構(gòu)及序列同上述stmep載體，如最小啟動子序列、egfp序列、polya序列。

[2]bhosite-tmep：含有平末端(將shosite-tmep的3′單鏈突出序列3′-ttgt-5′轉(zhuǎn)換為雙鏈)、最小啟動子序列、egfp序列及polya序列的線性載體。本實驗中作為shosite-tmep載體的陰性對照。

[3]sgrna：同實施例5。

[4]dcas9：同實施例5。

轉(zhuǎn)染細胞：

293t細胞。

轉(zhuǎn)染試劑：

脂質(zhì)體(lipofectin)

實驗操作：

[1]細胞培養(yǎng)：293t細胞培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)使用deme培養(yǎng)基、胎牛血清(hyclone)、5％co2等標(biāo)準細胞培養(yǎng)條件；細胞復(fù)蘇后，按同等密度(0.5×105/孔)接種到24孔微孔板中，培養(yǎng)過夜貼壁后，進行轉(zhuǎn)染。

[2]細胞轉(zhuǎn)染：細胞培養(yǎng)液換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1h。分別用c1-egfp、shosite-tmep、shosite-tmep+sgrna、shosite-tmep+dcas9、bhosite-tmep+sgrna-dcas9、shosite-tmep+sgrna-dcas9轉(zhuǎn)染293t細胞?？罩|(zhì)體轉(zhuǎn)染的細胞作為轉(zhuǎn)染對照。每孔細胞的總dna用量及脂質(zhì)體用量參考脂質(zhì)體產(chǎn)品說明書進行。dna-脂質(zhì)體加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4h。換為含血清新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

[3]細胞觀察：用倒置熒光顯微鏡(olympusix51-dpi71)觀測拍照各種處理的細胞，主要觀察細胞是否產(chǎn)生綠色熒光；同時觀察細胞生長情況，如生長旺盛、貼壁良好、無污染等。對各種處理的細胞進行多視野明場及綠色熒光蛋白觀察通道的照相拍攝。

實驗結(jié)果：

實驗結(jié)果如圖21所示。

酵母同宗接合切換內(nèi)切酶(homothallicswitchingendonuclease，ho酶)切割其dna靶點序列(如下)可產(chǎn)生3′突出單鏈區(qū)，且該3′突出單鏈區(qū)的3′末端含有3′-ttg-5′，這與上面的實驗中所使用的trap引物(ts)末端的3′-ttg-5′相同。因此，本實驗的目的是論證ho酶產(chǎn)生的粘性末端可否作為端粒酶識別序列用于tage技術(shù)。

ho內(nèi)切酶的識別序列及其切割后產(chǎn)生的粘性末端如下：

seqidno9：5′-tttatgggactacttcgcgcaaca↓gtataa-3′

seqidno10：3′-aaataccctgatgaagcgcg↑ttgtcatatt-5′(↑，↓：斷裂點)

結(jié)果表明，ho酶產(chǎn)生的粘性末端可作為端粒酶識別序列，用于tage技術(shù)。

本實驗的目的是為tage技術(shù)的體內(nèi)應(yīng)用做出探討。病毒載體(如腺病毒、慢病毒、腺相關(guān)病毒)常用體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染，是體內(nèi)應(yīng)用中常用的基因治療載體。但在體內(nèi)使用中，由于粘性末端的線性載體(如上述stmep、stmcp)難以包裝進病毒載體，這種情況下，可將ho內(nèi)切酶表達載體、含有ho內(nèi)切酶的識別序列的效應(yīng)基因(如上面已探討的cas9)表達載體、sgrna-dcas9表達載體等，包裝進病毒載體，以便用病毒載體將tage技術(shù)所用分子導(dǎo)入體內(nèi)細胞，使其在人體內(nèi)細胞中發(fā)揮作用。

當(dāng)然，在納米載體業(yè)已成熟并已大行其道的今天及將來，運用納米載體將使用粘性末端線性載體的tage技術(shù)所用分子導(dǎo)入體內(nèi)細胞并不困難。本實驗所進行的ho酶實驗，提供了一種不使用納米載體，而使用傳統(tǒng)基因治療載體——病毒載體，以實現(xiàn)tage技術(shù)體內(nèi)應(yīng)用的手段。

實施例10

hosite-tmep轉(zhuǎn)染實驗，酵母ho酶用于tage技術(shù)及其殺滅細胞原理示意圖如圖3所示。

本實驗的目的是論證ho酶表達載體在細胞內(nèi)可表達ho酶并可以產(chǎn)生粘性末端，該粘性末端可用于實現(xiàn)tage技術(shù)。

構(gòu)建載體：

[1]shosite-tmep：同實施例9。

[2]bhosite-tmep：末端含有ho酶切點的平末端線性載體，其他結(jié)構(gòu)及序列同上述stmep載體，如最小啟動子序列、egfp序列、polya序列。最小啟動子序列前為雙鏈平末端ho內(nèi)切酶識別序列。ho內(nèi)切酶的識別序列及其切割后產(chǎn)生的粘性末端見實施例9實驗結(jié)果部分的闡述。

[3]sgrna：同實施例5。

[4]dcas9：同實施例5。

[5]c1-ho：cmv啟動子控制的ho酶表達載體。

轉(zhuǎn)染細胞：

293t細胞。

轉(zhuǎn)染試劑：

脂質(zhì)體(lipofectin)

實驗操作：

[1]細胞培養(yǎng)：293t細胞培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)使用deme培養(yǎng)基、胎牛血清(hyclone)、5％co2等標(biāo)準細胞培養(yǎng)條件；細胞復(fù)蘇后，按同等密度(0.5×10⁵/孔)接種到24孔微孔板中，培養(yǎng)過夜貼壁后，進行轉(zhuǎn)染。

[2]細胞轉(zhuǎn)染：細胞培養(yǎng)液換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1h。分別用c1-egfp、shosite-tmep、shosite-tmep+sgrna、shosite-tmep+dcas9、shosite-tmep+sgrna-dcas9、bhosite-tmep+sgrna-dcas9、bhosite-tmep+sgrna-dcas9+c1-ho、c1-ho轉(zhuǎn)染293t細胞。空脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的細胞作為轉(zhuǎn)染對照。每孔細胞的總dna用量及脂質(zhì)體用量參考脂質(zhì)體產(chǎn)品說明書進行。dna-脂質(zhì)體加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4h。換為含血清新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

[3]細胞觀察：用倒置熒光顯微鏡(olympusix51-dpi71)觀測拍照各種處理的細胞，主要觀察細胞是否產(chǎn)生綠色熒光；同時觀察細胞生長情況，如生長旺盛、貼壁良好、無污染等。對各種處理的細胞進行多視野明場及綠色熒光蛋白觀察通道的照相拍攝。

實驗結(jié)果：

實驗結(jié)果如圖22所示。

結(jié)果表明，當(dāng)細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染ho酶表達載體時，可在細胞內(nèi)產(chǎn)生ho酶，并且該酶切割bhosite-tmep載體，產(chǎn)生了shosite-tmep載體。shosite-tmep載體再在sgrna-dcas9的作用下，激活效應(yīng)基因egfp的表達?？梢?，ho酶可切合產(chǎn)生粘性末端，該末端可作為端粒酶識別序列，用于tage技術(shù)。

本實驗的目的同實施例9，是為tage技術(shù)的體內(nèi)應(yīng)用做出探討。

實施例11

人工轉(zhuǎn)錄因子tale在tage技術(shù)中的應(yīng)用，轉(zhuǎn)錄激活物tale用于tage技術(shù)及其殺滅細胞原理示意圖如圖4所示。

本實驗的目的是論證人工轉(zhuǎn)錄因子tale可否用于tage技術(shù)。

構(gòu)建載體：

[1]stmep：同實施例5。

[2]tale：可靶向結(jié)合人端粒dna序列的tale表達載體(質(zhì)粒)。其人端粒dna結(jié)合靶點為：seqidno11：5′-tagggttagggttagggt-3′。

[3]c1-egfp：同實施例6。

轉(zhuǎn)染細胞：

293t細胞。

轉(zhuǎn)染試劑：

脂質(zhì)體(lipofectin)

實驗操作：

[1]細胞培養(yǎng)：293t細胞培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)使用deme培養(yǎng)基、胎牛血清(hyclone)、5％co2等標(biāo)準細胞培養(yǎng)條件；細胞復(fù)蘇后，按同等密度(0.5×10⁵/孔)接種到24孔微孔板中，培養(yǎng)過夜貼壁后，進行轉(zhuǎn)染。

[2]細胞轉(zhuǎn)染：細胞培養(yǎng)液換為無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)1h。分別用c1-egfp、tale、stmep、tale+stmep轉(zhuǎn)染293t細胞?？罩|(zhì)體轉(zhuǎn)染的細胞作為轉(zhuǎn)染對照。每孔細胞的總dna用量及脂質(zhì)體用量參考脂質(zhì)體產(chǎn)品說明書進行。dna-脂質(zhì)體加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)4h。換為含血清新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

[3]細胞觀察：用倒置熒光顯微鏡(olympusix51-dpi71)觀測拍照各種處理的細胞，主要觀察細胞是否產(chǎn)生綠色熒光；同時觀察細胞生長情況，如生長旺盛、貼壁良好、無污染等。對各種處理的細胞進行多視野明場及綠色熒光蛋白觀察通道的照相拍攝。

實驗結(jié)果：

實驗結(jié)果如圖23所示。

融合了轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(如vp64、p65等)的鋅指酶(znf)、轉(zhuǎn)錄因子樣效應(yīng)物(tale)及crispr/cas9(sgrna-dcas9)是近年來廣泛使用的人工轉(zhuǎn)錄因子，被用于激活細胞內(nèi)內(nèi)源性基因的表達。目前，由于crispr(sgrna-dcas9)的簡便性，在該領(lǐng)域使用最流行。上面的實驗已經(jīng)證實，sgrna-dcas9人工轉(zhuǎn)錄因子可用于tage技術(shù)。tale是繼znf之后crispr產(chǎn)生之前而廣泛使用的轉(zhuǎn)錄激活物，由于在某些方面仍較crispr有優(yōu)勢，目前該技術(shù)仍然尚有應(yīng)用。因此，本實驗的目的是論證人工轉(zhuǎn)錄因子tale可否用于tage技術(shù)。

結(jié)果表明，人工轉(zhuǎn)錄因子tale可否用于tage技術(shù)(圖23)。靶向于端粒dna序列的tale蛋白成功激活了報告基因egfp的表達(圖23)。

sequencelisting

<110>東南大學(xué)

<120>一種端粒酶啟動基因表達方法及其應(yīng)用

<130>2017

<160>11

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<213>人工合成

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