本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法、核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置以及核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑。
背景技術(shù)：
：近年來，隨著基因的利用技術(shù)的發(fā)展，基因診斷、基因治療等利用了基因的醫(yī)療備受注目，除此之外在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)領(lǐng)域中，在品種辨別、品種改良中使用了基因的方法也被較多地開發(fā)。作為用于利用基因的技術(shù)，pcr(polymerasechainreaction：聚合酶鏈反應(yīng))法等技術(shù)廣泛普及。今天，pcr法在生物體物質(zhì)的信息解析中成為必不可缺的技術(shù)。pcr法是對包含成為擴(kuò)增的對象的核酸(靶核酸)以及試劑的溶液(反應(yīng)液)實(shí)施熱循環(huán)，從而使靶核酸擴(kuò)增的方法。熱循環(huán)是使兩個階段以上的溫度周期性地施加于反應(yīng)液的處理。在pcr法中，通常實(shí)施兩個階段或者三個階段的熱循環(huán)的方法。例如，在專利文獻(xiàn)1中記載了一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置，其使填充有反應(yīng)液(液滴)以及不與反應(yīng)液混和且比重小于反應(yīng)液的液體(油等)的反應(yīng)容器繞旋轉(zhuǎn)軸旋轉(zhuǎn)，憑借比重差使反應(yīng)液移動并進(jìn)行熱循環(huán)。在專利文獻(xiàn)1中，為了檢測核酸擴(kuò)增，而使用熒光標(biāo)志探針。專利文獻(xiàn)1：日本特開2012-115208號公報然而，要求基于pcr的產(chǎn)物的生成時間的縮短化。然而，在專利文獻(xiàn)1所記載的技術(shù)中，若使pcr的反應(yīng)時間(改性反應(yīng)用的時間、退火反應(yīng)/伸長反應(yīng)用的時間)縮短(若使pcr高速化)，則例如存在核酸與熒光標(biāo)志探針不充分地混合(hybridization)，從而無法高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增的情況。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的幾個方式的目的之一在于提供一種即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增的核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法。另外，本發(fā)明的幾個方式的目的之一在于提供一種即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置。另外，本發(fā)明的幾個方式的目的之一在于提供一種即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑。本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法包含對包含核酸的擴(kuò)增所使用的核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑的反應(yīng)液施加用于使上述核酸擴(kuò)增的熱循環(huán)的工序，在上述熱循環(huán)中，退火反應(yīng)以及伸長反應(yīng)用的加熱時間為1秒以上10秒以下，上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑包含正向引物、反向引物、聚合酶以及熒光標(biāo)志探針，包含于上述反應(yīng)液的上述正向引物的濃度為0.4μm以上3.2μm以下，包含于上述反應(yīng)液的上述反向引物的濃度為0.4μm以上3.2μm以下，包含于上述反應(yīng)液的上述聚合酶的量為0.5u以上4u以下，包含于上述反應(yīng)液的上述熒光標(biāo)志探針的濃度為0.15μm以上1.2μm以下。在上述的核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法中，即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增(詳細(xì)參照后述的“4.實(shí)驗例”)。在本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法中，上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑也可以包含dntp，包含于上述反應(yīng)液的上述dntp的濃度為0.125mm以上1mm以下。在上述的核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法中，即使使pcr高速化，也能夠更加可靠且高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增。在本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法中，也可以是：上述正向引物的濃度為0.8μm以上3.2μm以下，上述反向引物的濃度為0.8μm以上3.2μm以下，上述聚合酶的量為1u以上4u以下，上述熒光標(biāo)志探針的濃度為0.3μm以上1.2μm以下，上述dntp的濃度為0.25mm以上1mm以下。在上述的核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法中，即使使pcr高速化，也能夠更加高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增。在本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法中，也可以是：上述正向引物的濃度為1.6μm以上3.2μm以下，上述反向引物的濃度為1.6μm以上3.2μm以下，上述聚合酶的量為2u以上4u以下，上述熒光標(biāo)志探針的濃度為0.6μm以上1.2μm以下，上述dntp的濃度為0.5mm以上1mm以下。在上述的核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法中，即使使pcr高速化，也能夠進(jìn)一步高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增。在本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法中，也可以是：上述正向引物的濃度為2.4μm以上3.2μm以下，上述反向引物的濃度為2.4μm以上3.2μm以下，上述聚合酶的量為3u以上4u以下，上述熒光標(biāo)志探針的濃度為0.9μm以上1.2μm以下，上述dntp的濃度為0.75mm以上1mm以下。在上述的核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法中，即使使pcr高速化，也能夠進(jìn)一步高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增。本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置包括：安裝部，其收容包含核酸的擴(kuò)增所使用的核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑的反應(yīng)液以及比重與上述反應(yīng)液比重不同且不與上述反應(yīng)液混和的液體，并能夠安裝具有供上述反應(yīng)液移動的流路的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒；溫度梯度形成部，其在上述流路形成溫度梯度；以及移動機(jī)構(gòu)，其以對上述反應(yīng)液施加用于使上述核酸擴(kuò)增的熱循環(huán)的方式使上述反應(yīng)液移動，上述移動機(jī)構(gòu)在上述熱循環(huán)中，以退火反應(yīng)以及伸長反應(yīng)用的加熱時間成為1秒以上10秒以下的方式使上述反應(yīng)液移動，上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)試劑包含正向引物、反向引物、聚合酶以及熒光標(biāo)志探針，包含于上述反應(yīng)液的上述正向引物的濃度為0.4μm以上3.2μm以下，包含于上述反應(yīng)液的上述反向引物的濃度為0.4μm以上3.2μm以下，包含于上述反應(yīng)液的上述聚合酶的量為0.5u以上4u以下，包含于上述反應(yīng)液的上述熒光標(biāo)志探針的濃度為0.15μm以上1.2μm以下。在上述的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置中，即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增。本發(fā)明的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑為包含于施加用于使核酸擴(kuò)增的熱循環(huán)的反應(yīng)液的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑，在上述熱循環(huán)中，退火反應(yīng)以及伸長反應(yīng)用的加熱時間為1秒以上10秒以下，上述核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑包含正向引物、反向引物、聚合酶以及熒光標(biāo)志探針，包含于上述反應(yīng)液的上述正向引物的濃度為0.4μm以上3.2μm以下，包含于上述反應(yīng)液的上述反向引物的濃度為0.4μm以上3.2μm以下，包含于上述反應(yīng)液的上述聚合酶的量為0.5u以上4u以下，包含于上述反應(yīng)液的上述熒光標(biāo)志探針的濃度為0.15μm以上1.2μm以下。在上述的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑中，即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增。附圖說明圖1是示意性地表示本實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒的剖視圖。圖2是示意性地表示本實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒的剖視圖。圖3是示意性地表示本實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒的剖視圖。圖4是示意性地表示本實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒的剖視圖。圖5是示意性地表示本實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置的立體圖。圖6是示意性地表示本實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置的立體圖。圖7是示意性地表示本實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置的分解立體圖。圖8是示意性地表示本實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置的剖視圖。圖9是示意性地表示本實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置的剖視圖。圖10是本實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置的功能框圖。圖11是用于對本實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法進(jìn)行說明的流程圖。圖12是使核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑的濃度變化的情況下的pcr結(jié)果。圖13是使核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑的濃度變化的情況下的pcr結(jié)果。圖14是標(biāo)準(zhǔn)條件以及高速條件下的pcr結(jié)果。圖15是多重pcr結(jié)果。具體實(shí)施方式以下，使用附圖對本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式詳細(xì)地進(jìn)行說明。此外，以下說明的實(shí)施方式適當(dāng)?shù)叵薅?quán)利要求書記載的本發(fā)明的內(nèi)容。另外，以下說明的構(gòu)成的全部不限定于是本發(fā)明的必要構(gòu)成要件。1.核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑首先，對本實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑進(jìn)行說明。核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑收容于核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒。圖1是示意性地表示本實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10的剖視圖。如圖1所示，核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10包含容器12與帽14。如圖1所示，容器12例如具有圓筒狀的側(cè)壁部12a與半球狀的底部12b。容器12具有流路16。流路16由容器12形成。流路16沿著圓筒狀的側(cè)壁部12a的中心軸(未圖示)延伸。帽14堵塞與容器12的底部12b對置的端部的開口。帽14相對于容器12能夠裝卸。容器12以及帽14的材質(zhì)例如為玻璃、高分子、金屬等。在容器12的底部12b例如固定被凍結(jié)干燥的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑24。若如圖2所示卸下帽14并使用移液管2等向上述的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10導(dǎo)入模板核酸溶液22，則如圖3所示被導(dǎo)入的模板核酸溶液22下降至底部12b，而與核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑24接觸。核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑24憑借模板核酸溶液22的水分而解除凍結(jié)干燥從而被獲取至模板核酸溶液22，進(jìn)而如圖4所示成為反應(yīng)液20。因此，反應(yīng)液20包含模板核酸以及核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑24，從而進(jìn)行核酸的擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)液20收容于核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10，并存在于流路16。反應(yīng)液20在液體30中以液滴的狀態(tài)被保持。在圖示的例中，反應(yīng)液20的形狀呈球狀。反應(yīng)液20例如比重大于液體30。反應(yīng)液20伴隨著核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10的移動，而在流路16中相對于容器12相對地移動。模板核酸溶液22是包含模板核酸的溶液。在將模板核酸溶液22導(dǎo)入容器12內(nèi)時，帽14被從容器12取下，在導(dǎo)入模板核酸溶液22后，再次被安裝于容器12。模板核酸溶液22例如通過如下方式獲得。即，利用棉棒等采集工具，采集人、細(xì)菌等的源自生物的細(xì)胞或者病毒等檢體，使用已知的提取方法，從檢體提取模板核酸。然后，使用已知的精制方法，以成為規(guī)定濃度的方式精制模板核酸溶液。此外，模板核酸溶液22的溶劑例如是水(蒸留水、滅菌水)、tris-edta(ethylenediaminetetraaceticacid：乙二胺四乙酸)溶液(te)。核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑24收容于核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10，例如在容器12的底部12b被凍結(jié)干燥(冷凍干燥)。核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑24是使用于核酸的(靶核酸的)擴(kuò)增反應(yīng)的試劑。核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑24包含引物、聚合酶、熒光標(biāo)志探針以及dntp。引物設(shè)計為對模板核酸進(jìn)行退火。核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑24在雙鏈構(gòu)造的模板核酸(雙鏈dna)改性后，包含對一方的單鏈構(gòu)造的模板核酸(單鏈dna)進(jìn)行退火的正向引物(forwardprimer)與對另一方的單鏈dna進(jìn)行退火的反向引物(reverseprimer)。包含于反應(yīng)液20的正向引物的濃度為0.4μm以上3.2μm以下，優(yōu)選為0.8μm以上3.2μm以下，更加優(yōu)選為1.6μm以上3.2μm以下，進(jìn)一步更加優(yōu)選為2.4μm以上3.2μm以下。包含于反應(yīng)液20的反向引物的濃度例如為0.4μm以上3.2μm以下，優(yōu)選為0.8μm以上3.2μm以下，更加優(yōu)選為1.6μm以上3.2μm以下，進(jìn)一步更加優(yōu)選為2.4μm以上3.2μm以下。若為上述的范圍，則即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增(詳細(xì)參照“4.實(shí)驗例”)。包含于反應(yīng)液20的正向引物的濃度與反向引物的濃度例如相同。作為聚合酶，雖不被特別地限定，但能夠列舉dna(deoxyribonucleicacid：脫氧核糖核酸)聚合酶。dna聚合酶在對單鏈構(gòu)造的模板核酸(單鏈dna)進(jìn)行退火的引物的末端聚合與模板核酸的堿基互補(bǔ)的核甙酸。作為dna聚合酶，優(yōu)選耐熱性的酶、pcr用酶，例如，雖存在taq聚合酶、tfi聚合酶、tth聚合酶或者它們的改良型等非常多數(shù)的出售品，但優(yōu)選進(jìn)行熱啟動(hotstart)的dna聚合酶。包含于反應(yīng)液20的聚合酶的量為0.5u以上4u以下，優(yōu)選為1u以上4u以下，更加優(yōu)選為2u以上4u以下，進(jìn)一步更加優(yōu)選為3u以上4u以下。若為上述的范圍，則即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增。熒光標(biāo)志探針用于使核酸的擴(kuò)增量定量。熒光標(biāo)志探針例如是包含指針色素以及淬滅色素的水解探針。作為水解探針的熒光標(biāo)志探針在與單鏈dna混合(退火)而形成雙鏈構(gòu)造的期間，指針色素因接近該指針色素的淬滅色素(因淬滅效應(yīng))，而抑制發(fā)光。但是，若通過聚合酶分解熒光標(biāo)志探針，則淬滅效應(yīng)消除，從而指針色素發(fā)光。通過該發(fā)光，能夠使核酸的擴(kuò)增量定量。包含于反應(yīng)液20的熒光標(biāo)志探針的濃度為0.15μm以上1.2μm以下，優(yōu)選為0.3μm以上1.2μm以下，更加優(yōu)選為0.6μm以上1.2μm以下，進(jìn)一步更加優(yōu)選為0.9μm以上1.2μm以下。若為上述的范圍，則即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增(詳細(xì)參照“4.實(shí)驗例”)。dntp表示4種脫氧核苷三磷酸(deoxynucleotidetriphosphate)的混合物。即，dntp表示datp(deoxyadenosinetriphosphate：脫氧腺苷三磷酸)、dctp(deoxycytidinetriphosphate：脫氧胞苷三磷酸)、dgtp(deoxyguanosinetriphosphate：脫氧鳥苷三磷酸)以及dttp(thymidinetriphosphate：胸苷三磷酸)的混合物。dna聚合酶在退火的引物的末端接合datp、dctp、dgtp、dttp，而形成新的dna。包含于反應(yīng)液20的dntp的濃度為0.125mm以上1mm以下，優(yōu)選為0.25mm以上1mm以下，更加優(yōu)選為0.5mm以上1mm以下，進(jìn)一步更加優(yōu)選為0.75mm以上1mm以下。若為上述的范圍，則即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增(詳細(xì)參照“4.實(shí)驗例”)。此外，反應(yīng)液20也可以進(jìn)一步包含水、緩沖液(例如，mgcl2、tris-hcl以及kcl混合的液體)。液體30收容于核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10，并配置于流路16。在圖示的例中，流路16被反應(yīng)液20以及液體30填充(充滿)。液體30是不與反應(yīng)液20混和，即不混雜的液體。液體30進(jìn)一步也不與模板核酸溶液22以及核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑24混和。液體30的比重與反應(yīng)液20的比重不同。具體而言，液體30的比重小于反應(yīng)液20的比重。因此，反應(yīng)液20憑借重力的作用，向重力發(fā)揮作用的方向移動。液體30例如是二甲基硅油、石蠟油等。此外，如上，對將被凍結(jié)干燥的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑24固定于容器12的底部12b，將模板核酸溶液22導(dǎo)入容器12內(nèi)，使模板核酸溶液22與核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑24接觸從而形成反應(yīng)液20的例子進(jìn)行了說明。然而，也可以在容器12外調(diào)制包含模板核酸與核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑24的溶液，將該溶液導(dǎo)入被液體30填充的容器12內(nèi)，從而反應(yīng)液20存在于容器12內(nèi)。2.核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置接下來，參照附圖對本實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置進(jìn)行說明。圖5以及圖6是示意性地表示本實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置100的立體圖，圖5表示打開蓋體60的狀態(tài)，圖6表示關(guān)閉蓋體60的狀態(tài)。圖7是示意性地表示本實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置100的主體部50的分解立體圖。圖8以及圖9是示意性地表示本實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置100的、沿圖6的a-a線剖視圖。圖10是本實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置100的功能框圖。此外，為了方便，在圖5中，簡化圖示核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10。另外，在圖5以及圖6中，省略熒光測定器80的圖示。另外，在圖8以及圖9中，箭頭g的方向為重力發(fā)揮作用的方向(重力作用方向)。在圖8中，加熱部52、53的配置表示作為第一配置的狀態(tài)，在圖9中，加熱部52、53的配置表示作為第二配置的狀態(tài)。另外，為了方便，在圖10中，省略主體部50以及蓋體60的圖示。如圖5～圖10所示，核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置100包含主體部50、蓋體60、移動機(jī)構(gòu)70、熒光測定器80、處理部90、操作部92、顯示部94以及存儲部96。核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置100例如為升降式pcr裝置。如圖7所示，主體部50具有安裝部51、第一加熱部52、第二加熱部53、隔離件54、底板55、凸緣56以及固定板57。安裝部51具有能夠安裝核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10的構(gòu)造。具體而言，如圖5所示，安裝部51具有供核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10插入(insert)并安裝的構(gòu)造。在圖7所示的例中，安裝部51是貫通第一加熱部52的第一加熱部件52b、隔離件54以及第二加熱部53的第二加熱部件53b的貫通孔。安裝部51的個數(shù)也可以為多個，在圖示的例中為20個。第一加熱部52在將核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10安裝于安裝部51的情況下，如圖8以及圖9所示，將流路16的第一區(qū)域16a加熱至第一溫度。在圖示的例中，第一加熱部52位于比第二加熱部53更靠蓋體60側(cè)。第一加熱部52例如具有產(chǎn)生熱的機(jī)構(gòu)與將產(chǎn)生的熱傳遞至核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10的部件。在圖7所示的例中，第一加熱部52具有第一加熱器52a與第一加熱部件52b。第一加熱器52a例如為盒加熱器，被導(dǎo)線58連接于未圖示的外部電源。第一加熱器52a插入設(shè)置于第一加熱部件52b的孔，第一加熱器52a發(fā)熱，從而第一加熱部件52b被加熱。第一加熱部件52b是將從第一加熱器52a產(chǎn)生的熱傳遞至核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10的部件。第一加熱部件52b例如是鋁制的塊部件。流路16的第一區(qū)域16a是被第一加熱部件52b包圍的區(qū)域。第二加熱部53在將核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10安裝于安裝部51的情況下，將流路16的第二區(qū)域16b加熱至與第一溫度不同的第二溫度。第二加熱部53具有第二加熱器53a與第二加熱部件53b。第二加熱部53除了加熱的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10的區(qū)域以及加熱的溫度與第一加熱部52不同以外，具有與第一加熱部52相同的構(gòu)造以及功能。流路16的第二區(qū)域16b是被第二加熱部件53b包圍的區(qū)域。第一加熱部52以及第二加熱部53的溫度被未圖示的溫度傳感器(例如熱電偶)以及處理部90控制。例如，將第一加熱部52控制為第一溫度，將第二加熱部53控制為第二溫度，從而能夠?qū)⒑怂釘U(kuò)增反應(yīng)用盒10的第一區(qū)域16a加熱至第一溫度，將第二區(qū)域16b加熱至第二溫度。隔離件54設(shè)置于第一加熱部52與第二加熱部53之間。隔離件54具有將第一加熱部52與第二加熱部53之間隔熱的功能。底板55是保持核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10的部件。底板55決定核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10的高度方向的位置。即，將核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10插入至與底板55接觸的位置，從而相對于加熱部52、53將核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10保持于規(guī)定的位置。在底板55設(shè)置有用于供來自熒光測定器80的激勵光以及供反應(yīng)液20的熒光通過的貫通孔55a。凸緣56以及固定板57是用于固定加熱部52、53以及隔離件54的部件。在圖示的例中，將兩張固定板57嵌合于凸緣56，加熱部52、53、隔離件54以及底板55固定于固定板57。蓋體60覆蓋安裝部51。在圖5所示的例中，在固定板57設(shè)置有磁鐵部62，蓋體60能夠被磁鐵部62固定于主體部50。此外，隔離件54、底板55、凸緣56、固定板57以及蓋體60的材質(zhì)例如為隔熱材料。移動機(jī)構(gòu)70是基于來自處理部90的輸入信號使主體部50旋轉(zhuǎn)的機(jī)構(gòu)。由此，移動機(jī)構(gòu)70能夠?qū)⒓訜岵?2、53向第一配置(參照圖8)與第二配置(參照圖9)切換。其結(jié)果，移動機(jī)構(gòu)70能夠以對反應(yīng)液20施加用于使核酸擴(kuò)增的熱循環(huán)的方式使反應(yīng)液20移動。在第一配置中，第一加熱部52與第二加熱部53相比在重力作用方向位于下方。在第二配置中，第二加熱部53與第一加熱部52相比在重力作用方向位于下方。移動機(jī)構(gòu)70例如具有未圖示的馬達(dá)以及驅(qū)動軸。驅(qū)動軸與主體部50的凸緣56連接。驅(qū)動軸相對于核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10的長度方向垂直設(shè)置，若使馬達(dá)動作，則以驅(qū)動軸為旋轉(zhuǎn)的軸使主體部50旋轉(zhuǎn)。熒光測定器80是測定收容于核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10的反應(yīng)液20的熒光強(qiáng)度(熒光亮度)的測定器。如圖9所示，熒光測定器80在第二配置中，相對于核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10的底部12b隔開規(guī)定距離對置地配置。熒光測定器80基于來自處理部90的輸入信號，將與包含于反應(yīng)液20的熒光標(biāo)志探針的熒光色素對應(yīng)的激勵光向反應(yīng)液20照射，來測定由反應(yīng)液20發(fā)光的熒光強(qiáng)度。此外，熒光測定器80可以測定與一個熒光色素對應(yīng)的熒光強(qiáng)度，也可以測定與多個熒光色素對應(yīng)的熒光強(qiáng)度。如圖10所示，處理部90根據(jù)例如存儲于存儲部96的程序，進(jìn)行用于控制移動機(jī)構(gòu)70、熒光測定器80的處理。處理部90例如通過cpu(centralprocessingunit中央處理機(jī))等的處理程序等實(shí)現(xiàn)。操作部92取得與用戶的操作對應(yīng)的操作信號，進(jìn)行將操作信號發(fā)送至處理部90的處理。操作部92例如通過按鈕、鍵、觸摸面板型顯示器、話筒等實(shí)現(xiàn)。顯示部94顯示由處理部90生成的圖像。顯示部94例如通過lcd(liquidcrystaldisplay液晶顯示器)、crt(cathoderaytube陰極射線管)等實(shí)現(xiàn)。存儲部96存儲處理部90用于進(jìn)行各種計算處理、控制處理的程序、數(shù)據(jù)等。另外，存儲部96被使用為處理部90的作業(yè)區(qū)域，用于暫時存儲處理部90根據(jù)各種程序執(zhí)行的計算結(jié)果等。存儲部96例如通過ram(randomaccessmemory隨機(jī)存取存儲器)等實(shí)現(xiàn)。3.核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法接下來，參照附圖對本實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法進(jìn)行說明。圖11是用于對本實(shí)施方式的核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法進(jìn)行說明的流程圖。以下，作為一個例子，對使用了核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置100的核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法進(jìn)行說明。首先，將核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10安裝于核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置100的安裝部51(步驟s2)。具體而言，在向填充有液體30的容器12導(dǎo)入反應(yīng)液20后，將核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10安裝于安裝部51。例如，在向安裝部51安裝核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10后，利用蓋體60覆蓋安裝部51。此處，如圖8所示，加熱部52、53的配置為第一配置。在第一配置中，在重力作用方向的流路16的最下部存在第一區(qū)域16a。因此，比重大于液體30的反應(yīng)液20位于第一區(qū)域16a。接下來，處理部90若從操作部92接受開始熱循環(huán)處理的主旨的信號，則控制加熱部52、53，對核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10的第一區(qū)域16a以及第二區(qū)域16b進(jìn)行加熱，而在流路16形成溫度梯度(步驟s4)。具體而言，第一加熱部52將第一區(qū)域16a加熱至第一溫度，第二加熱部53將第二區(qū)域16b加熱至低于第一溫度的第二溫度。由此，在流路16的第一區(qū)域16a與第二區(qū)域16b之間形成有溫度在第一溫度與第二溫度之間逐漸變化的溫度梯度。此處，加熱部52、53是形成溫度從第一區(qū)域16a朝向第二區(qū)域16b降低的溫度梯度的溫度梯度形成部。第一溫度是適于雙鏈dna的解離(改性反應(yīng))的溫度，例如，為95℃以上110℃以下。第二溫度是適于退火反應(yīng)以及伸長反應(yīng)的溫度，例如，為50℃以上75℃以下。加熱部52、53的配置為第一配置，因此若對核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒10進(jìn)行加熱，則反應(yīng)液20被加熱至第一溫度。接下來，處理部90若第一加熱部52到達(dá)第一溫度經(jīng)過第一時間(第一期間)，則控制移動機(jī)構(gòu)70，而將加熱部52、53的配置從第一配置向第二配置切換(步驟s6)。處理部90也可以內(nèi)置計時器。第一時間是改性反應(yīng)用的加熱時間，例如，為1秒以上10秒以下。移動機(jī)構(gòu)70被處理部90控制，以第一時間成為1秒以上10秒以下的方式使反應(yīng)液20移動。具體而言，處理部90對移動機(jī)構(gòu)70進(jìn)行控制而使主體部50旋轉(zhuǎn)180°。由此，加熱部52、53的配置從第一配置被切換成第二配置。如圖9所示，第二配置是使第二區(qū)域16b在重力作用方向位于流路16的最下部的配置。在第二配置中，第一區(qū)域16a與第二區(qū)域16b的重力作用方向的位置關(guān)系與第一配置相反。因此，反應(yīng)液20通過重力的作用從第一區(qū)域16a向第二區(qū)域16b移動。處理部90在將加熱部52、53的配置設(shè)為第二配置后，使移動機(jī)構(gòu)70的動作停止第二時間(第二期間)。由此，加熱部52、53的配置被保持于第二配置。第二時間是退火反應(yīng)以及伸長反應(yīng)用的加熱時間，為1秒以上10秒以下。移動機(jī)構(gòu)70被處理部90控制，以第二時間成為1秒以上10秒以下的方式使反應(yīng)液20移動。接下來，處理部90判定從第一配置向第二配置切換的次數(shù)(循環(huán)數(shù))是否到達(dá)預(yù)先存儲于存儲部96的規(guī)定的次數(shù)(步驟s8)。每當(dāng)進(jìn)行從第一配置向第二配置的切換，處理部90均使循環(huán)數(shù)存儲于存儲部96，而將該循環(huán)數(shù)與預(yù)先存儲于存儲部96的規(guī)定的次數(shù)進(jìn)行比較。處理部90在步驟s8中判定為循環(huán)數(shù)到達(dá)規(guī)定的次數(shù)的情況下(在圖11中，為“是”的情況下)，結(jié)束處理。另一方面，處理部90在步驟s8中判定為循環(huán)數(shù)未到達(dá)規(guī)定的次數(shù)的情況下(在圖11中為“否”的情況下)，移至步驟s10。在步驟s10中，處理部90控制移動機(jī)構(gòu)70，將加熱部52、53的配置從第二配置向第一配置切換。處理部90在將加熱部52、53的配置設(shè)為第一配置后，使移動機(jī)構(gòu)70的動作停止第一時間。然后，處理部90再次移至步驟s6，而將加熱部52、53的配置從第一配置向第二配置切換。如以上所述，處理部90更換第一配置與第二配置的位置并且使加熱部52、53(使主體部50)旋轉(zhuǎn)直至循環(huán)數(shù)成為規(guī)定的次數(shù)，從而使反應(yīng)液20在流路16中往復(fù)運(yùn)動。由此，核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置100能夠?qū)Ψ磻?yīng)液20施加用于使核酸擴(kuò)增的熱循環(huán)。處理部90進(jìn)一步與上述的熱循環(huán)處理同時期地進(jìn)行擴(kuò)增解析處理。由此，在核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置100中，能夠?qū)崟r進(jìn)行pcr。具體而言，每當(dāng)將加熱部52、53的配置保持于第二配置，處理部90均相對于熒光測定器80輸入用于給予測定指示的信號。然后，處理部90作為熒光測定器80的測定結(jié)果，從熒光測定器80取得熒光強(qiáng)度，并將該熒光強(qiáng)度存儲于存儲部96。另外，處理部90也可以基于從操作部92被輸入的信號，從存儲部96讀出作為應(yīng)該反復(fù)的循環(huán)數(shù)被設(shè)定的次數(shù)對應(yīng)的熒光強(qiáng)度，基于該熒光強(qiáng)度，生成表示熒光強(qiáng)度相對于循環(huán)數(shù)的推移的擴(kuò)增曲線。處理部90也可以基于該擴(kuò)增曲線對相對于核酸的擴(kuò)增效率的優(yōu)劣進(jìn)行判定，并使判定結(jié)果、擴(kuò)增曲線顯示于顯示部94。此外，如上所述，在步驟s8中，處理部90雖對循環(huán)數(shù)是否到達(dá)規(guī)定的次數(shù)進(jìn)行判定，但處理部90也可以對取得的熒光強(qiáng)度是否到達(dá)預(yù)先存儲于存儲部96的規(guī)定值進(jìn)行判定。然后，處理部90也可以在判定為取得的熒光強(qiáng)度到達(dá)規(guī)定值的情況下，結(jié)束處理，在判定為取得的熒光強(qiáng)度未到達(dá)規(guī)定值的情況下，移至步驟s10。另外，如上，雖將第二溫度設(shè)為退火反應(yīng)以及伸長反應(yīng)用的溫度，但也可以將第二溫度設(shè)為退火反應(yīng)以及伸長反應(yīng)中的任意一方的反應(yīng)用的溫度，也可以將第二時間設(shè)為退火反應(yīng)以及伸長反應(yīng)中的任意一方的反應(yīng)用的加熱時間。在該情況下，雖未圖示，但核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置100具有將流路16的第三區(qū)域(與第一區(qū)域以及第二區(qū)域不同的區(qū)域)加熱至第三溫度(與第一溫度以及第二溫度不同的溫度)的第三加熱部。第三溫度是退火反應(yīng)以及伸長反應(yīng)中的另一方的反應(yīng)用的溫度，第三時間是退火反應(yīng)以及伸長反應(yīng)中的另一方的反應(yīng)用的加熱時間。但是，為了實(shí)現(xiàn)pcr的高速化，優(yōu)選將第二溫度設(shè)為退火反應(yīng)以及伸長反應(yīng)用的溫度。4.實(shí)驗例以下，表示實(shí)驗例，對本發(fā)明更加具體地進(jìn)行說明。此外，本發(fā)明不限定于以下的實(shí)驗例。4.1.樣品的調(diào)制作為模板核酸，使用a型的流感(infa)病毒的質(zhì)體dna100復(fù)印品(1反應(yīng)管)。此外，100復(fù)印品是lamp法(榮研化學(xué))的lod(limitofdetection檢測極限)。將上述模板核酸添加于核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑而調(diào)制了下述的混合試劑溶液。具體而言，調(diào)制了“1倍”、“2倍”、“4倍”、“6倍”、“8倍”、“10倍”、“12倍”7種混合試劑溶液。例如“2倍”的混合試劑溶液使聚合酶、dntp、引物、熒光標(biāo)志探針的每一個相對于“1倍”的混合試劑溶液包含2倍。此外，下述的各試劑的液量(體積)是相對于混合試劑10μl的值。即，例如在“1倍”的混合試劑溶液中，聚合酶在混合試劑容器10μl中包含0.1μl。＜“1倍”的混合試劑溶液的組成＞＜“2倍”的混合試劑溶液的組成＞＜“4倍”的混合試劑溶液的組成＞＜“6倍”的混合試劑溶液的組成＞＜“8倍”的混合試劑溶液的組成＞＜“10倍”的混合試劑溶液的組成＞＜“12倍”的混合試劑溶液的組成＞此外，在上述的混合試劑溶液中，聚合酶使用了lifetechnologies社制。dntp使用了roche社制。正向引物以及反向引物使用了sigmaaldrich社制。熒光標(biāo)志探針使用了sigmaaldrich社制的taqman(注冊商標(biāo))探針。水使用了roche社制。緩沖液的組成如下所述。mgcl2：25mmtris-hcl(ph9.0)：250mmkcl：125mm正向引物、反向引物、熒光標(biāo)志探針的序列如下述表1所述。此外，在表1中，“fam”是指針色素，“bhq1”是淬滅色素。表1infa檢測用正向引物5’gaccratcctgtcacctctgac3’infa檢測用反向引物5’agggcattytggacaaakcgtcta3’infa檢測用熒光標(biāo)志探針5’fam-cacaaatcctaaaattccct-bhq13’4.2.pcr結(jié)果從上述混合試劑溶液的每一個作為反應(yīng)液提取1.6μl，注入填充有硅油的核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒。此外，從“1倍”的混合試劑溶液獲得的包含于反應(yīng)液的聚合酶的量相當(dāng)于0.5u。即，從“2倍”、“4倍”、“6倍”、“8倍”、“10倍”、“12倍”的混合試劑溶液獲得的包含于反應(yīng)液的聚合酶的量分別相當(dāng)于1u、2u、3u、4u、5u、6u。將第一溫度(改性反應(yīng)用的溫度)設(shè)為105℃，將第一時間(改性反應(yīng)用的期間)設(shè)為4秒，將第二溫度(退火反應(yīng)以及伸長反應(yīng)用的溫度)設(shè)為60℃，將第二時間(退火反應(yīng)以及伸長反應(yīng)用的期間)設(shè)為6秒，相對于各反應(yīng)液，使用核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置100那樣的升降式pcr裝置進(jìn)行pcr。此外，pcr以105℃加熱10秒進(jìn)行熱開始。圖12是表示從“1倍”～“6倍”的混合試劑溶液獲得的反應(yīng)液的pcr結(jié)果的圖表。圖13是表示從“8倍”～“12倍”的混合試劑溶液獲得的反應(yīng)液的pcr結(jié)果的圖表。如圖12以及圖13所示，pcr相對于各反應(yīng)液各進(jìn)行了兩次。在圖12以及圖13中，橫軸表示熱循環(huán)的循環(huán)數(shù)，縱軸表示由熒光測定裝置測定出的熒光強(qiáng)度。如圖12以及圖13所示，在“1倍”～“8倍”的范圍內(nèi)，能夠確認(rèn)熒光強(qiáng)度的增加。熒光強(qiáng)度在“2倍”～“8倍”的范圍內(nèi)進(jìn)一步增加，在“4倍”～“8倍”的范圍內(nèi)更進(jìn)一步增加，在“6倍”～“8倍”的范圍內(nèi)更加進(jìn)一步增加。因此，將包含于反應(yīng)液的正向引物以及反向引物的濃度設(shè)為0.4μm以上3.2μm以下，將包含于反應(yīng)液的聚合酶的量設(shè)為0.5u以上4u以下，將包含于反應(yīng)液的熒光標(biāo)志探針的濃度設(shè)為0.15μm以上1.2μm以下，將包含于反應(yīng)液的dntp的濃度設(shè)為0.125mm以上1mm以下，從而明確即使使pcr高速化，也能夠高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增。另外，將正向引物以及反向引物的濃度設(shè)為0.8μm以上3.2μm以下，將聚合酶的量設(shè)為1u以上4u以下，將熒光標(biāo)志探針的濃度設(shè)為0.3μm以上1.2μm以下，將dntp的濃度設(shè)為0.25mm以上1mm以下，從而明確即使使pcr高速化，也能夠更加高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增。另外，將正向引物以及反向引物的濃度設(shè)為1.6μm以上3.2μm以下，將聚合酶的量設(shè)為2u以上4u以下，將熒光標(biāo)志探針的濃度設(shè)為0.6μm以上1.2μm以下，將dntp的濃度設(shè)為0.5mm以上1mm以下，從而明確即使使pcr高速化，也能夠更進(jìn)一步高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增。另外，將正向引物以及反向引物的濃度設(shè)為2.4μm以上3.2μm以下，將聚合酶的量設(shè)為3u以上4u以下，將熒光標(biāo)志探針的濃度設(shè)為0.9μm以上1.2μm以下，將dntp的濃度設(shè)為0.75mm以上1mm以下，從而明確即使使pcr高速化，也能夠更加進(jìn)一步高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增。此外，在上述的實(shí)驗例的pcr中，將第二時間設(shè)為6秒，但若將引物、熒光標(biāo)志探針以及dntp的濃度和聚合酶的量設(shè)為上述范圍內(nèi)，則第二時間只要為1秒至10秒，則能夠高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增。若將第二時間設(shè)為不足1秒，則核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置、核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒的設(shè)計變得困難。即，將第二時間設(shè)為1秒以上，從而核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置、核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒的設(shè)計變得容易，從而能夠提高設(shè)計的自由度。圖14是表示將第一時間設(shè)為5秒，將第二時間設(shè)為20秒的條件(標(biāo)準(zhǔn)條件)下的pcr結(jié)果與將第一時間設(shè)為3秒，將第二時間設(shè)為6秒的條件(高速條件)下的pcr結(jié)果的圖表。如圖14所示，在高速條件下，熒光強(qiáng)度降低。這被考慮為在高速條件下，核酸與熒光標(biāo)志探針無法充分地混合是重要因素。上述的熒光強(qiáng)度的降低被確認(rèn)為是在將第二時間設(shè)為10秒以下后。若將引物、熒光標(biāo)志探針以及dntp的濃度和聚合酶的量設(shè)為上述范圍，則即使使pcr高速化，核酸與熒光標(biāo)志探針也充分地混合，從而能夠高靈敏度地檢測核酸的擴(kuò)增。圖15是表示將第一時間設(shè)為4秒，將第二時間設(shè)為6秒時的多重(multiplex)pcr(多項目同時pcr)結(jié)果的圖表。在圖15中，將b型的流感(infb)病毒100復(fù)印品設(shè)為模板核酸時，作為核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑，使用僅能夠檢測infb的試劑、能夠檢測infb以及infa的試劑、能夠檢測infb、infa以及噬菌體ms2的試劑進(jìn)行了pcr。如圖15所示，pcr相對于各反應(yīng)液各進(jìn)行兩次。如圖15所示，在多重pcr中，熒光強(qiáng)度降低。將引物、熒光標(biāo)志探針以及dntp的濃度和聚合酶的量設(shè)為上述范圍內(nèi)，從而能夠使熒光強(qiáng)度增加，因此在pcr的高速化、進(jìn)行多重pcr的情況下，能夠稱為特別地有效。本發(fā)明包含與在實(shí)施方式中說明的構(gòu)成實(shí)際相同的構(gòu)成(例如，功能、方法以及結(jié)果相同的構(gòu)成，或者目的以及效果相同的構(gòu)成)。另外，本發(fā)明包含置換在實(shí)施方式中說明的構(gòu)成的非本質(zhì)的部分的構(gòu)成。另外，本發(fā)明包含能夠起到與在實(shí)施方式中說明的構(gòu)成相同的作用效果的構(gòu)成或者實(shí)現(xiàn)相同的目的的構(gòu)成。另外，本發(fā)明包含對在實(shí)施方式中說明的構(gòu)成附加了公知技術(shù)的構(gòu)成。符號說明2…移液管；10…核酸擴(kuò)增反應(yīng)用盒；12…容器；12a…側(cè)壁部；12b…底部；14…帽；16…流路；16a…第一區(qū)域；16b…第二區(qū)域；20…反應(yīng)液；22…模板核酸溶液；24…核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑；30…液體；50…主體部；51…安裝部；52…第一加熱部；52a…第一加熱器；52b…第一加熱部件；53…第二加熱部；53a…第二加熱器；53b…第二加熱部件；54…隔離件；55…底板；55a…貫通孔；56…凸緣；57…固定板；58…導(dǎo)線；60…蓋體；62…磁鐵部；70…移動機(jī)構(gòu)；80…熒光測定器；90…處理部；92…操作部；94…顯示部；96…存儲部；100…核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置?！拘蛄斜碜杂晌谋尽啃蛄芯幪?是infa的正向引物的序列。序列編號2是infa的反向引物的序列。序列編號3是infa的熒光標(biāo)志探針的序列?！拘蛄斜怼空垍⒄崭巾撔蛄斜?lt;110>精工愛普生株式會社<120>核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法、核酸擴(kuò)增反應(yīng)裝置以及核酸擴(kuò)增反應(yīng)用試劑<130>j018697301<160>3<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>infa正向引物<400>1gaccratcctgtcacctctgac22<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>infa反向引物<400>2agggcattytggacaaakcgtcta24<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>infa熒光探針<400>3cacaaatcctaaaattccct20當(dāng)前第1頁12