本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)分子診斷及生物技術(shù)，具體涉及一種引物組及其應(yīng)用，尤其涉及一種用于肥厚型心肌病相關(guān)致病基因熱點(diǎn)突變的檢測(cè)的引物組合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

肥厚型心肌病(HCM)為一種最常見(jiàn)的遺傳性心臟疾病，主要表現(xiàn)為左心室或雙心室不對(duì)稱性肥厚，較少患者表現(xiàn)出左室流出道梗阻。主要病理特征為心肌細(xì)胞彌漫性肥大、畸形、核大、深染和心肌纖維紊亂等。HCM臨床表現(xiàn)從無(wú)征兆到呼吸困難、暈厥、胸痛甚至發(fā)生心源性猝死和致命性的心律失常。

HCM是第一個(gè)從遺傳角度闡明病因的遺傳性心臟疾病。1990年在一個(gè)加拿大家族性肥厚型心肌病患者中發(fā)現(xiàn)第一個(gè)致病基因MYH7，其遵循的是常染色體顯性遺傳模式。HCM的全球發(fā)病率和年死亡率分別約為1/500和1％。相關(guān)證據(jù)表明，Zou等人隨機(jī)抽查中國(guó)9個(gè)省的成年人8080人，其中男性4064人，女性4016人，并對(duì)其進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)，結(jié)果表明中國(guó)人群患HCM的概率大約為0.8/500。實(shí)際上，超聲心動(dòng)圖對(duì)肥厚型心肌病的檢測(cè)為一種患病后的診斷方式，還存在更多潛在的HCM患者，依此推斷，中國(guó)人群中至少存在200萬(wàn)HCM患者。該病也是是青少年和年輕運(yùn)動(dòng)員猝死的最主要原因之一，Morn等人對(duì)1986-2006年猝死的1886名美國(guó)年輕運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，死亡的主要原因?yàn)樾难芗膊?056名，占約56％，其中HCM的患者就占據(jù)了36％。

眾多研究表明，HCM主要由肌節(jié)基因突變所致，故HCM又稱為肌小節(jié)疾病。HCM主要遵循常染色體顯性遺傳模式，大約有50％的HCM患者為家族性遺傳，稱為家族性肥厚型心肌病(FHCM)。對(duì)HCM患者進(jìn)行基因檢測(cè)和家族篩 查能夠?yàn)榕R床診斷提供重要的指導(dǎo)作用，主要體現(xiàn)為：1)產(chǎn)前診斷，指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育；2)輔助明確診斷，進(jìn)行臨床干預(yù)；3)家族篩查，進(jìn)行家族疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及管理。

目前，遺傳疾病基因突變的檢測(cè)方法較多，如：限制性片段長(zhǎng)度多太性、單鏈構(gòu)象多態(tài)性、高分辨率溶解曲線分析、熒光定量PCR的檢測(cè)方法、PCR擴(kuò)增直接測(cè)序和高通量測(cè)序。上方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，毛細(xì)管電泳技術(shù)是基因突變檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但因其對(duì)設(shè)備的要求高、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，很難從實(shí)驗(yàn)室普及到臨床，熒光定量PCR具有快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確等特點(diǎn)。

CN 102965428A公開了一種檢測(cè)遺傳性心肌肥厚相關(guān)基因突變樣品制備試劑盒。該試劑盒采用探針捕獲測(cè)序，與其他傳統(tǒng)的DNA芯片雜交和毛細(xì)管電泳測(cè)序技術(shù)一樣，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且價(jià)格昂貴，根本不能滿足對(duì)HCM的基因檢測(cè)。

值得一提的是TaqMan-MGB熒光定量PCR的檢測(cè)方法，該方法與傳統(tǒng)的TaqMan不同的是在探針的3’端連接了非熒光的猝滅基團(tuán)MGB(minor groove binder，MGB)，當(dāng)探針序列與模板結(jié)合時(shí)，MGB能高度結(jié)合于DNA雙鏈的小溝，增加了寡核苷酸探針和單鏈模板結(jié)合的穩(wěn)定性，由此通過(guò)縮短探針序列長(zhǎng)度，增加探針序列的特異性，實(shí)現(xiàn)了能區(qū)分一個(gè)堿基的差別。當(dāng)具有5’-3’外切酶活性的DNA聚合酶對(duì)堿基進(jìn)行延伸時(shí)，可把發(fā)光基團(tuán)解離下來(lái)，解除了非熒光的猝滅基團(tuán)對(duì)發(fā)光基團(tuán)的抑制，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的積累與PCR產(chǎn)物的同步進(jìn)行，從而能較好的區(qū)分野生型、純合突變和雜合突變樣本。TaqMan-MGB對(duì)單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方面有較多的應(yīng)用，如：慢性骨髓增殖性疾病、病原微生物的耐藥突變檢測(cè)和腫瘤細(xì)胞P⁵³基因突變等。

CN 104388595 A公開了一種豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光定量 PCRMGB-TaqMan探針檢測(cè)方法，該方法利用熒光定量PCR技術(shù)，采用MGB探針，建立了豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)檢測(cè)方法。但目前MGB探針還未用于HCM的檢測(cè)。

因此，為肥厚型心肌病建立一種簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)和準(zhǔn)確的突變篩查方法，為肥厚型心肌病的預(yù)防、輔助臨床診斷和預(yù)后評(píng)估提供技術(shù)平臺(tái)顯得尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足及實(shí)際的需求，本發(fā)明提供了一種引物組及其應(yīng)用，本發(fā)明通過(guò)所述引物組可以構(gòu)建陽(yáng)性野生型和純合突變型五個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)(MYH7-c.1987C>T、TNNI3-c.370G>C、MYH7-c2155C>T、TNNI3-c.433C>G和PRKAG2-c.298G>A)的載體，應(yīng)用ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀，對(duì)每個(gè)陽(yáng)性樣品同時(shí)進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，建立一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的肥厚型心肌病基因突變檢測(cè)方法，為肥厚型心肌病的臨床早期診斷和預(yù)防提供了新的技術(shù)平臺(tái)。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種引物組合物，所述引物組合物包括檢測(cè)MYH7-c.1987C>T、TNNI3-c.370G>C、MYH7-c2155C>T、TNNI3-c.433C>G或PRKAG2-c.298G>A這五個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的五組實(shí)時(shí)熒光PCR引物和Taqman-MGB探針序列中的至少一組。

優(yōu)選地，所述檢測(cè)MYH7-c.1987C>T熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的實(shí)時(shí)熒光PCR引物的核酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述Taqman-MGB探針的核酸序列如SEQ ID NO.3-4所示；

優(yōu)選地，所述檢測(cè)TNNI3-c.370G>C熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的實(shí)時(shí)熒光PCR引物的核酸序列如SEQ ID NO.5-6所示，所述Taqman-MGB探針的核酸序列如SEQ ID NO.7-8所示；

優(yōu)選地，所述檢測(cè)MYH7-c2155C>T熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的實(shí)時(shí)熒光PCR引物的核酸序列如SEQ ID NO.9-10所示，所述Taqman-MGB探針的核酸序列如SEQ ID NO.11-12所示；

優(yōu)選地，所述檢測(cè)TNNI3-c.433C>G熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的實(shí)時(shí)熒光PCR引物的核酸序列如SEQ ID NO.13-14所示，所述Taqman-MGB探針的核酸序列如SEQ ID NO.15-16所示；

優(yōu)選地，所述檢測(cè)PRKAG2-c.298G>A熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的實(shí)時(shí)熒光PCR引物的核酸序列如SEQ ID NO.17-18所示，所述Taqman-MGB探針的核酸序列如SEQ ID NO.19-20所示。

具體的序列如下所示：

優(yōu)選地，所述Taqman-MGB探針的核酸序列5’端標(biāo)記有發(fā)光的報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記有不發(fā)光的淬滅基團(tuán)MGB。

優(yōu)選地，所述發(fā)光的報(bào)告熒光基團(tuán)為FAM、HEX或Cy5中的任意一種。

優(yōu)選地，所述不發(fā)光的淬滅基團(tuán)為MGB小分子化合物。

第二方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的引物組合物中的五組實(shí)時(shí)熒光PCR引物和Taqman-MGB探針序列中的至少一組。

第三方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的引物組合物或如第二方面所述的試劑盒用于肥厚型心肌病相關(guān)致病基因熱點(diǎn)突變的檢測(cè)。

第四方面，本發(fā)明提供一種肥厚型心肌病相關(guān)致病基因熱點(diǎn)突變的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

(1)提取基因組；

(2)以步驟(1)的基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建野生型、純合突變型及雜合突變型陽(yáng)性質(zhì)控品；

(3)將步驟(2)得到的陽(yáng)性質(zhì)控品采用如第一方面所述的引物組合物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。

優(yōu)選地，步驟(1)所述的基因組來(lái)自于人的外周血、心肌組織、淋巴器官、脾臟、骨髓或肝臟中的任意一種或至少兩種的組合。

優(yōu)選地，步驟(2)所述的PCR擴(kuò)增的引物的核酸序列如SEQ ID NO.21-30所示，所述PCR擴(kuò)增的引物的核酸序列如下：

優(yōu)選地，步驟(2)所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3分鐘；95℃變性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘；

優(yōu)選地，構(gòu)建陽(yáng)性質(zhì)控品的具體步驟如下：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，將純化后的片段克隆到PMD-18T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109，挑選單克隆，測(cè)序驗(yàn)證野生型及純合突變型陽(yáng)性質(zhì)粒，將野生型和純合突變型陽(yáng)性質(zhì)粒按摩爾比1:1混合后即得到雜合突變型陽(yáng)性質(zhì)控品。

優(yōu)選地，步驟(3)所述的實(shí)時(shí)熒光PCR的條件中檢測(cè)MYH7-c.1987C>T熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的反應(yīng)體系為：Premix Ex Taq酶5μL，50×的Rox DyII緩沖液0.1μL，上下游引物各0.2μL，Taqman-MGB探針SEQ ID NO.3 0.2μL，Taqman-MGB探針SEQ ID NO.4 1μL，基因組0.5μL和ddH₂O為2.8μL；

優(yōu)選地，步驟(3)所述的實(shí)時(shí)熒光PCR的條件中檢測(cè)MYH7-c.1987C>T熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的PCR反應(yīng)條件為循環(huán)外95℃預(yù)變性30s，循環(huán)內(nèi)95℃變性5s、56℃退火及延伸34s、45個(gè)循環(huán)，循環(huán)外60℃延伸1min；

優(yōu)選地，步驟(3)所述的實(shí)時(shí)熒光PCR的條件中檢測(cè)TNNI3-c.370G>C熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的反應(yīng)體系為：Premix Ex Taq酶5μL，50×的Rox DyII緩沖液0.1μL， 上下游引物各0.2μL，Taqman-MGB探針SEQ ID NO.7 0.1μL，Taqman-MGB探針SEQ ID NO.8 1.2μL，基因組0.5μL和ddH₂O為2.7μL；

優(yōu)選地，步驟(3)所述的實(shí)時(shí)熒光PCR的條件中檢測(cè)TNNI3-c.370G>C熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的PCR反應(yīng)條件為循環(huán)外95℃預(yù)變性30s，循環(huán)內(nèi)95℃變性5s、56℃退火及延伸34s、45個(gè)循環(huán)，循環(huán)外60℃延伸1min；

優(yōu)選地，步驟(3)所述的實(shí)時(shí)熒光PCR的條件中檢測(cè)MYH7-c2155C>T熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的反應(yīng)體系為：Premix Ex Taq酶5μL，50×的Rox DyII緩沖液0.1μL，上下游引物各0.2μL，Taqman-MGB探針SEQ ID NO.11 0.2μL，Taqman-MGB探針SEQ ID NO.12 1.2μL，基因組0.5μL和ddH₂O為2.6μL；

優(yōu)選地，步驟(3)所述的實(shí)時(shí)熒光PCR的條件中檢測(cè)MYH7-c2155C>T熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的PCR反應(yīng)條件為循環(huán)外95℃預(yù)變性30s，循環(huán)內(nèi)95℃變性5s、56℃退火及延伸34s、45個(gè)循環(huán)，循環(huán)外60℃延伸1min；

優(yōu)選地，步驟(3)所述的實(shí)時(shí)熒光PCR的條件中檢測(cè)TNNI3-c.433C>G熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的反應(yīng)體系為：Premix Ex Taq酶5μL，50×的Rox DyII緩沖液0.1μL，上下游引物各0.2μL，Taqman-MGB探針SEQ ID NO.15 0.2μL，Taqman-MGB探針SEQ ID NO.16 0.8μL，基因組0.5μL和ddH₂O為3μL；

優(yōu)選地，步驟(3)所述的實(shí)時(shí)熒光PCR的條件中檢測(cè)TNNI3-c.433C>G熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的PCR反應(yīng)條件為循環(huán)外95℃預(yù)變性30s，循環(huán)內(nèi)95℃變性5s、56℃退火及延伸34s、45個(gè)循環(huán)，循環(huán)外60℃延伸1min；

優(yōu)選地，步驟(3)所述的實(shí)時(shí)熒光PCR的條件中檢測(cè)PRKAG2-c.298G>A熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的反應(yīng)體系為：Premix Ex Taq酶5μL，50×的Rox DyII緩沖液0.1μL，上下游引物各0.2μL，Taqman-MGB探針SEQ ID NO.19 0.1μL，Taqman-MGB探針SEQ ID NO.20 0.5μL，基因組0.5μL和ddH₂O為3.8μL；

優(yōu)選地，步驟(3)所述的實(shí)時(shí)熒光PCR的條件中檢測(cè)PRKAG2-c.298G>A熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的PCR反應(yīng)條件為循環(huán)外95℃預(yù)變性30s，循環(huán)內(nèi)95℃變性5s、56℃退火及延伸34s、45個(gè)循環(huán)，循環(huán)外60℃延伸1min。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明一次可檢測(cè)多個(gè)病例樣本，且可對(duì)每個(gè)樣本同時(shí)進(jìn)行5個(gè)突變位點(diǎn)的聯(lián)合檢測(cè)，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，為肥厚型心肌病的臨床早期分子診斷和預(yù)防建立了新的方法；

(2)本發(fā)明方法可用于產(chǎn)前診斷，指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育，輔助明確診斷，進(jìn)行臨床干預(yù)，家族篩查，進(jìn)行家族疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及管理。

(3)本發(fā)明的方法方便快捷，成本低，利用96孔PCR反應(yīng)管一次性檢測(cè)多個(gè)樣本，每個(gè)樣本可聯(lián)合檢測(cè)5個(gè)突變位點(diǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明陽(yáng)性質(zhì)控品TNNI3,c.370G>C菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2是本發(fā)明陽(yáng)性質(zhì)控品TNNI3,c.370G毛細(xì)管電泳檢測(cè)；

圖3是本發(fā)明陽(yáng)性質(zhì)控品TNNI3,c.370C毛細(xì)管電泳檢測(cè)；

圖4是本發(fā)明陽(yáng)性質(zhì)控品TNNI3,c.433C>G菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖5是本發(fā)明陽(yáng)性質(zhì)控品TNNI3,c.433C毛細(xì)管電泳檢測(cè)；

圖6是本發(fā)明陽(yáng)性質(zhì)控品TNNI3,c.433G毛細(xì)管電泳檢測(cè)；

圖7是本發(fā)明陽(yáng)性質(zhì)控品MYH7,c.2155C>T菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖8是本發(fā)明陽(yáng)性質(zhì)控品MYH7,c.2155C毛細(xì)管電泳檢測(cè)；

圖9是本發(fā)明陽(yáng)性質(zhì)控品MYH7,c.2155T毛細(xì)管電泳檢測(cè)；

圖10是本發(fā)明陽(yáng)性質(zhì)控品MYH7,c.1987C>T菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖11是本發(fā)明陽(yáng)性質(zhì)控品MYH7,c.1987C毛細(xì)管電泳檢測(cè)；

圖12是本發(fā)明陽(yáng)性質(zhì)控品MYH7,c.1987T毛細(xì)管電泳檢測(cè)；

圖13是本發(fā)明陽(yáng)性質(zhì)控品PRKAG2,c.298G>A菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖14是本發(fā)明陽(yáng)性質(zhì)控品PRKAG2,c.298G毛細(xì)管電泳檢測(cè)；

圖15是本發(fā)明陽(yáng)性質(zhì)控品PRKAG2,c.298A毛細(xì)管電泳檢測(cè)；

圖16 TaqMan-MGB的靈敏性檢驗(yàn)，其中，圖16(A)-圖16(B)分別為MYH7，1987CC基因型的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖16(C)-圖16(D)分別為MYH7，1987TT的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖17變異位點(diǎn)MYH7,1987C>T的TaqMan-MGB特異性檢測(cè)，其中，F(xiàn)AM代表野生型探針，HEX代表突變型探針，圖17(A)為野生型模板，圖17(B)為純合突變型模板，圖17(C)為雜合突變模板，圖17(D)為不同基因型的散點(diǎn)圖分布；

圖18 TaqMan-MGB的靈敏性檢驗(yàn)，其中，圖18(A)-圖18(B)分別為TNNI3，370GG基因型的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖18(C)-圖18(D)分別為TNNI3，370CC的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖19變異位點(diǎn)TNNI3,370G>C的TaqMan-MGB特異性檢測(cè)，其中，F(xiàn)AM代表野生型探針，HEX代表突變型探針，圖19(A)為野生型模板，圖19(B)為純合突變型模板，圖19(C)為雜合突變模板，圖19(D)為不同基因型的散點(diǎn)圖分布；

圖20 TaqMan-MGB的靈敏性檢驗(yàn)，其中，圖20(A)-圖20(B)分別為MYH7，2155CC基因型的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖20(C)-圖20(D)分別為MYH7，2155TT的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖21變異位點(diǎn)MYH7,2155C>T的TaqMan-MGB特異性檢測(cè)，其中，F(xiàn)AM 代表野生型探針，Cy5代表突變型探針，圖21(A)為野生型模板，圖21(B)為純合突變型模板，圖21(C)為雜合突變模板，圖21(D)為不同基因型的散點(diǎn)圖分布；

圖22 TaqMan-MGB的靈敏性檢驗(yàn)，其中，圖22(A)-圖22(B)分別為TNNI3，433CC基因型的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖22(C)-圖22(D)分別為TNNI3，433GG的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖23變異位點(diǎn)TNNI3,433C>G的TaqMan-MGB特異性檢測(cè)，其中，F(xiàn)AM代表野生型探針，HEX代表突變型探針，圖23(A)為野生型模板，圖23(B)為純合突變型模板，圖23(C)為雜合突變模板，圖23(D)為不同基因型的散點(diǎn)圖分布；

圖24 TaqMan-MGB的靈敏性檢驗(yàn)，其中，圖24(A)-圖24(B)分別為PRKAG2，298GG基因型的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖24(C)-圖24(D)分別為PRKAG2，298AA的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖25變異位點(diǎn)PRKAG2,298G>A的TaqMan-MGB特異性檢測(cè)，其中，F(xiàn)AM代表野生型探針，HEX代表突變型探針，圖25(A)為野生型模板，圖25(B)為純合突變型模板，圖25(C)為雜合突變模板，圖25(D)為不同基因型的散點(diǎn)圖分布。

圖26 10例已知基因型的肥厚型心肌病患者進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。圖26(A)-圖26(E)分別代表MYH7,c.1987C>T、TNNI3,c.370G>C、MYH7,c.2155C>T、TNNI3,c.433C>G及PRKAG2,c.298G>A 5個(gè)變異位點(diǎn)的基因分型散點(diǎn)圖。

具體實(shí)施方式

為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合附圖并通過(guò)具體實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實(shí)施例范 圍內(nèi)。

實(shí)施例1

應(yīng)用本發(fā)明方法對(duì)在云南省第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科臨床確診的5例肥厚型心肌病先證者(除收集HCM患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料外，還收集了其心電圖及超聲心動(dòng)圖)外周血基因組進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR的突變篩查，尋找可能的與HCM發(fā)病相關(guān)的致病性變異位點(diǎn)。

一種肥厚型心肌病相關(guān)致病基因熱點(diǎn)突變的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

(1)提取基因組：對(duì)入選臨床確診的肥厚型心肌病5例先證者，抽取其外周靜脈血1ml，EDTA抗凝后，采用商業(yè)化的Miniprep Kit(Axygen,美國(guó))提取其全基因組后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后、對(duì)濃度和OD值進(jìn)行測(cè)定，OD_260/280為1.8-2.0之間為可用。；

(2)以步驟(1)的基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，構(gòu)建野生型、純合突變及雜合突變陽(yáng)性質(zhì)控品；

其中，步驟(2)所述的PCR擴(kuò)增的引物的核酸序列如SEQ ID NO.21-30所示，具體如下：

，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下：

，PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果顯示目的片段大小與預(yù)期大小一致，結(jié)果如圖1、4、7、10和13分別代表攜帶有TNNI3,c.370G>C；TNNI3,c.433C>G；MYH7,c.2155C>T；MYH7,c.1987C>T和PRKAG2,c.298G>A突變位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；

構(gòu)建野生型、純合突變及雜合突變陽(yáng)性質(zhì)控品的具體步驟如下：將純化后的片段克隆到PMD-18T載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109，挑選單克隆，測(cè)序驗(yàn)證野生型和純合突變型陽(yáng)性質(zhì)粒，將野生型和純合突變型陽(yáng)性質(zhì)粒按摩爾比1:1混合后即得到雜合突變型陽(yáng)性質(zhì)控品；

(3)將步驟(2)得到的陽(yáng)性質(zhì)控品采用所述的引物組合物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，所述引物組合物如下：

具體各個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的反應(yīng)體系如下：

5個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)(MYH7-c.1987C>T、TNNI3-c.370G>C、MYH7-c2155C>T、TNNI3-c.433C>G或PRKAG2-c.298G>A)的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件均為：利用ABI7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀，循環(huán)外95℃預(yù)變性30s，循環(huán)內(nèi)95℃變性5s、56℃退火及延伸34s、45個(gè)循環(huán)，循環(huán)外60℃延伸1min。

實(shí)施例2

應(yīng)用本發(fā)明方法對(duì)在云南省第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科臨床確診的5例肥厚型心肌病先證者(除收集HCM患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)資料外，還收集了其心電圖及超聲心動(dòng)圖)外周血基因組進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR的突變篩查，尋找可能的與HCM 發(fā)病相關(guān)的致病性變異位點(diǎn)。

一種肥厚型心肌病相關(guān)致病基因熱點(diǎn)突變的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

(1)提取基因組：對(duì)入選臨床確診的肥厚型心肌病5例先證者，抽取其外周靜脈血1ml，EDTA抗凝后，采用商業(yè)化的Miniprep Kit(Axygen,美國(guó))提取其全基因組后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后、對(duì)濃度和OD值進(jìn)行測(cè)定，OD_260/280為1.8-2.0之間為可用；

(2)以步驟(1)的基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增：其中，步驟(2)所述的PCR擴(kuò)增的引物的核酸序列如SEQ ID NO.21-30所示，具體如下：

，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下：

，PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并進(jìn)行純化；

(3)PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒純化后，用PMD-18T載體 進(jìn)行T-A克隆后，篩選出陽(yáng)性克隆菌株，提取其質(zhì)粒載體。

(4)利用ABI3130毛細(xì)管電泳儀對(duì)含有克隆目的片段后的質(zhì)粒載體進(jìn)行毛細(xì)管電泳，其檢測(cè)反應(yīng)體系為：模板DNA 1μL，引物(3.2pmol/uL)1μL，BigDye(2.5x)8μL，ddH₂O 10μL；

(5)克隆載體毛細(xì)管電泳PCR反應(yīng)條件如下

(6)以靶基因MYH7(GenBank:NG_007884.1)、TNNI3(GenBank:NG_007866.2)和PRKAG2(GenBank:NG_007486.1)的基因序列為模板，利用bioedit序列分析軟件對(duì)變位點(diǎn)進(jìn)行分析。

結(jié)果如圖2、3、5、6、8、9、11、12、14和15，可以看出，全部成功構(gòu)建野生型和突變型的陽(yáng)性質(zhì)控品，

實(shí)施例3

經(jīng)條件優(yōu)化，步驟(4)所述的引物-探針的序列的重復(fù)性驗(yàn)證，分別進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)(批間和批內(nèi)重復(fù))。觀察模板的Ct值，并計(jì)算其變異系數(shù)，變異系數(shù)(p)＝標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)/平均數(shù)(X)，測(cè)試檢測(cè)方法的靈敏性和重復(fù)性。

結(jié)果如表1-2所示：

表1

表2

從表1-2可見(jiàn)，批間和批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)均小于2％，具有較好的批間和批內(nèi)重復(fù)性。

實(shí)施例4

經(jīng)條件優(yōu)化，步驟(4)所述的引物-探針的序列的特異性驗(yàn)證。

特異性驗(yàn)證以5個(gè)變異位點(diǎn)的野生型、純合突變型和雜合突變型的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，同時(shí)加入雙標(biāo)記探針，按照優(yōu)化好的條件對(duì)其進(jìn)行TaqMan-MGB的特異性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果如圖16-25所示。

結(jié)果顯示：圖16-25(A)野生型樣本反應(yīng)的曲線表現(xiàn)為野生型探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)增高，而純合突變無(wú)熒光信號(hào)或僅有很低的熒光信號(hào)；圖16-25(B) 雜合突變樣本能使野生型和突變型探針都表現(xiàn)出相對(duì)較高的熒光信號(hào)；圖16-25(C)純合突變表現(xiàn)為只有突變型探針產(chǎn)生熒光信號(hào)，圖16-25(D)野生型探針不產(chǎn)生熒光信號(hào)或產(chǎn)生較少的熒光信號(hào)。更重要的是，通過(guò)反應(yīng)結(jié)果的散點(diǎn)圖可以明顯看出不同基因型的樣本單獨(dú)成簇。

實(shí)施例5

本發(fā)明中，對(duì)來(lái)自于已知(Sanger測(cè)序)基因型的10例肥厚型心肌病患者進(jìn)行該5個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)進(jìn)行突變檢測(cè)。圖26(A-E)分別代表MYH7,c.1987C>T、TNNI3,c.370G>C、MYH7,c.2155C>T、TNNI3,c.433C>G及PRKAG2,c.298G>A 5個(gè)變異位點(diǎn)的基因分型散點(diǎn)圖。檢測(cè)結(jié)果與Sanger測(cè)序結(jié)果一致，準(zhǔn)確率為100％，具體基因型檢測(cè)結(jié)果比例見(jiàn)表3所示。

表3

綜上所述，由實(shí)施例5的結(jié)果分析可得出，本發(fā)明建立了肥厚型心肌病主要致病基因的簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的遺傳篩查方法。

申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)方法才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 昆明理工大學(xué)

<120> 一種引物組合物及其應(yīng)用

<130> 2017

<160> 30

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 1

cctccagccc catgtctg 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 2

taggagaacg ggaacacggt 20

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

aagaccagcc ccggc 15

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 4

aagaccagcc ccagc 15

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 5

gaccttcgag gcaagtttaa gc 22

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 6

cagcgcctgc atcatgg 17

<210> 7

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 7

accctgcgga gagt 14

<210> 8

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 8

accctgggga gagt 14

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 9

tggccacagg aaaatctgaa c 21

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 10

tgtggcctca cctggagact 20

<210> 11

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 11

caacttgcgc tcca 14

<210> 12

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 12

ccaacttgtg ctcca 15

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 13

gtgtggacaa ggtggatgaa ga 22

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 14

ccaagtccca gccatctcac 20

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 15

aagaacatca cggaggt 17

<210> 16

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 16

aagaacatca cgcaggt 17

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 17

cccaaccgca tcctctacg 19

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 18

gagctctggt gcaccctcat 20

<210> 19

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 19

cttccggcag aggt 14

<210> 20

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 20

acttctggca gaggt 15

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 21

gcagaatcca tgtccacctg t 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 22

tgtcctagga ggtcctgttc c 21

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 23

aggtctccct gtttttggtt cc 22

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 24

ggaccttcat gtacctcttt gctct 25

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 25

gctaatcagt gacaaagcca ggatc 25

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 26

agggtggaag agccaacagt agc 23

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 27

gcctaagccg ggaagagact ggta 24

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 28

gaggacccct tactagctgc ttct 24

<210> 29

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 29

cagtcctgtg tggtcagaac ttgg 24

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 30

ggaccagaag gattacgctt tgat 24