本發(fā)明屬于生物可降解塑料合成和廢物資源化利用技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種從活性污泥中馴化利用甲烷合成聚-β-羥基丁酸酯(phb)的甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群的方法。

背景技術(shù)：

phb是一種微生物在生長(zhǎng)限制條件下合成的碳源貯存物，具有良好材料性能、生物相容性和生物可降解性，是一種非常具有前景的傳統(tǒng)石油化工塑料替代品。

傳統(tǒng)的phb發(fā)酵一般利用純菌為菌種，在以葡萄糖、蔗糖等商業(yè)化碳源為底物的條件下進(jìn)行，高的phb生產(chǎn)成本嚴(yán)重限制了phb的廣泛應(yīng)用。利用含有機(jī)物的廢物為底物，以活性污泥為菌種進(jìn)行phb發(fā)酵既可以大大降低phb生產(chǎn)過(guò)程的底物成本，又可以省去因維護(hù)無(wú)菌環(huán)境而帶來(lái)的運(yùn)行費(fèi)用。

在化石燃料(煤炭、石油和天然氣)的開(kāi)采過(guò)程和有機(jī)廢物的厭氧消化過(guò)程都會(huì)產(chǎn)生大量的甲烷，甲烷作為全球第二大溫室氣體，其全球變暖潛勢(shì)最高可為二氧化碳的72倍。利用甲烷為底物進(jìn)行phb生產(chǎn)，既可以降低phb的生產(chǎn)成本又可以減少全球溫室氣體的排放。研究表明以含有甲烷的廢氣為底物可以使phb的生產(chǎn)成本降低約30-35％[1]，而利用現(xiàn)有的垃圾填埋場(chǎng)和厭氧消化系統(tǒng)釋放的甲烷合成phb，則其產(chǎn)量可以代替現(xiàn)在塑料市場(chǎng)的20-30％[2]。

甲烷氧化菌在好氧條件下，首先利用甲烷單加氧酶(mmo)將甲烷氧化為甲醇，然后通過(guò)一系列的酶促反應(yīng)將甲醇依次氧化為甲醛、甲酸和二氧化碳，并在此過(guò)程中獲得自身生命活動(dòng)所需的能量。甲烷氧化菌可分為甲烷氧化i型菌和甲烷氧化ii型菌，然而只有甲烷氧化ii型菌具有phb合成能力。大量的異養(yǎng)菌也具有phb合成能力，在自然界中甲烷氧化菌經(jīng)常與其它異養(yǎng)菌共存，甲烷氧化菌通過(guò)甲烷氧化過(guò)程釋放的代謝產(chǎn)物為其它異養(yǎng)菌提供碳源，而其它異養(yǎng)菌通過(guò)去除有毒的代謝產(chǎn)物或提供必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)刺激甲烷氧化菌的生長(zhǎng)。

在甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群中，甲烷氧化ii型菌為優(yōu)勢(shì)菌群時(shí)，會(huì)更利于混合菌群的phb合成能力，而高的mmo酶活會(huì)促進(jìn)甲烷向其他可被異養(yǎng)菌利用的有機(jī)物的轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步提高甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群的phb合成能力，通過(guò)合適的馴化條件，可以富集出穩(wěn)定的具有高phb合成能力的甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群。

[1]listewnikhf,wendlandtkd,jechorekm,etal.processdesignforthemicrobialsynthesisofpoly-β-hydroxybutyrate(phb)fromnaturalgas[j].engineeringinlifesciences,2007,7(3):278-282.

[2]rostkowskikh,criddlecs,lepechmd.cradle-to-gatelifecycleassessmentforacradle-to-cradlecycle:biogas-to-bioplastic(andback)[j].environmentalscience&technology,2012,46(18):9822-9829.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種高效利用甲烷產(chǎn)phb的甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群的馴化方法，在降低phb生產(chǎn)成本的同時(shí)，減少溫室氣體的排放。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種利用甲烷產(chǎn)聚-β-羥基丁酸酯的甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群的馴化方法，步驟如下：

步驟1：將富含微生物的活性污泥作為富集馴化甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群的原料；

步驟2：培養(yǎng)基的配制

(1)配制不含氮元素的礦物鹽nfms培養(yǎng)基，其組成為：0.272g/l的kh2po4,2.868g/l的na2hpo4·h2o，0.1g/l的mgso4·7h2o，0.20g/l的cacl2·6h2o和1ml/l的微量元素；

(2)配制微量元素溶液：250mg/l的na-edta，500mg/l的feso4·7h2o，380mg/l的fe-edta，400mg/l的znso4·7h2o，15mg/l的h3bo3，20mg/l的mncl2·4h2o，260mg/l的na2moo4·2h2o，10mg/l的nicl2·6h2o，50mg/l的cocl2·6h2o；

(3)配制cuso4·5h2o儲(chǔ)備液；

(4)向nfms培養(yǎng)基加入cuso4·5h2o儲(chǔ)備液，使cuso4的摩爾濃度為5-10μmol/l，以提高混合菌群的mmo活性；

步驟3：甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群的富集馴化

(1)向體系中加入活性污泥和步驟2(4)得到的nfms培養(yǎng)基，使體系頂空和液相的體積比為2:1-5:1，將體系密封；

(2)更換頂空氣體，使頂空氣體的組成為10-20％的氧氣、25％的甲烷氣和55-65％的氮?dú)猓灰约淄闅鉃槲ㄒ惶荚?，以氮?dú)庾鳛轳Z化過(guò)程唯一氮源，進(jìn)行甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群的富集馴化；為保證充足的氣體底物，每24-72小時(shí)更換一次頂空氣體；

(3)每6-10天按4-10％的體積比例將富集到的菌液接種到新的步驟2(4)得到的nfms培養(yǎng)基中，以保證充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

步驟4：phb合成過(guò)程

(1)在每次循環(huán)結(jié)束時(shí)，收集菌體進(jìn)行phb合成。

(2)向體系中加入收集的菌體和新的含有5-10μmol/lcuso4的nfms培養(yǎng)，使體系頂空和液相的體積比為5:1-11:1，將體系密封；

(3)更換頂空氣體，使頂空氣體的組成為50-75％甲烷和25-50％氧氣，在沒(méi)有氮源的條件下進(jìn)行phb合成。為保證充足的氣體底物，每24-48小時(shí)更換一次頂空氣體，約72小時(shí)后，phb的合成過(guò)程完成。

步驟5：經(jīng)過(guò)約220-320天后的培養(yǎng)后，甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群的馴化完成，菌液呈白色，含有大量的微小絮體，而且混合菌群的phb合成能力穩(wěn)定。獲得的甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群中，甲烷氧化菌由四種甲烷氧化ii型菌構(gòu)成，而且含有大量的具有高phb合成能力的異養(yǎng)微生物。

本發(fā)明的效果和益處是：本發(fā)明選擇合適的富集條件，從活性污泥中馴化出具有高效利用甲烷合成phb能力的甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群，在降低phb生成成本的同時(shí)減少溫室氣體的排放，而且獲得的phb產(chǎn)品在廢棄不用時(shí)可以在厭氧條件下再次降解為甲烷，實(shí)現(xiàn)底物的循環(huán)利用。

附圖說(shuō)明

圖1是在不同馴化階段甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群利用甲烷合成phb的曲線。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和技術(shù)方案，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方式。

甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群的馴化過(guò)程主要分兩步進(jìn)行：一、選擇適當(dāng)?shù)臈l件壓力對(duì)活性污泥進(jìn)行馴化，富集甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群；二、在沒(méi)有氮源的條件下，利用富集的甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群進(jìn)行phb合成。

實(shí)施例1

(1)從遼寧省大連市付家莊市政污水處理廠的二沉池收取活性污泥，以該活性污泥作為馴化的種子污泥。

(2)配制nfms培養(yǎng)基，加入cuso4儲(chǔ)備液，使cuso4的濃度為5-10μmol/l。然后利用1mol/l的氫氧化鈉溶液將nmfs培養(yǎng)基的ph調(diào)節(jié)為6.8。

(3)通過(guò)離心和重懸的方法，利用上述nmfs培養(yǎng)基對(duì)種子污泥進(jìn)行洗滌并稀釋，使最終的污泥濃度約為1500mg/l.

(4)將50ml上述稀釋后的種子污泥接種至300ml的血清瓶中，并使用橡膠塞和螺帽密封。

(5)利用帶有過(guò)濾器的細(xì)針頭使上述含有種子污泥的300ml血清瓶與大氣連通，然后利用抽真空和氣體重新注入的方法，使血清瓶頂空氣體的組成為10-20％的氧氣、25％的甲烷氣和55-65％的氮?dú)?。利用帶有熱?dǎo)檢測(cè)器的氣相色譜定期監(jiān)測(cè)頂空的氣體組成，并每24小時(shí)更換一次頂空氣體，以保證充足的氣體底物。

(6)將含有種子污泥的300ml血清瓶放置在30℃、150r/min的搖床中，進(jìn)行甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群的培養(yǎng)。每隔10天，將富集到的菌液接種到新的含有5-10μmol/lcuso4的nfms培養(yǎng)中，接種比例為10％，如此循環(huán)10次。然后將接種比例降低至4％并每隔6-7天進(jìn)行一次接種。

(7)每次循環(huán)結(jié)束后，利用離心機(jī)在10000r/min的條件下離心5分鐘收集菌體，然后將收集的菌體重懸至含有5μmol/lcuso4的nfms培養(yǎng)基中，使污泥濃度約為1266.3mg/l，進(jìn)行phb合成。

(8)將上述重懸后的甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群接種至一系列120ml的血清中，每個(gè)血清瓶含有10ml的菌液，利用橡膠塞和螺帽密封。

(9)利用帶有過(guò)濾器的細(xì)針頭使含有菌液的120ml血清瓶與大氣連通，然后利用抽真空和氣體重新注入的方法，使血清瓶頂空氣體的組成為25-50％的氧氣和50-75％的甲烷。利用帶有熱導(dǎo)檢測(cè)器的氣相色譜定期監(jiān)測(cè)頂空的氣體組成，并每24小時(shí)更換一次頂空氣體，以保證充足的氣體底物。

(10)將含有富集的甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群的120ml血清瓶放置在30℃、150r/min的搖床中，進(jìn)行phb合成。經(jīng)過(guò)72小時(shí)后，甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群的phb合成過(guò)程完成，在此期間定期每次取兩個(gè)120ml血清瓶，檢測(cè)混合菌群細(xì)胞內(nèi)phb含量的變化。

(11)活性污泥經(jīng)過(guò)220天的馴化后，利用甲烷合成phb的能力開(kāi)始穩(wěn)定，320天后馴化完成，菌液呈現(xiàn)白色并含有大量的微小絮體。富集的甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群在馴化100天、220天和320天后的phb合成曲線如圖1所示。

(12)馴化結(jié)束后，對(duì)富集的甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群進(jìn)行微生物群落分析，獲得的甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群中，甲烷氧化菌由四種甲烷氧化ii型菌構(gòu)成：methylocella，methylosinus，methylocystis和methylocapsa。異養(yǎng)菌主要由beijerinckia，sphingomonas，pseudomonas和methylophilus構(gòu)成。

實(shí)施例2

從遼寧省大連市凌水河市政污水處理廠的二沉池收取活性污泥，以該污泥作為馴化甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群的種子污泥，其它實(shí)施方式與實(shí)施例1相同。

實(shí)施例3

從遼寧省大連市春柳河市政污水處理廠的二沉池收取活性污泥，以該污泥作為種子污泥進(jìn)行甲烷氧化菌-異養(yǎng)菌混合菌群的馴化，其他實(shí)施方式與實(shí)施例1相同。