本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥和功能性食品領(lǐng)域，具體涉及一種利用雙氧水氧化降解法制備亞麻籽膠低聚糖的方法。

背景技術(shù)：

低聚糖(oligosaccharide)，又稱寡糖，是指由2-10個(gè)單糖分子通過各種特異性糖苷鍵連接而成的一種低分子糖類。低聚糖種類繁多，廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物組織或代謝產(chǎn)物中，按其是否具有生理保健功能可分普通低聚糖，和功能性低聚糖。功能性低聚糖因其普遍具有增值雙歧桿菌、調(diào)節(jié)胃腸功能、預(yù)防齟齒、保護(hù)肝臟、抗腫瘤、抗衰老、增強(qiáng)免疫力等一系列特殊的生理功能，近年來備受關(guān)注，發(fā)展迅猛，是食品科學(xué)乃至生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，各種新型低聚糖的研究也不斷涌現(xiàn)和深入，市場(chǎng)上低聚糖產(chǎn)品也不斷增加。

亞麻籽膠(flaxseedgum)，又名富蘭克膠、胡麻膠，是從一年生草本植物亞麻的種子亞麻籽中獲得的一種以多糖為主要成分的天然植物種子膠。我國(guó)具有多年亞麻栽培歷史，資源豐富，產(chǎn)量?jī)H次于加拿大、印度，居世界第三位，主要分布于內(nèi)蒙古、甘肅、新疆等地。亞麻籽中含有豐富的脂肪、蛋白質(zhì)、纖維素、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分以及ω-3不飽和脂肪酸、木酚素、水溶性植物膠等功能因子，具有很高的科研價(jià)值及潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。其中亞麻籽膠是除了脂肪、蛋白質(zhì)以外含量最豐富的一種物質(zhì)，目前主要用作食品添加劑，其它應(yīng)用及產(chǎn)品開發(fā)還不多見。亞麻籽膠的主要成分是一種大分子聚合物多糖，可通過物理、化學(xué)或生物(酶)的方法切斷其糖苷鍵，從而釋放出更低聚合度的小分子糖，可考慮作為制備新型低聚糖的良好資源。

目前低聚糖制備的方法主要有從天然產(chǎn)物中提取純化而得(例如cn101463052a，一種龍眼果皮低聚糖的制備方法)、酶法制備(例如cn105410948a，一種水溶性葛根纖維低聚糖及其制備方法)等，然而由于天然產(chǎn)物中低聚糖含量有限，且分離純化工藝要求很高，因此從天然產(chǎn)物中直接分離純化有其應(yīng)用局限性；酶法由于較為溫和且專一性很高，對(duì)于一些難降解的雜多糖并不適用。例如對(duì)于亞麻籽膠而言，由于其多糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，酶法并不能十分有效地降解。雙氧水氧化降解法作為一種新型化學(xué)降解方法，且其還原產(chǎn)物為水，不會(huì)引入其他雜質(zhì)，綠色安全。有個(gè)別文獻(xiàn)涉及雙氧水輔助酸水解法降解多糖制備低聚糖(cn201310077612.6，一種魔芋葡甘低聚糖的制備方法及其所采用的薄膜蒸發(fā)器，此法工藝復(fù)雜，對(duì)于該專利涉及的原料采用酶法更為簡(jiǎn)單實(shí)用)，但利用高壓輔助雙氧水氧化降解法制備功能性低聚糖尚未見報(bào)道，尤其是利用該方法降解亞麻籽膠制備具有抗氧化活性的新型低聚糖更未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)傳統(tǒng)酶法降解亞麻籽膠的局限性，本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有抗氧化活性的新型低聚糖—亞麻籽膠低聚糖的制備方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述制備方法獲得的具有抗氧化活性的亞麻籽膠低聚糖，以及提供上述新型亞麻籽膠低聚糖的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及抗氧化活性。

本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種利用雙氧水氧化降解法制備亞麻籽膠低聚糖的方法，包括以下步驟：

(1)亞麻籽膠的溶解：取市售亞麻籽膠動(dòng)態(tài)溶解于適量濃度的雙氧水溶液中，使亞麻籽膠充分溶解，亞麻籽膠的添加量不高于5％(w/v)；

(2)亞麻籽膠的氧化降解：取步驟(1)獲得的亞麻籽膠液，于密封高壓條件下氧化降解，控制一定的反應(yīng)時(shí)間及反應(yīng)溫度，反應(yīng)結(jié)束后取出冷卻；

(3)亞麻籽膠低聚糖的脫色：將步驟(2)獲得的降解混合溶液進(jìn)行抽濾并反復(fù)洗滌濾餅，合并濾出液，在適宜溫度下采用活性炭震蕩吸附脫色，直至糖液變?yōu)榈S色或無色(以無色為佳)，濾去活性炭，取濾出液；

(4)亞麻籽膠低聚糖的超濾及透析：將步驟(3)獲得脫色糖液進(jìn)行超濾處理，棄去超濾濃縮液，取濾出液，適當(dāng)濃縮后進(jìn)行透析處理；

(5)亞麻籽膠低聚糖的干燥：將步驟(4)獲得的經(jīng)透析處理后的糖液進(jìn)行真空濃縮后冷凍干燥，得到所述亞麻籽膠低聚糖。

步驟(1)所述的動(dòng)態(tài)溶解是指于容器中加入適量特定濃度的雙氧水溶液，內(nèi)置一顆梭形轉(zhuǎn)子，高速攪拌(500r/min以上)狀態(tài)下加入亞麻籽膠，使亞麻籽膠充分溶解成粘液狀。

步驟(2)所述的氧化降解亞麻籽膠的條件為：雙氧水濃度為0.1–0.6mol/l，反應(yīng)溫度80–125℃，反應(yīng)時(shí)間0.5–3.0h。

步驟(2)中將亞麻籽膠液分裝于螺紋口玻璃瓶中，密閉，置于高壓蒸汽滅菌鍋中實(shí)現(xiàn)高壓(相對(duì)壓力0.05mpa以上)輔助雙氧水降解亞麻籽膠，高壓蒸汽滅菌鍋可采用全自動(dòng)可控溫立式高壓蒸汽滅菌鍋。

步驟(3)所述的抽濾是采用雙圈定性濾紙進(jìn)行抽濾；所述的脫色過程是采用粉末活性炭震蕩吸附脫色法，活性炭添加量為糖液體積的1％(w/v)，脫色溫度控制為40–60℃，脫色2–3次，每次脫色時(shí)間1–2h。

步驟(4)所述的超濾是采用實(shí)驗(yàn)級(jí)切向流濃縮純化透析系統(tǒng)(配有pelliconxl50cm²管匣，截留分子量不低于5000da)進(jìn)行超濾處理，控制進(jìn)料口壓力及回流壓力；所述的透析是采用即用型透析袋，截留分子量為500–1000da，透析時(shí)間為24h，期間每隔4h換一次水，透析結(jié)束后取透析袋內(nèi)截留糖液。

步驟(5)所述的真空濃縮是采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，控制溫度為60℃、真空度為0.10mpa進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原有體積的5–10％；所述的冷凍干燥是控制冷阱溫度為-50℃，真空度為50pa，冷凍干燥時(shí)間為10–16h，視樣品干燥情況可適當(dāng)延長(zhǎng)或縮短干燥時(shí)間。

上述制備方法獲得了具有抗氧化活性的亞麻籽膠低聚糖(fgos)，所述fgos為半固態(tài)粘稠狀，呈淺紅棕色，有特殊香味，易溶于水，難溶于乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑，易吸濕；純度分析表明其為典型糖類物質(zhì)，并含有糖醛酸，為酸性低聚糖。

所述fgos組分均一，經(jīng)尺寸排阻色譜法(sec)測(cè)定其平均分子量為1047da，紅外光譜分析表明fgos具有吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)，屬吡喃糖；

所述fgos經(jīng)毛細(xì)管氣相色譜分析表明是由鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖及葡萄糖7種單糖組成，其摩爾百分比分別為8.26％、7.54％、12.85％、7.93％、29.31％、14.28％、19.82％，原料來源不同可導(dǎo)致單糖種類和相對(duì)含量的差異；

所述fgos具有一定的抗氧化能力，對(duì)羥自由基、dpph自由基、abts自由基、超氧陰離子自由基的清除率分別不低于82％、52％、91％、73％。

上述具有抗氧化活性的新型低聚糖—亞麻籽膠低聚糖(fgos)可作為抗氧化制劑、藥品及功能食品配料。

與現(xiàn)有低聚糖的制備技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

(1)本發(fā)明針對(duì)傳統(tǒng)酶法降解亞麻籽膠的局限性，首次采用高壓輔助雙氧水氧化降解法對(duì)市售亞麻籽膠進(jìn)行降解，相比于酶法，雙氧水氧化降解法能不受亞麻籽膠多糖分子復(fù)雜支鏈結(jié)構(gòu)的影響而高效地切斷其主鏈分子中的糖苷鍵，從而獲得了一種新型低聚合度的小分子糖—fgos，并采用脫色、超濾、透析等一系列簡(jiǎn)單處理工藝對(duì)fgos進(jìn)行了有效的分離純化。

(2)為了深入研究亞麻籽膠低聚糖，我們還對(duì)分離純化后的fgos進(jìn)行了理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)組成及抗氧化活性的分析和討論。本發(fā)明利用純度分析實(shí)驗(yàn)、傅里葉紅外變換光譜、尺寸排阻色譜、毛細(xì)管氣相色譜等方式對(duì)fgos進(jìn)行了理化性質(zhì)分析及結(jié)構(gòu)表征，并通過羥基自由基清除試驗(yàn)、dpph自由基清除試驗(yàn)、abts自由基清除試驗(yàn)及超氧陰離子自由基清除試驗(yàn)表明fgos具有良好的抗氧化效果。

(3)本發(fā)明采用已經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)的市售亞麻籽膠為原料，有方便、經(jīng)濟(jì)的原料基礎(chǔ)，制備方法簡(jiǎn)單可靠，綠色安全，產(chǎn)品具有優(yōu)良的理化特性及抗氧化能力，可考慮作為功能性食品配料，本發(fā)明拓寬了亞麻籽膠的應(yīng)用范圍，為亞麻籽膠及其產(chǎn)品深開發(fā)提供了理論參考和現(xiàn)實(shí)依據(jù)。

附圖說明

圖1是fgos的制備、純化、性質(zhì)及應(yīng)用技術(shù)流程圖。

圖2是各因素對(duì)亞麻籽膠降解率的影響圖，a、b、c分別是溫度、雙氧水濃度、反應(yīng)時(shí)間，原料亞麻籽膠濃度為2％。

圖3是各因素處理后分子量的變化圖，a、b、c分別是溫度、雙氧水濃度、反應(yīng)時(shí)間，原料亞麻籽膠濃度為2％。

圖4是fgos的紫外全波長(zhǎng)掃描圖。

圖5是fgos及亞麻籽膠紅外光譜圖。

圖6是fgos及其對(duì)照品的sec洗脫曲線。

圖7是fgos單糖組成氣相色譜圖，其中a是單糖標(biāo)品，b是fgos。

圖8是fgos抗氧化試驗(yàn)結(jié)果，其中a是羥自由基清除試驗(yàn)，b是dpph自由基清除試驗(yàn)，c是abts自由基清除試驗(yàn)，d是超氧陰離子自由基清除試驗(yàn)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1：制備亞麻籽膠低聚糖

按照以下步驟制備亞麻籽膠低聚糖：

(1)亞麻籽膠的溶解：取市售亞麻籽膠動(dòng)態(tài)連續(xù)攪拌狀態(tài)下溶解于0.1–0.6mol/l的雙氧水溶液中，使亞麻籽膠充分溶解，亞麻籽膠的添加量為2％(w/v，100ml雙氧水溶液中加入的亞麻籽膠質(zhì)量為2g)；

(2)亞麻籽膠的氧化降解：取步驟(1)獲得的亞麻籽膠液，以每份100ml分裝于150ml螺紋口玻璃瓶中，密閉，置于高壓蒸汽滅菌鍋中降解，控制反應(yīng)時(shí)間0.5–3.0h，反應(yīng)溫度80℃–125℃，反應(yīng)結(jié)束后取出冷卻至室溫；

(3)脫色：將步驟(2)獲得的混合料液進(jìn)行抽濾并反復(fù)洗滌濾餅，合并收集濾出液，采用1％(w/v，100ml濾出液中加入的活性炭質(zhì)量為1g)的粉末活性炭于50℃下反復(fù)震蕩脫色，直至糖液變?yōu)榈S色以至無色(約2-3次，每次脫色2.0h)，濾去活性炭，得脫色糖液；

(4)超濾：將步驟(3)獲得的脫色糖液采用實(shí)驗(yàn)級(jí)切向流濃縮純化透析系統(tǒng)(配有pelliconxl50cm²管匣，截留分子量為5000da)進(jìn)行超濾處理，控制進(jìn)料口壓力為30psi，回流壓力為10psi，取超濾濾出液；

(5)透析：將步驟(4)獲得的超濾濾出液進(jìn)行適當(dāng)濃縮后采用md34(500)即用型透析袋(截留分子量為500da)，進(jìn)行透析處理，透析時(shí)間為24h，期間每隔4h換一次水，透析結(jié)束后取透析袋內(nèi)截留糖液；

(6)干燥：將步驟(5)所得的糖液合并后在60℃、0.10mpa下進(jìn)行真空濃縮至適當(dāng)體積后置于-18℃冰箱過夜冷凍，然后采用scientz-10n冷凍干燥機(jī)，控制冷阱溫度為-50℃，真空度為50pa進(jìn)行冷凍干燥，凍干時(shí)間為12h左右，視樣品干燥情況可適當(dāng)延長(zhǎng)或縮短干燥時(shí)間。

實(shí)施例2：亞麻籽膠降解效果的評(píng)價(jià)

按照下述方法評(píng)價(jià)亞麻籽膠的降解效果：

(1)亞麻籽膠降解率的變化：

反應(yīng)結(jié)束后取出冷卻，冰水浴10min停止反應(yīng)，抽濾，并用蒸餾水反復(fù)洗滌濾餅，合并濾液，濃縮至100ml，取0.10ml，采用dns比色法測(cè)還原糖含量；另取0.01ml，采用苯酚-硫酸法測(cè)總糖含量，以還原性末端糖基得率按(1)式計(jì)算亞麻籽膠降解效果，結(jié)果如圖2所示。

由圖2中的a可知，當(dāng)溫度低于110℃時(shí)亞麻籽膠的降解程度很小，當(dāng)溫度高于110℃時(shí)，亞麻籽膠的降解率迅速增大，并在120℃時(shí)幾乎達(dá)到最大值，溫度繼續(xù)升高降解率雖然略有增大，但趨勢(shì)并不明顯。且溫度高于120℃時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的繼續(xù)升高，降解產(chǎn)物色澤略有加深；由圖2中的b可知，當(dāng)雙氧水濃度低于0.2mol/l時(shí)，亞麻籽膠的降解率隨雙氧水濃度的增大而增大，當(dāng)雙氧水濃度高于0.2mol/l時(shí)，雙氧水的降解率反而有所下降，且從產(chǎn)物表觀上來看，雙氧水濃度越高，產(chǎn)物色澤越淺；由圖2中的c可知，亞麻籽膠的降解率一開始隨時(shí)間的延長(zhǎng)幾乎呈線性增大，直至2h后，降解率幾乎不再增加，從產(chǎn)物表觀上來看，在雙氧水濃度為0.2mol/l時(shí)，反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)使產(chǎn)物色澤加深。

(2)降解產(chǎn)物分子量變化

采用hplc-sec法測(cè)定降解產(chǎn)物分子量變化。取適量抽濾濾出液，必要時(shí)稀釋，過0.45μm微孔濾膜，自動(dòng)采樣10μl進(jìn)行液相分析。液相分析條件為：采用lc-20ad高效液相色譜儀，tskgelg6000pwxl、tskgelg5000pwxl、tskgelg3000pwxl三柱聯(lián)用，并配用保護(hù)柱tskpwxlguardcolumn，elsd檢測(cè)器(漂移管溫度為110℃，氣流速度為3.0l/min)，流動(dòng)相為milli-q超純水，等度洗脫，流速為0.5ml/min，分析時(shí)間為70min，結(jié)果如圖3所示。

由圖3中的a可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，產(chǎn)物的洗脫時(shí)間逐漸增大，表明產(chǎn)物的分子量在不斷減小，以分子量為1000的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(dex1000)為目標(biāo)分子量，可見在120℃左右，產(chǎn)物峰位分子量為約為1000，有較為理想的洗脫曲線。由圖3中的b可知，雙氧水濃度為0.1mol/l時(shí)，產(chǎn)物峰位分子量依舊很大，雙氧水濃度為0.2mol/l時(shí)，產(chǎn)物的峰位洗脫時(shí)間接近dex1000的洗脫時(shí)間，且全部洗脫出來所需時(shí)間較短，峰形也較為對(duì)稱，這表明產(chǎn)物的多分散系數(shù)(mw/mn)相對(duì)較低，即產(chǎn)物的相對(duì)分子量較為集中；當(dāng)雙氧水濃度高于0.2mol/l時(shí)，產(chǎn)物的峰位分子量也接近1000，但洗脫所需時(shí)間較長(zhǎng)，表明產(chǎn)物的多分散系數(shù)較高，即分子量比較分散；由圖3中的c可知，反應(yīng)時(shí)間很短時(shí)，產(chǎn)物洗脫曲線仍接近亞麻籽膠本身的洗脫曲線，但隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)，產(chǎn)物的洗出時(shí)間逐漸滯后，表明產(chǎn)物分子量在逐漸降低，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2.0及2.5h時(shí)，產(chǎn)物的峰位分子量均較為接近1000，且有較低的多分散系數(shù)。

(3)黏度的變化

降解產(chǎn)物在25℃下保持10min后采用snb-1型數(shù)字旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)配以合適的轉(zhuǎn)子測(cè)定其黏度值，結(jié)果如表1所示，由表1可知，亞麻籽膠的初始黏度值很大，2％的亞麻籽膠黏度即達(dá)到2883.33mpa·s^-1。從反應(yīng)溫度來看，當(dāng)溫度低于100℃時(shí)，亞麻籽膠并未降解，并表現(xiàn)出比初始值還高的黏度，當(dāng)溫度高于100℃時(shí)，亞麻籽膠逐漸被降解，黏度不斷減??；從雙氧水濃度來看，雙氧水濃度很低時(shí)，表現(xiàn)在降解率(端基還原糖得率)上其降解程度并不高，但黏度值卻降低很多，這是由于亞麻籽膠被降解后其與水分子之間形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)潰散，因而表現(xiàn)出較低的黏度；從反應(yīng)時(shí)間上來看，在反應(yīng)初期(前5min內(nèi))亞麻籽膠黏度并未降低，反而有所上升，但隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，·oh不斷釋放，亞麻籽膠被逐漸降解，表觀黏度逐漸降低。

表1各因素處理后產(chǎn)物黏度值

注：初始粘度指2％亞麻籽膠液的黏度，數(shù)據(jù)顯示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

綜合上述考慮降解率、黏度及分子量等指標(biāo)的變化，本發(fā)明優(yōu)先采用濃度為0.2mol/l的雙氧水于120℃降解亞麻籽膠2.0h，并按照實(shí)施例1中(3)–(6)的步驟進(jìn)行處理，最終得到fgos，產(chǎn)率為44.17％。

實(shí)施例3：亞麻籽膠低聚糖(fgos)的分離純化效果評(píng)價(jià)

按照實(shí)施例1中所述的方法對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，并按照(2)式及(3)式評(píng)價(jià)脫色及超濾效果，結(jié)果如表2所示。

表2脫色及超濾結(jié)果

由表2可知，按照實(shí)施例1中所述的方法進(jìn)行脫色處理，脫色率可達(dá)86.77％，所得糖液呈理想的淺黃色；糖保留率為97.21％，幾乎沒有糖分損失。超濾前后產(chǎn)品理論平均聚合度從5.02下降到4.65，從sec洗脫曲線(圖6)來看，超濾后產(chǎn)物大分量組分寬峰(約35-45min)消失，說明超濾起到了很好的截留未降解大分子的作用，并且濾出液洗脫曲線較窄，說明產(chǎn)物的分子量比超濾前集中。另外，超濾前后糖液的od420nm減小，說明超濾還起到了一定的脫色作用(17.42％)。

實(shí)施例4：亞麻籽膠低聚糖(fgos)的理化性質(zhì)及純度分析

按照下述方法對(duì)fgos進(jìn)行理化性質(zhì)描述及純度分析。

(1)物理性質(zhì)描述：觀察產(chǎn)品，描述其形態(tài)及色、臭、水溶性、醇溶性、吸濕性等信息，結(jié)果如表3所示；

表3物理性質(zhì)及純度分析結(jié)果

(2)純度分析：取適量產(chǎn)品，溶于水配成1.0mg/ml的低聚糖溶液，分別進(jìn)行molish反應(yīng)、碘-碘化鉀反應(yīng)、雙縮脲反應(yīng)、fecl3反應(yīng)、硫酸-咔唑反應(yīng)，記錄反應(yīng)現(xiàn)象或結(jié)果，結(jié)果如表3所示。

本發(fā)明所得到fgos呈淡紅棕色半固態(tài)粘稠狀物質(zhì)，具有特殊香味，易溶于水，不溶于乙醇及乙醚，具有低聚糖類的一般特性。molisch反應(yīng)呈陽性，說明樣品中含有較多的糖組分；碘-碘化鉀反應(yīng)呈陰性，說明樣品中不含淀粉類物質(zhì)；雙縮脲反應(yīng)呈陰性，說明樣品中不含蛋白質(zhì)成分；fecl3反應(yīng)呈陰性說明樣品中不含酚類物質(zhì)；硫酸-咔唑反應(yīng)呈陽性，說明樣品中含有糖醛酸。

實(shí)施例5：亞麻籽膠低聚糖的糖醛酸含量測(cè)定

采用硫酸-卡唑法測(cè)定樣品中糖醛酸含量。取8支具塞試管，分別加入100μg/ml標(biāo)準(zhǔn)半乳糖醛酸溶液0/0.1/0.2/0.3/0.4/0.5/0.6/0.7ml，各加水至1ml，在冰水浴中加入四硼酸鈉-硫酸溶液5ml，混勻，沸水浴中加熱20min，取出后冷去至室溫，加入0.15％咔唑液0.2ml，搖勻，室溫下保持2h，523nm下測(cè)吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取1mg/ml樣品溶液0.1ml以同樣的方法處理測(cè)樣品中糖醛酸含量。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y＝0.0050x+0.0052，相關(guān)系數(shù)r²＝0.9959。用此標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得亞麻籽膠低聚糖中糖醛酸含量為12.31％±0.27。樣品中含有糖醛酸可能是由于亞麻籽膠多糖成分中的酸性多糖(主要是半乳葡甘聚糖)降解而產(chǎn)生的。

實(shí)施例6：亞麻籽膠低聚糖(fgos)的紫外全波長(zhǎng)掃描及紅外光譜分析

(1)紫外全波長(zhǎng)掃描：取1mg/ml樣品在200–800nm范圍進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果見圖4。由圖可知其在219nm左右有最大吸收，推測(cè)可能是由于糖結(jié)構(gòu)中的糖環(huán)或羰基等不飽和基團(tuán)的存在而引起的，此外，在260及280nm處未見明顯吸收峰，表明糖組分中不含大分子蛋白質(zhì)、多肽和核酸類物質(zhì)，這進(jìn)一步驗(yàn)證了雙縮脲反應(yīng)呈陰性的反應(yīng)結(jié)果。

(2)取1.0mg左右的樣品，采用涂抹法直接上機(jī)測(cè)定，紅外光譜掃描范圍為4000–400cm^-1，對(duì)照組亞麻籽膠采用溴化鉀壓片法制成薄片后上機(jī)測(cè)定，結(jié)果見圖5。對(duì)于fgos，3439cm^-1為o-h伸縮振動(dòng)(υ-oh)，3400cm^-1附近有吸收且峰形寬大也可說明說明該物質(zhì)為聚合態(tài)，且羥基的狀態(tài)為分子間締合；1739cm^-1與1642cm^-1為c＝o伸縮振動(dòng)吸收峰，1409cm^-1為c-oh彎曲振動(dòng)吸收峰，均為羧基的特征吸收峰，表明低聚糖樣品中有酸性成分即糖醛酸，這與之前糖醛酸定性定量結(jié)果一致；1217cm^-1弱吸收峰為c-h彎曲振動(dòng)吸收峰；1030cm^-1為吡喃糖環(huán)中c-o的伸縮振動(dòng)吸收峰，表明fgos為吡喃糖；937cm^-1弱吸收峰為1→4糖苷鍵的的特征吸收，推測(cè)可能是由于水解作用導(dǎo)致亞麻籽多糖主鏈結(jié)構(gòu)中的β-d-1,4-糖苷鍵暴露而引起的。比較亞麻籽膠及fgos的紅外光譜，其主要結(jié)構(gòu)并沒有改變，均為典型的糖類結(jié)構(gòu)，所不同的是由于雙氧水的氧化降解作用使亞麻籽膠分子鏈斷裂而形成小分子糖類碎片，從而產(chǎn)生相應(yīng)的特征吸收，另外還有各主要結(jié)構(gòu)片段特征吸收的的微小位移及相對(duì)強(qiáng)度的改變。

實(shí)施例7：亞麻籽膠低聚糖(fgos)分子量的測(cè)定

配制10mg/ml的亞麻籽膠低聚糖溶液，采用hplc-sec法測(cè)定其分子量，液相分析方法如實(shí)施例2中(2)所述，以各種分子量的葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以洗脫時(shí)間為橫坐標(biāo)，分子量對(duì)數(shù)值(logmw)為縱坐標(biāo)，同時(shí)測(cè)定亞麻籽膠、未超濾樣品分子量信息，結(jié)果如圖6所示。所得到的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為logmw＝-0.1584t+12.9868，線性系數(shù)為0.9838。fgos的峰位洗脫時(shí)間為62.869min，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量為1047da，平均聚合度為5.93；亞麻籽膠有兩個(gè)峰位組分，洗脫時(shí)間分別為37.921min、39.825min，相對(duì)分子質(zhì)量分別為9550kda、4770kda，由此可見組成亞麻籽膠的多糖分子具有很高的聚合度；圖中數(shù)據(jù)1是超濾之前樣品的洗脫曲線，由圖可知超濾后大分量組分寬峰(約35-45min)消失，說明超濾起到了很好的截留未降解大分子的作用，并且濾出液洗脫曲線較窄，說明產(chǎn)物的分子量比超濾前集中；數(shù)據(jù)3為對(duì)照品葡聚糖1000。

實(shí)施例8：亞麻籽膠低聚糖(fgos)單糖組成分析

采用糖腈乙酸酯衍生化氣相色譜法分析fgos的單糖組成。首先取10mg樣品用三氟乙酸進(jìn)行降解，然后與鹽酸羥胺、吡啶及乙酸酐進(jìn)行衍生化反應(yīng)(衍生化同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)單糖的衍生反應(yīng))，最后用二氯甲烷反復(fù)萃取，取有機(jī)相進(jìn)行g(shù)c分析。gc條件為：采用db-1701毛細(xì)管柱(30m×0.25m,0.25μm)，檢測(cè)器溫度240℃，汽化室溫度240℃，柱溫190℃，升溫程序如下：190℃保持2min，然后以2℃/min升溫至240℃后保持2min，載氣為氮?dú)猓魉贋?ml/min，不分流，進(jìn)樣量為1μl。

其結(jié)果和色譜分離圖譜見表4和圖7。由圖7知亞麻籽膠低聚糖由7種單糖組成，且各單糖之間分離良好。由表4知甘露糖、半乳糖、葡萄糖所占比例較大，分別為29.31％、19.82％和14.68％，阿拉伯糖和木糖所占比例反而較小，分別為12.85％和7.93％，這與一般文獻(xiàn)報(bào)道的亞麻籽多糖單糖組成(通常是阿拉伯糖合木糖含量較多)有所差異，分析原因可能有兩方面，第一，亞麻籽膠的單糖組成隨亞麻的品種、生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)周期等的不同而有所差異，第二，亞麻籽多糖有兩部分構(gòu)成，一部分是中性多糖，主要是由β-d-1,4-糖苷鍵連接而成的阿拉伯糖基木聚糖，另一部分是酸性多糖，主要是由半乳糖、葡萄糖、鼠李糖等通過α-l-1,4-糖苷鍵和α-d-1,2-糖苷鍵連接而成(此外推測(cè)本試驗(yàn)所采用的亞麻籽膠中酸性多糖組分中含有較多的甘露糖)，相比于中性多糖，酸性多糖可能較易降解，導(dǎo)致產(chǎn)物中酸性糖單糖組分含量較多。

表4fgos單糖組成測(cè)定結(jié)果

實(shí)施例9：亞麻籽膠低聚糖(fgos)抗氧化活性評(píng)價(jià)

按照下述方法對(duì)fgos進(jìn)行抗氧化活性評(píng)價(jià)。

(1)羥自由基清除試驗(yàn)：在0.6mmol/l的h2o2與1mmol/l的水楊酸鈉混合液中，加入系列濃度的fgos溶液，使其最終濃度為0.05-5.00mg/ml，并加入feso4啟動(dòng)反應(yīng)，混勻后37℃下反應(yīng)20min，然后以蒸餾水為參比，用分光光度計(jì)測(cè)510nm下吸光度值，記為a1，為消除fgos本身在510nm下吸光值的影響，以等量蒸餾水代替水楊酸鈉，按上述處理后吸光度值記為a2，空白組加等量蒸餾水代替低聚糖溶液按上述處理后吸光度值記為a0，按公式(4)計(jì)算羥基自由基清除率。

(2)dpph自由基清除試驗(yàn)：吸取系列濃度(0.05-5.00mg/ml)的待測(cè)fgos溶液1ml于玻璃試管中，加入2ml水，搖勻后加入0.2ml400μmol/l的dpph乙醇溶液，再次混合均勻后暗處放置30min，測(cè)517nm下吸光度值，記為a1，為消除fgos本身在517nm下吸光值的影響，以等量乙醇代替400μmol/l的dpph乙醇溶液，按上述處理后吸光度值記為a2，空白組加等量蒸餾水代替低聚糖溶液按上述處理后吸光度值記為a0，同樣按公式(4)計(jì)算dpph自由基清除率。

(3)abts自由基清除試驗(yàn)：分別配制2.45mmol/l的過硫酸鉀溶液及7mmol/l的abts溶液，等體積混合，室溫下暗處放置24h，得到abts自由基儲(chǔ)備液，使用時(shí)以10mmol/lph7.4的磷酸緩沖液稀釋，使其734nm下吸光度值為0.700±0.020。取3.0mlabts自由基儲(chǔ)備液，測(cè)其吸光，記為a0，加入30μl系列濃度的fgos溶液，震蕩均勻，30s后測(cè)定734nm下吸光度值，記為a1，按公式(5)計(jì)算abts自由基清除率。

(4)超氧陰離子自由基清除試驗(yàn)：取4.5mlph＝8.0的0.05mol/l磷酸鹽緩沖液置于25℃水浴中加熱20min，分別加入1ml系列濃度的fgos溶液和0.4ml25mmol/l的鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)5min，然后加入80mmol/l的hcl溶液1ml終止反應(yīng)，搖勻反應(yīng)3min后在420nm處測(cè)定吸光度，記為a1。以不加fgos溶液的處理組吸光度值計(jì)為a0，為消除fgos本身顏色的影響，不加鄰苯三酚的處理組吸光度值計(jì)為a2，按上述公式(4)計(jì)算超氧自由基清除率。

上述試驗(yàn)均同時(shí)做亞麻籽膠、葡萄糖以及抗壞血酸作對(duì)照，結(jié)果見圖8。由圖8中的a可知，fgos具有一定的羥基自由基清除能力，且隨濃度增大而增強(qiáng)，當(dāng)fgos濃度很低時(shí)，其清除·oh的能力隨濃度的增大迅速增強(qiáng)，但當(dāng)fgos達(dá)到一定濃度后(≥4.0mg/ml)，其清除·oh的能力幾乎不再增加，本試驗(yàn)中，當(dāng)fgos濃度達(dá)到5.0mg/ml時(shí)，·oh的清除可達(dá)82.6％；由圖8中的b可知，fgos在濃度低于2.0mg/ml時(shí)表現(xiàn)出隨濃度的增加而增大的清除dpph·的能力，在濃度為2.0mg/ml時(shí)其dpph·清除率可達(dá)52.7％，但隨著fgos濃度的增大，其清除dpph·的能力反而有所降低；由圖8中的c可知，亞麻籽膠低聚糖對(duì)abts·的清除能力隨著濃度的升高而逐漸增大，且這種趨勢(shì)幾乎呈線性關(guān)系(r²＝0.9860)，在所研究的濃度范圍內(nèi)，其abts·的清除率最高可達(dá)91.3％(25.0mg/ml)；由圖8中的d可知，fgos表現(xiàn)出良好的超氧陰離子清除活性，并且與濃度呈良好的正相關(guān)，當(dāng)fgos的濃度達(dá)到10mg/ml時(shí)，其超氧陰離子自由基的清除率可達(dá)到73.93％?？偟膩碚f，相比于陽性對(duì)照抗壞血酸，在相同濃度時(shí)其清除自由基的能力尚有較大差距，但相比于平行對(duì)照葡萄糖及亞麻籽膠，其清除自由基的能力明顯較優(yōu)。糖類物質(zhì)一般屬多羥基醛或酮，羥基的多少及位置、構(gòu)象等是影響其抗氧化活性的主要因素，推測(cè)亞麻籽膠在降解過程中有較多的羥基游離出來，因此表現(xiàn)出比亞麻籽膠更優(yōu)的抗氧化活性。葡萄糖等單糖一般來說抗氧化能力較弱，這于本發(fā)明的結(jié)論是一致的。

本發(fā)明公布的亞麻籽膠低聚糖(fgos)的原料來源廣泛，制備方法簡(jiǎn)單可靠，產(chǎn)物具有良好的理化性質(zhì)及抗氧化活性，可大規(guī)模生產(chǎn)。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。