本發(fā)明涉及利用基因敲除技術(shù)制備動(dòng)脈粥樣硬化疾病模型犬的方法，尤其是涉及利用基因敲除技術(shù)制備載脂蛋白e基因敲除疾病模型犬的方法。

背景技術(shù)：

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，as)是由遺傳、環(huán)境等多因素導(dǎo)致的老年多發(fā)性疾病，是冠心病、腦梗死、外周血管病等心腦血管疾病的主要原因。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化者若管徑狹窄達(dá)75％以上，可發(fā)生心絞痛、心肌梗死、心律失常，甚至猝死；腦動(dòng)脈粥樣硬化可引起腦缺血、腦萎縮，或造成腦血管破裂出血。

as病因復(fù)雜，其發(fā)病與多種致病因素有關(guān)，多發(fā)生在大中型彈性血管，肌性動(dòng)脈壁內(nèi)膜及內(nèi)膜下，以脂質(zhì)沉積、內(nèi)膜增厚為特征，形成粥樣病灶或纖維脂質(zhì)斑塊。在眾多的致病因素中，脂質(zhì)代謝紊亂，尤其是高膽固醇血癥與其關(guān)系最為密切。載脂蛋白(apolipoprotein，apo)e是血漿脂蛋白的重要成分，在調(diào)節(jié)血漿膽固醇水平、脂質(zhì)的運(yùn)輸和代謝中起重要的作用，是高脂血癥、as等發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要的分子靶標(biāo)，尤其在as的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵性的作用。

近年來(lái)as有逐漸年輕化和上升趨勢(shì)。因此，需要建立動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型，從而對(duì)其病因和治療藥物進(jìn)行深入研究。雖然小鼠和大鼠是最常用的動(dòng)物模型，但是鼠具有as抗性，而且形成的病理改變雖然與人早期病變相似，不易形成類似人體的后期病變，而且小鼠取血不便。

犬是目前基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究和教學(xué)中最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，尤其在生理、藥理和病理生理學(xué)等實(shí)驗(yàn)研究中起著重要作用。犬在遺傳性疾病方面與人類也比較相似。且犬的遺傳性疾病少，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，血液循環(huán)和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)達(dá)，消化系統(tǒng)及內(nèi)臟與人相似，在毒理方面的反應(yīng)與人類比較接近，尤其適合藥理、循環(huán)生理、眼科、毒理、外科學(xué)等的研究，另外犬性格溫順容易調(diào)教，經(jīng)短期訓(xùn)練能很好地配合實(shí)驗(yàn)，被國(guó)際醫(yī)學(xué)、生物學(xué)界公認(rèn)為較理想的實(shí)驗(yàn)用犬。

目前常用的制備犬疾病模型的方法主要包括：飼喂法、機(jī)械損傷法及免疫學(xué)方法等。由于飼喂法、機(jī)械損傷法和免疫學(xué)法均為在健康動(dòng)物基礎(chǔ)上，采用特殊的方法誘導(dǎo)其出現(xiàn)疾病表型。但是，這些誘導(dǎo)型的犬動(dòng)物模型存在無(wú)法出現(xiàn)疾病表型、表型持續(xù)時(shí)間較短或無(wú)法模擬人類疾病癥狀等問(wèn)題。

利用基因工程方法對(duì)非人動(dòng)物進(jìn)行基因敲除或轉(zhuǎn)基因修飾建立疾病動(dòng)物模型可以克服上述誘導(dǎo)型動(dòng)物模型的缺點(diǎn)，但是這些基因敲除或者轉(zhuǎn)基因修飾技術(shù)應(yīng)用最成熟的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是鼠，對(duì)于大型哺乳動(dòng)物的基因敲除或者轉(zhuǎn)基因修飾模型還處于探索階段。即使牛、羊、豬、猴等大型哺乳動(dòng)物陸續(xù)有報(bào)道基因敲除動(dòng)物模型的建立，由于犬繁殖生理與其他哺乳動(dòng)物有很大區(qū)別，造成對(duì)犬卵母細(xì)胞及胚胎進(jìn)行體外操作難度極大，基因敲除或者轉(zhuǎn)基因修飾模型犬的建立難度大為增加。因此，即便對(duì)于基因敲除或者轉(zhuǎn)基因修飾疾病模型犬有著大量的需求，世界上鮮有成功建立基因敲除或者轉(zhuǎn)基因修飾疾病模型犬的報(bào)道。動(dòng)脈粥樣硬化病基因敲除或者轉(zhuǎn)基因修飾模型犬更沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

因此，非常需要建立動(dòng)脈粥樣硬化病基因敲除或者轉(zhuǎn)基因修飾模型犬，這樣的基因敲除或者轉(zhuǎn)基因修飾模型犬的疾病癥狀為原發(fā)癥狀，疾病表型持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，且具有可遺傳性，通過(guò)自然繁殖即可獲得子代疾病模型犬。從而，為心血管疾病的研究和相關(guān)的藥物研發(fā)提供合適的基因敲除或者轉(zhuǎn)基因修飾實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明利用基因敲除修飾技術(shù)獲得apoe基因敲除修飾犬受精卵，然后將犬受精卵移植到雙側(cè)輸卵管均進(jìn)行了沖胚的母犬的一側(cè)輸卵管內(nèi)，制備了apoe基因敲除犬。

第一方面，本發(fā)明提供了用于建立apoe基因敲除犬模型的方法，所述方法包括如下步驟：(1)利用基因編輯技術(shù)獲得apoe基因敲除修飾犬受精卵；以及(2)將犬受精卵移植到雙側(cè)輸卵管均進(jìn)行了沖胚的母犬的一側(cè)輸卵管內(nèi)制備了apoe基因敲除犬。

所述步驟(1)中的基因編輯技術(shù)包括：crispr，talen和zfn。

第二方面，本發(fā)明提供了用于建立apoe基因敲除犬模型的方法，所述方法包括如下步驟：(1)根據(jù)犬a(chǎn)poe基因序列，針對(duì)外顯子的序列確定打靶位點(diǎn)序列；(2)根據(jù)步驟(1)確定的打靶位點(diǎn)序列合成sgrna序列及其互補(bǔ)序列，然后將合成的序列與骨架載體連接構(gòu)建sgrna打靶載體；(3)將sgrna打靶載體體外轉(zhuǎn)錄獲得sgrna的mrna，將crispr/cas9體外轉(zhuǎn)錄為mrna；(4)將步驟(3)獲得的sgrna的mrna和crispr/cas9的mrna混合后胞質(zhì)內(nèi)注射到犬受精卵中；以及(5)將犬受精卵移植到雙側(cè)輸卵管均進(jìn)行了沖胚的母犬的一側(cè)輸卵管內(nèi)，從而制備apoe基因敲除犬。

優(yōu)選地，針對(duì)外顯子2(exon2：seqidno：1)、外顯子3(exon3：seqidno：2)或者外顯子4(exon4：seqidno：3)的序列確定打靶位點(diǎn)序列。更優(yōu)選地，針對(duì)外顯子3(exon3：seqidno：2)的序列確定打靶位點(diǎn)序列。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中所述的打靶位點(diǎn)序列為：

5'-ccgggtggcagactggccagccc-3'(seqidno：4)

優(yōu)選地，所述步驟(2)中合成的sgrna序列及其互補(bǔ)序列為：

sgrna序列：atagggctggccagtctgccaccgt(seqidno：5)

sgrna互補(bǔ)序列：taaaacggtggcagactggccagcc(seqidno：6)。

優(yōu)選地，所述骨架載體為購(gòu)自addgene的t7-grna。

優(yōu)選地，所述步驟(5)中將犬受精卵移植到雙側(cè)輸卵管均進(jìn)行了沖胚的母犬出血較少的一側(cè)輸卵管內(nèi)。

第三方面，在第二方面的步驟(4)中將步驟(3)獲得的sgrna的mrna和crispr/cas9的mrna混合后胞質(zhì)內(nèi)注射到犬體細(xì)胞中，然后將犬體細(xì)胞核移植到犬去核卵母細(xì)胞中；以及在步驟(5)中將犬去核卵母細(xì)胞移植到雙側(cè)輸卵管均進(jìn)行了沖胚的母犬的一側(cè)輸卵管內(nèi)，從而制備apoe基因敲除犬。

第四方面，本發(fā)明提供了犬a(chǎn)poe基因打靶載體，所述犬a(chǎn)poe基因打靶載體由針對(duì)犬a(chǎn)poe基因的外顯子中的打靶位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)的sgrna序列及其互補(bǔ)序列以及骨架載體構(gòu)成。

優(yōu)選地，所述外顯子為犬a(chǎn)poe基因的外顯子2(exon2：seqidno：1)、外顯子3(exon3：seqidno：2)或者外顯子4(exon4：seqidno：3)。優(yōu)選地，所述骨架載體為購(gòu)自addgene的t7-grna。

優(yōu)選地，所述打靶位點(diǎn)序列為：

5'-ccgggtggcagactggccagccc-3'(seqidno：4)

優(yōu)選地，所述sgrna序列及其互補(bǔ)序列為：

sgrna序列：atagggctggccagtctgccaccgt(seqidno：5)

sgrna互補(bǔ)序列：taaaacggtggcagactggccagcc(seqidno：6)。

第五方面，本發(fā)明提供了由第一方面至第三方面任一項(xiàng)的方法獲得的apoe基因敲除犬的體細(xì)胞、組織和器官。

優(yōu)選地，所述體細(xì)胞包含cctggaccagggaggct(seqidno：7)所示的序列。

優(yōu)選地，所述體細(xì)胞為apoe基因敲除比格犬耳成纖維細(xì)胞bgd-apoeko-ef0，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)，保藏號(hào)為cgmccno.13804，保藏日期為2017年3月1日。

第六方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)包含cctggaccagggaggct(seqidno：7)所示的序列片段的基因組序列的apoe基因敲除犬的引物對(duì)，所述引物對(duì)針對(duì)cctggaccagggaggct(seqidno：7)所示的序列進(jìn)行設(shè)計(jì)。

優(yōu)選地，所述引物對(duì)的序列如下：

正向引物f:5'-cattgttgtcaggcaggtagc-3'(seqidno：8)；

反向引物r:5'-gaagggtgcgagggattga-3'(seqidno：9)。

第七方面，本發(fā)明提供了用于檢測(cè)包含cctggaccagggaggct(seqidno：7)所示的序列片段的基因組序列的apoe基因敲除犬的試劑盒，所述試劑盒包含針對(duì)cctggaccagggaggct(seqidno：7)所示序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)。

優(yōu)選地，所述引物對(duì)的序列如下：

正向引物f:5'-cattgttgtcaggcaggtagc-3'(seqidno：8)；

反向引物r:5'-gaagggtgcgagggattga-3'(seqidno：9)。

第八方面，本發(fā)明提供了由第一方面至第三方面任一項(xiàng)的方法獲得的apoe基因敲除犬。

犬a(chǎn)poe基因共包含4個(gè)外顯子，其翻譯起始位點(diǎn)位于第二外顯子。本發(fā)明在其第三外顯子處進(jìn)行基因打靶，導(dǎo)致其基因組序列發(fā)生移碼突變，在第63個(gè)氨基酸翻譯終止，apoe蛋白無(wú)法完整表達(dá)，達(dá)到了基因敲除的目的。除這個(gè)位點(diǎn)外，在犬a(chǎn)poe基因的exon2、exon3及exon4的三個(gè)外顯子的任意序列處進(jìn)行基因打靶，造成基因序列發(fā)生改變，使其氨基酸翻譯提前終止，apoe蛋白無(wú)法完整表達(dá)，表達(dá)不完整的apoe蛋白無(wú)法執(zhí)行原有功能，也可達(dá)到敲除犬a(chǎn)poe基因的目的。

本發(fā)明利用基因編輯技術(shù)，根據(jù)犬a(chǎn)poe基因序列的外顯子選擇打靶位點(diǎn)序列，并且根據(jù)打靶位點(diǎn)序列構(gòu)建了sgrna打靶載體和crispr/cas9表達(dá)載體，然后將體外轉(zhuǎn)錄獲得的sgrna的mrna和crispr/cas9的mrna胞質(zhì)注射到犬受精卵中，然后犬受精卵移植到雙側(cè)輸卵管均進(jìn)行了沖胚的母犬的一側(cè)輸卵管內(nèi)，從而制備apoe基因敲除犬。這是世界上首次成功獲得了apoe基因敲除犬。而且，在將受精卵移植到輸卵管之前對(duì)雙側(cè)輸卵管均進(jìn)行了沖胚，增加了轉(zhuǎn)基因受精卵的數(shù)量，相比于只對(duì)一側(cè)輸卵管進(jìn)行沖胚相比，避免了不沖卵一側(cè)輸卵管中的胚對(duì)基因敲除胚的著床的影響，因此大幅度提高了受精卵的利用效率和轉(zhuǎn)基因犬的成活率。

此外，本發(fā)明獲得的apoe基因敲除犬，將為醫(yī)學(xué)研究提供具有巨大應(yīng)用價(jià)值的疾病動(dòng)物模型，為推動(dòng)心血管疾病的研究和心血管疾病藥物的篩選奠定基礎(chǔ)。

縮略語(yǔ)和關(guān)鍵術(shù)語(yǔ)定義：

apoe：載脂蛋白e，是載脂蛋白的一種，主要在肝臟以及腦組織中合成，是神經(jīng)系統(tǒng)以及血漿脂蛋白的構(gòu)成成分。其通過(guò)與低密度脂蛋白受體結(jié)合攝取低密度脂蛋白，參與了血液中膽固醇和甘油三脂的代謝過(guò)程。人apoe基因位于第19對(duì)染色體長(zhǎng)臂上，長(zhǎng)37kb，該基因包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。其cdna長(zhǎng)為1.63kb，基因的最初產(chǎn)物為含317個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，被一個(gè)含18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽裂解后，變成由299個(gè)氨基酸組成的成熟蛋白。犬a(chǎn)poe位于犬1號(hào)染色體，基因全長(zhǎng)2788bp，共有4個(gè)外顯子，6個(gè)編碼蛋白的cds區(qū)，編碼323個(gè)氨基酸。

ici：胞質(zhì)內(nèi)注射，是指通過(guò)顯微操作，利用顯微注射針將基因注射入受精卵胞質(zhì)內(nèi)。

as：動(dòng)脈粥樣硬化，脂質(zhì)代謝障礙為動(dòng)脈粥樣硬化的病變基礎(chǔ)，其特點(diǎn)是受累動(dòng)脈病變從內(nèi)膜開(kāi)始，一般先有脂質(zhì)和復(fù)合糖類積聚、出血及血栓形成，進(jìn)而纖維組織增生及鈣質(zhì)沉著，并有動(dòng)脈中層的逐漸蛻變和鈣化，導(dǎo)致動(dòng)脈壁增厚變硬、血管腔狹窄。病變常累及大中肌性動(dòng)脈，一旦發(fā)展到足以阻塞動(dòng)脈腔，則該動(dòng)脈所供應(yīng)的組織或器官將缺血或壞死。由于在動(dòng)脈內(nèi)膜積聚的脂質(zhì)外觀呈黃色粥樣，因此稱為動(dòng)脈粥樣硬化。

附圖說(shuō)明

圖1：是犬a(chǎn)poe基因打靶位點(diǎn)序列的示意圖。

圖2：顯示了野生型犬a(chǎn)poe基因exon3序列與編號(hào)161207的apoe基因敲除犬a(chǎn)poe基因exon3突變序列。

圖3：圖示了apoe基因突變類型的序列比較。

圖4：圖示了apoe基因編輯犬的測(cè)序峰圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及說(shuō)明書(shū)附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步描述。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：轉(zhuǎn)基因打靶載體的構(gòu)建、體外轉(zhuǎn)錄及驗(yàn)證

根據(jù)ncbi提供的犬a(chǎn)poe基因序列信息，基于犬a(chǎn)poe基因exon3選擇打靶位點(diǎn)序列5'-ccgggtggcagactggccagccc-3'(seqidno：4)(參見(jiàn)圖1)，識(shí)別該位點(diǎn)的sgrna序列為5'-gggctggccagtctgccacc-3'(seqidno：10)。構(gòu)建載體時(shí)，將骨架載體t7-grna(購(gòu)自addgene)用bbsi進(jìn)行酶切，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；設(shè)計(jì)sgrna序列：atagggctggccagtctgccaccgt(seqidno：5)和sgrna互補(bǔ)序列：taaaacggtggcagactggccagcc(seqidno：6)；將sgrna序列和sgrna互補(bǔ)序列進(jìn)行退火連接，之后再與酶切好的t7-grna質(zhì)粒連接。經(jīng)pcr擴(kuò)增t7-sgrna質(zhì)粒并回收pcr產(chǎn)物，利用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)t7-sgrna的pcr產(chǎn)物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。

首先對(duì)crispr/cas9的質(zhì)粒進(jìn)行線性化，反應(yīng)體系為：30μg質(zhì)粒，5μl限制性內(nèi)切酶aflii；10μl的10×buffer及ddh2o，總體積為100μl。然后加入100μl酚：仿：異戊醇(25:24:1)純化線性化質(zhì)粒dna，12000g離心5min；吸取50μl上清至無(wú)rnase的1.5ml離心管內(nèi)，加入1/10體積醋酸鈉和3倍體積無(wú)水乙醇沉淀質(zhì)粒dna，12000g離心5min；棄上清，盡量吸棄殘留的上清，加150μl70％乙醇洗滌質(zhì)粒，12000g離心5min；空氣中干燥3-5min，用15μl無(wú)rnase的ddh2o溶解dna，測(cè)定濃度。

體外轉(zhuǎn)錄mrna試劑盒法(ambion)：

體外轉(zhuǎn)錄體系為：1μg線性化質(zhì)粒dna，10μl的2×ntp/cap，2μl的10×buffer，2μl的rna合成酶及ddh2o，總體積為20μl?；靹蚝?7℃孵育1hr；加入1μlturbodna酶，消化質(zhì)粒模板，37℃孵育30min。然后將20μl體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，20μl的10×reactionbuffer，10μl的atp(10mm)，2.5μl的rna酶抑制劑，2μl的poly(a)聚合酶及無(wú)核酸酶ddh2o混合，配制總體積為100μl的體外轉(zhuǎn)錄mrna加polya體系，37℃孵育1hr。孵育后，向反應(yīng)體系中加入350μl結(jié)合緩沖液，吹吸混勻；然后加入250μl無(wú)水乙醇，混合均勻；再將樣品轉(zhuǎn)移到mrna純化柱中，10000g室溫離心1min；棄掉濾液，重新裝好柱子，500μl洗脫液漂洗柱子，10000g室溫離心1min；重復(fù)漂洗一次，棄掉濾液，空柱離心1min將蛋白質(zhì)等雜質(zhì)洗脫掉；然后將柱子放入一個(gè)新的離心管中，加入50μlrna洗脫液到柱子中央位置，蓋好蓋子65℃孵育10min，10000g室溫離心1min；檢測(cè)rna質(zhì)量及濃度。

將crispr的sgrna及cas9的mrna進(jìn)行混合，使sgrna的終濃度為20ng/μl、cas9的終濃度為200ng/μl，置于-80℃保存，用于胞質(zhì)注射。

將構(gòu)建完成的sgrna與cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)至犬皮膚成纖維細(xì)胞，然后采用g418進(jìn)行篩選。將篩選獲得的細(xì)胞克隆提取dna作為模板，并采用如下的引物對(duì)進(jìn)行pcr，擴(kuò)增sgrna識(shí)別切割靶點(diǎn)上下游共計(jì)660bp的dna片段：

正向引物f:5'-cattgttgtcaggcaggtagc-3'(seqidno：8)；

反向引物r:5'-gaagggtgcgagggattga-3'(seqidno：9)。

將pcr擴(kuò)增得到的目的片段進(jìn)行dna測(cè)序，判斷載體的打靶效率。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染及篩選，共獲得細(xì)胞克隆30個(gè)，pcr測(cè)序結(jié)果顯示，其中26個(gè)細(xì)胞克隆在打靶位點(diǎn)區(qū)域發(fā)生了基因突變，突變效率為86.7％，證明載體構(gòu)建準(zhǔn)確打靶效率較高，可用于apoe基因敲除犬的制備。

實(shí)施例2：apoe基因敲除犬胚胎移植

共計(jì)13只自然發(fā)情的比格母犬，作為受精卵供體同時(shí)作為胚胎移植受體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)所有母犬采集血液檢測(cè)血清中孕酮濃度，當(dāng)孕酮濃度達(dá)到4-7ng/ml時(shí)可以確定為排卵期，排卵后48h進(jìn)行自然交配，然后沖取受精胚胎，13只母犬累計(jì)獲得受精卵65枚。收集受精卵后，采用含有0.1％透明質(zhì)酸酶的tcm199培養(yǎng)基脫去卵丘顆粒細(xì)胞，然后放入hepes緩沖的tcm199培養(yǎng)基(hm，gibco11150)微滴中，再放到裝有顯微操作儀的倒置顯微鏡上。利用顯微注射針吸取含有以體積計(jì)1:1的實(shí)施例1制備的sgrna的mrna和cas9的mrna的混合液，然后注射到受精卵的胞質(zhì)中。用10ml含有10％胎牛血清的hepes緩沖的tcm199培養(yǎng)基(hm，gibco11150)沖洗輸卵管，沖卵液由輸卵管傘部結(jié)扎的注射針處流出并收集到10ml離心管中。

胞質(zhì)注射完成后，將胚胎裝入胚胎移植管中，將胚胎移植管中的胚胎從傘部注射到?jīng)_胚時(shí)出血較少一側(cè)的輸卵管內(nèi)。

表1：胚胎移植結(jié)果

從上表1可以看出，13只比格母犬，移植受精卵65枚，共產(chǎn)仔13只，獲得的基因敲除犬為2只，檢測(cè)和驗(yàn)證試驗(yàn)參見(jiàn)以下的實(shí)施例。

實(shí)施例3：apoe基因敲除犬基因突變檢測(cè)

幼犬出生后，采集耳組織及尾組織用于鑒定。組織塊在離心管內(nèi)剪碎后，再加入蛋白酶k水浴56℃裂解1～3h。然后用移液槍吸取genomiclysisbuffer700μl，加入裂解體系，上下顛倒混合均勻，10000g，離心1min。用移液器吸取上清液至純化柱，10000g，室溫靜置1min，離心1min。換取新的收集管，向離心柱內(nèi)加入200μl的dnapre-washbuffer，10000g，室溫靜置1min，離心1min，棄廢液。向離心柱中加入400μl的g-dnawashbuffer，10000g，室溫靜置1min，離心1min，棄廢液。將純化柱和收集管重新離心，10000g，離心2min。將純化柱更換至新的1.5ml離心管內(nèi)，加入50μl的elutionbuffer洗脫dna，室溫放置2min。12000rpm，離心1min，得到的溶液為犬基因組dna。

以犬基因組dna作為模板進(jìn)行pcr，引物為：

正向引物f:5'-cattgttgtcaggcaggtagc-3'(seqidno：8)；

反向引物r:5'-gaagggtgcgagggattga-3'(seqidno：9)，

擴(kuò)增sgrna識(shí)別切割靶點(diǎn)上下游共計(jì)660bp的dna片段。將pcr擴(kuò)增得到的目的片段進(jìn)行dna測(cè)序，與ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)提供的犬a(chǎn)poe基因序列進(jìn)行比對(duì)，判斷apoe基因的突變類型。

經(jīng)過(guò)測(cè)序及序列信息比對(duì)，13只幼犬中有1公1母2只犬在apoe基因exon3靶位點(diǎn)除發(fā)生突變，其中1只公犬(編號(hào)161207)的突變類型為刪除34bp同時(shí)插入17bp，為apoe基因純合雙敲除，導(dǎo)致apoe蛋白自第37個(gè)氨基酸開(kāi)始突變，至第63個(gè)氨基酸翻譯終止；另外1只母犬(編號(hào)170111)為一側(cè)刪除33bp，另一側(cè)刪除51bp的雜合突變。圖2顯示了野生型犬a(chǎn)poe基因exon3序列(seqidno：2)與編號(hào)161207的apoe基因敲除犬a(chǎn)poe基因exon3突變序列(seqidno：11)，可以看出刪除34bp同時(shí)插入17bp，apoe基因敲除犬a(chǎn)poe基因exon3突變序列加粗部分表示增加的17bp。具體而言，相應(yīng)位點(diǎn)突變前的序列為tggagccagaggccgggtggcagactggccagcc(seqidno:12)，突變后的序列為cctggaccagggaggct(seqidno：7)。

圖3顯示了野生型犬a(chǎn)poe基因exon3第641位核苷酸至第720位核苷酸序列與相應(yīng)的編號(hào)161207的apoe基因敲除犬耳組織和尾部組織apoe基因exon3的對(duì)應(yīng)序列，以及編號(hào)170111的apoe基因敲除犬耳組織和尾部組織apoe基因exon3的對(duì)應(yīng)序列的對(duì)比(框內(nèi)為靶向序列；數(shù)字編號(hào)后綴字母e為耳組織，w為尾部組織；數(shù)字a和b表示編號(hào)為170111敲除狗發(fā)生apoe雜合敲除等位基因編號(hào))。

編號(hào)161207的apoe基因敲除比格公犬的耳成纖維細(xì)胞bgd-apoeko-ef0，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(cgmcc)，保藏號(hào)為cgmccno.13804，保藏日期為2017年3月1日。

圖4顯示了apoe基因編輯犬的測(cè)序峰圖。圖中數(shù)字為犬編號(hào)，字母e為耳組織，字母w為尾組織；161206e/w分別為野生型犬耳組織及尾組織，圖中框標(biāo)注的是野生型基因靶位點(diǎn)區(qū)域(參見(jiàn)圖4a和4b)；161207e/w分別為apoe基因突變公犬耳組織及尾組織，圖中框標(biāo)注的是突變序列信息(參見(jiàn)圖4c和4d)；170111e/w分別為apoe基因突變母犬耳組織及尾組織，a、b為雜合突變等位基因編號(hào)，箭頭指示部分為突變區(qū)域(參見(jiàn)圖4e-4h)。

實(shí)施例4：apoe基因敲除犬的血脂檢測(cè)

apoe基因敲除犬(161207)3月齡時(shí)，采集血液離心分離血清，對(duì)其血液中總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，與陰性犬(161205和161206)相比apoe基因敲除犬的血清中總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白的含量均明顯高于對(duì)照組(參見(jiàn)下表2)。可以看出，敲除apoe基因造成基因敲除犬脂類代謝出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致血脂含量的顯著升高，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了本發(fā)明獲得了apoe基因敲除犬。

表2：apoe基因敲除犬血脂檢測(cè)結(jié)果

sequencelisting

<110>北京希諾谷生物科技有限公司

<120>一種制備動(dòng)脈粥樣硬化疾病模型犬的方法

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