本發(fā)明涉及微生物菌種保藏方法，特別是紅曲霉菌種的長期保藏方法。

背景技術(shù)：

據(jù)估計全世界存在150萬種真菌，但還不到5％的真菌被分離純化，適合分離純種保藏的方法更少，不同的菌，有不同的生理特性，需不同的保藏方法，沒有一種保藏工藝能夠適合所有菌類的保藏。不當(dāng)?shù)谋２胤椒ǔ３?dǎo)致生產(chǎn)菌種優(yōu)良性能退化甚至菌種死亡，帶來巨大損失。紅曲霉為子囊菌綱曲霉科紅曲霉屬的真菌，其代謝產(chǎn)物用途廣泛，不僅用于食品、染色、調(diào)味、制醋，還有藥用價值。大多數(shù)成員都能兼性嗜高滲透壓，能在較低水活度下生長。能利用淀粉、糊精等多種有機(jī)碳源[李鐘慶等.綜觀紅曲與紅曲菌，中國輕工業(yè)出版

社,2009,6:40]。目前此類產(chǎn)孢真菌的常用保藏方法有繼代培養(yǎng)保存法[李世貴,顧金剛.斜

面法與橡皮塞法保藏絲狀真菌的效果.微生物學(xué)通報,2002,29(4):118-120]、自然基質(zhì)法[范

立寶.食用菌菌種的簡易保藏法.貯藏加工,2004,175(9):31]、冷凍干燥法[heseltine,c.w.,

bradley,b.j,et.al.furtherinvestigationsonthepreservationofmolds.mycology,1960,52(5):762-774]，這些保藏方法的優(yōu)缺點(diǎn)見表一。

基質(zhì)法和繼代培養(yǎng)法保藏菌種時，通常要選用營養(yǎng)較為瘠薄的培養(yǎng)基。保藏培養(yǎng)基碳氮比較發(fā)酵培養(yǎng)基低，培養(yǎng)溫度也比發(fā)酵生長時低些。因?yàn)楸２鼐N時如果培養(yǎng)基營養(yǎng)成分豐富，碳氮比高，生長溫度高，菌種的生長速度就會過快，次級代謝物分泌過多，菌體易衰老。

傳統(tǒng)基質(zhì)保藏法保藏的是最初長成的孢子?；驹硎菍⒈２鼗|(zhì)的水分蒸發(fā)掉，使菌種處于生長停滯狀態(tài)，從而達(dá)到長期保存菌種的目的。通常的操作方法是在培養(yǎng)時讓自然基質(zhì)上長出盡可能多的孢子，再經(jīng)干燥，使保藏物水分降到8%以下后，再放到冰箱冷藏，進(jìn)入干燥低溫保藏階段。此時的基質(zhì)僅僅是孢子的載體，因此保藏階段的基質(zhì)不允許受潮，一旦受潮，孢子就會萌發(fā)生長，由于初期基質(zhì)營養(yǎng)早已耗盡，萌發(fā)后長出的菌絲沒有營養(yǎng)的供給加速了菌株的死亡。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提出一種間歇生長法長期保藏紅曲霉菌種的方法，是利用紅曲霉能在較低溫度和水活度下生長的特性對普通基質(zhì)保藏法的改良。

一種間歇生長法長期保藏紅曲霉菌種的方法，步驟如下：

1）基質(zhì)培養(yǎng)基的制備：選用米?；蛘咝←溋＃?0～60min，瀝干流動水后分裝入試管，塞上棉塞，濕熱滅菌；

2）接種培養(yǎng)：接入新鮮紅曲霉孢子液，攪拌均勻，30℃培養(yǎng)4～7天，至肉眼能觀察到基質(zhì)有紅曲霉菌落生長；

3）冷藏干燥：將培養(yǎng)好的菌種置于冰箱內(nèi)冷藏，水分升華得到干燥的基質(zhì)培養(yǎng)基；

4）萌發(fā)：每3年一次，選擇或者設(shè)置萌發(fā)環(huán)境，濕度為95%rh，溫度為30℃，從冰箱取出菌種，在萌發(fā)環(huán)境放置5～8小時后，再移回冰箱4～8℃冷藏。

優(yōu)選的基質(zhì)培養(yǎng)基為黑米。

所述的萌發(fā)環(huán)境為梅雨天。

所述的水的溫度20～40℃。

本發(fā)明的有益效果：

1、間歇生長保藏法主要特點(diǎn)是保藏期內(nèi)間歇更新衰老的孢子，得到年輕有活力的孢子；

2、間歇生長保藏法無需特殊設(shè)備和技術(shù)，操作方法比普通的基質(zhì)法還簡單，保藏的菌種不易變異，不怕受潮；

3、間歇生長保藏法保藏時間長，既減輕人工勞力，也避免了傳代時感染外界雜菌的可能。完全可取代工廠菌種室最常使用的基質(zhì)保藏法。

附圖說明

圖1是本發(fā)明方法保藏16年的菌種與真空冷凍干燥保藏的菌種效果對比。

具體實(shí)施方式

間歇基質(zhì)保藏方法保藏的是在不斷更新的有活力的孢子。保藏方法首先是讓菌株長在糊化不充分，水分低的米粒上，菌絲初期只能在米粒表面生長，形成休眠體后，低溫干燥，低溫保藏。在適當(dāng)?shù)臅r候，創(chuàng)造條件使孢子萌發(fā)出菌絲，菌絲吸取基質(zhì)更深一層營養(yǎng)，再一次形成孢子，低溫干燥，進(jìn)入第二輪休眠期。如此反復(fù)，孢子在不斷更新。由于沒有旺盛生長，次級代謝產(chǎn)物也少，有利保持菌種的性狀。

實(shí)施例1

1．黑米培養(yǎng)基的制備：30℃自來水浸泡60分鐘，瀝干流動水后分裝入18×180mm試管中，裝量為10克/支，塞上棉塞，濕熱滅菌。基質(zhì)培養(yǎng)基優(yōu)選黑米，是因?yàn)楹诿妆榷i米蛋白質(zhì)含量高，而碳水化合物相對較低，且黑米結(jié)構(gòu)致密，吸水率低,糊化較秈米難，菌絲入侵較慢。更適合作為長期保藏用材料。

2．接種培養(yǎng)：接種新鮮紅曲孢子液，攪拌均勻，滅菌牛皮紙單支試管頭部包扎后置消毒鋁盒內(nèi)，培養(yǎng)5～7天，至基質(zhì)表面的紅曲菌絲生長且1/5以上轉(zhuǎn)粉紅色，內(nèi)部仍黑色。

3．冰箱間歇生長、冷藏：滅菌鋁盒連同培養(yǎng)好的試管菌種一并置冰箱（普通家用冰箱即可，無需保濕）4℃～8℃冷藏。每3年一次，選擇高溫潮濕的天氣（濕度在95%rh以上，氣溫在30℃左右），從冰箱取出裝有保藏物的鋁盒，放置5小時左右，由于溫差，保藏試管內(nèi)空氣中的水蒸氣凝結(jié)成冷凝水，濕度上升，米粒表層也會結(jié)露，適宜的溫度和濕度觸使孢子萌發(fā)出菌絲，菌絲吸取基質(zhì)更深一層營養(yǎng)，繼續(xù)生長，再一次形成休眠孢子。

4.16年后，本發(fā)明保藏的菌種與真空冷凍干燥保藏的菌種效果對比。

保藏菌種復(fù)蘇時液體培養(yǎng)生物量增長測定：將麥芽汁培養(yǎng)基(7°bé)裝入100ml廣口三角瓶，滅菌，稱0.10g培養(yǎng)物接種，在30℃、120r／min震蕩培養(yǎng)，每一段時間取一只培養(yǎng)瓶。過濾取菌體，并用蒸餾水沖洗一次，置烘箱中100℃烘至恒重，并記錄結(jié)果。具體數(shù)據(jù)見圖1。

從圖1中可看出16年后，用真空冷凍干燥保藏法保藏的兩株菌種里zm2.33株已死亡，zm2.31與基質(zhì)間歇生長保藏法保藏的菌種比不僅對數(shù)生長期滯后明顯而且生物增長量偏低。

5.取出保藏物米粒，用雙面刀片橫切開，里層粉紅色，米粒質(zhì)地松但未變形，還有可利用基質(zhì)未利用，保藏時間還有延長空間。

用間歇生長保藏法保藏的菌種，保藏方法簡單、無需添加設(shè)備，保藏期長，活性高，而且復(fù)活時間比真空冷凍干燥法縮短48小時以上。最適合生產(chǎn)企業(yè)菌種室的保種工作。

實(shí)施例2

1．秈米培養(yǎng)基的制備：30℃自來水浸泡10分鐘，瀝干流動水后分裝入18×180mm試管中，裝量為10克/支，塞上棉塞，濕熱滅菌。

2．接種培養(yǎng)：剔除滅菌后米粒結(jié)團(tuán)嚴(yán)重的試管；挑取輕拍管壁米粒即能散開的試管接種。接入新鮮紅曲孢子液，攪拌均勻，滅菌牛皮紙單支試管頭部包扎后置消毒鋁盒內(nèi)，培養(yǎng)4～6天，觀察到米粒表面有菌絲生長且80%以上轉(zhuǎn)紅，內(nèi)部部分淺粉色。

3.冰箱間歇生長、冷藏：滅菌鋁盒連同培養(yǎng)好的試管菌種一并置冰箱4℃～8℃冷藏。每3年一次，選擇高溫潮濕的天氣（濕度在95%rh以上，氣溫在30℃左右），從冰箱取出裝有保藏物的鋁盒，在放置5小時左右，移回冰箱4℃～8℃保藏。

4.16年后,本發(fā)明保藏的菌種與真空冷凍干燥保藏的菌種效果對比見圖1。

16年后，保藏物與真空冷凍干燥保藏法進(jìn)行平板和液體生長比較，圖1中真空冷凍干燥保藏法保藏的菌種與秈米間歇生長保藏法保藏的菌種比對數(shù)生長期滯后明顯，存活率低。秈米與黑米保藏的菌種指標(biāo)相似。但肉眼可見大多數(shù)秈米保藏物以萎縮，變形，中空，基質(zhì)幾乎耗盡。