本發(fā)明涉及腫瘤靶向治療領(lǐng)域，更特別地，涉及一種可殺傷腫瘤細(xì)胞的多肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率逐年上升，已成為發(fā)達(dá)國(guó)家和部分發(fā)展中國(guó)家人口死亡的主要原因，是全球最大的公共問(wèn)題之一，嚴(yán)重威脅著人類健康和生命安全。因此，癌癥的治療受到國(guó)際社會(huì)的普遍關(guān)注和高度重視，而尋找安全有效、不良反應(yīng)小的抗腫瘤藥物一直是生物醫(yī)學(xué)研究的焦點(diǎn)。傳統(tǒng)臨床藥物治療是通過(guò)直接殺傷腫瘤細(xì)胞進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)，但通常對(duì)正常細(xì)胞具有毒性，產(chǎn)生骨髓抑制、免疫功能低下等副作用，而且隨著藥物使用時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞易產(chǎn)生抗藥性。因此，從不同途徑尋找效果好、毒性低、特異性強(qiáng)的抗腫瘤藥物是目前腫瘤治療的主要目標(biāo)。

生物活性肽(bioactivity peptides)，又稱功能肽(functional peptides)，是一類具有生理活性功能的肽，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)或者抗菌、抗病毒、降血壓、降血糖等重要作用。由于其分子量小、易于吸收，可廣泛應(yīng)用于保健品和藥物的開(kāi)發(fā)。

因此，需要構(gòu)建一種既能靶向腫瘤細(xì)胞，又能高效入胞的新型多肽。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決以上問(wèn)題，發(fā)明人制備了一種生物活性肽，并將該多肽與細(xì)胞穿膜肽通過(guò)共價(jià)鍵連接起來(lái)，達(dá)到既有靶向腫瘤細(xì)胞，又具有高效入胞的效果。

基于該研究，本發(fā)明提供了一種可殺傷腫瘤細(xì)胞的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本發(fā)明還提供了上述可殺傷腫瘤細(xì)胞的多肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種抗腫瘤多肽，其包括腫瘤細(xì)胞殺傷結(jié)構(gòu)域和穿膜結(jié)構(gòu)域，所述腫瘤細(xì)胞殺傷結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

優(yōu)選地，所述穿膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

優(yōu)選地，所述穿膜結(jié)構(gòu)域連接于所述腫瘤細(xì)胞殺傷結(jié)構(gòu)域的N端

本發(fā)明還提供了上述抗腫瘤多肽在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，本發(fā)明的抗腫瘤多肽的穿膜結(jié)構(gòu)域本身沒(méi)有細(xì)胞毒性，但連接腫瘤殺傷結(jié)構(gòu)域后，有明顯的抑制腫瘤增殖、遷移侵襲的效應(yīng)。本發(fā)明的抗腫瘤多肽，不僅可以單獨(dú)作為抗腫瘤的生物治療藥物，還有望結(jié)合其他治療方式來(lái)抑制腫瘤。

附圖說(shuō)明

圖1為用MUDP-21和對(duì)照多肽孵育腫瘤細(xì)胞后的熒光顯微鏡照片；

圖2為不同濃度的MUDP-21對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖活性影響的統(tǒng)計(jì)圖；

圖3為分別含有MUDP-21和對(duì)照多肽的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞兩周后的培養(yǎng)孔的結(jié)晶紫染色照片；

圖4為根據(jù)圖3計(jì)算的細(xì)胞克隆數(shù)的統(tǒng)計(jì)圖；

圖5為分別含有MUDP-21和對(duì)照多肽的軟瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞3-4周后的培養(yǎng)孔的四甲基偶氮唑藍(lán)染色照片；

圖6為根據(jù)圖5計(jì)算的細(xì)胞克隆數(shù)的統(tǒng)計(jì)圖

圖7為細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MUDP-21和對(duì)照多肽對(duì)細(xì)胞遷移能力影響；

圖8為Transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)晶紫染色照片；

圖9為根據(jù)圖8計(jì)數(shù)得到的IMR32細(xì)胞的Transwell實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞計(jì)數(shù)圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

1.抗腫瘤多肽的合成

通過(guò)固相合成法合成一種抗腫瘤多肽，其包括一個(gè)腫瘤細(xì)胞殺傷結(jié)構(gòu)域和一個(gè)穿膜結(jié)構(gòu)域，其中腫瘤細(xì)胞殺傷結(jié)構(gòu)域序列如SEQ ID NO:1所示，穿膜結(jié)構(gòu)域序列如SEQ ID NO:2所示，連接于腫瘤細(xì)胞殺傷結(jié)構(gòu)域的N端，所得到的序列為：氨基酸序列為YGRKKRRQRRR-METRWGTDGVLMTAVIGAGSC(SEQ ID NO:3)，命名為MUDP-21。為了研究方便，我們還在抗腫瘤多肽的C端標(biāo)記的異硫氰酸熒光素標(biāo)記FITC。

2.MUDP-21的細(xì)胞定位檢測(cè)

分別采用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞種植在24孔板內(nèi)的蓋玻片上，每孔約8000-12000個(gè)細(xì)胞。以10％胎牛血清，高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，并加入60μM的多肽，培養(yǎng)24小時(shí)。以與該多肽相同組成的氨基酸隨機(jī)重新排列后的錯(cuò)序肽作為對(duì)照肽。采用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)帶有熒光基團(tuán)的多肽在細(xì)胞內(nèi)的定位，拍照并保存。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，MUDP-21在加入細(xì)胞培養(yǎng)體系24小時(shí)之后，能有效穿透腫瘤細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，呈現(xiàn)強(qiáng)胞漿及胞核染色，說(shuō)明該多肽能夠有效進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的胞漿和胞核內(nèi)。

3.MTT比色法分析檢測(cè)MUDP-21對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，用0.25％的胰酶消化后，加入相應(yīng)的完全培養(yǎng)基終止消化并重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度至5×10⁴個(gè)/ml，然后加入96孔板中，每孔100μl。將培養(yǎng)板置于恒溫37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

培養(yǎng)24小時(shí)后，細(xì)胞完全貼壁，吸出廢舊培養(yǎng)液，加入終體積為200μl的含有不同濃度MUDP-21的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以亂序多肽為對(duì)照組，將培養(yǎng)板置于恒溫37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

48小時(shí)后吸出培養(yǎng)液，用PBS洗2次，加入5mg/ml的四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)溶液20μl和新鮮基礎(chǔ)培養(yǎng)基180μl；于恒溫37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；4小時(shí)后，棄去含有MTT的培養(yǎng)液，加入150μl DMSO后于微型振蕩器上振蕩15分鐘。

用在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm處測(cè)量各孔的吸光值OD₄₉₀，并計(jì)算抑制率：癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(％)＝[(對(duì)照組OD-空白組OD)-(給藥組OD-空白組OD)]/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，MUDP-21能顯著抑制SH-SY5Y細(xì)胞的生長(zhǎng)活性，且呈劑量依賴性，IC₅₀為60μM，而對(duì)照肽無(wú)抑制作用。

4.克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MUDP-21對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的抑制作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，用0.25％的胰酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度。將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，分別以每孔100、200、500個(gè)細(xì)胞的梯度密度接種于含2ml培養(yǎng)基的六孔板中，并輕輕搖動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。將MUDP-21按照60μM濃度加入培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)板置于恒溫37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周左右。

當(dāng)培養(yǎng)孔中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，用PBS洗3次。加入4％多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15分鐘，然后棄去多聚甲醛，用PBS洗3次，每次5分鐘。加入適量結(jié)晶紫，染色30分鐘后吸去染液，然后用清水洗去染色液，空氣干燥。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3和4所示，60μM的MUDP-21能顯著抑制SH-SY5Y細(xì)胞的增殖活性。

5.軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MUDP-21對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的抑制作用

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，用0.25％胰酶消化并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，作活細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔加入300個(gè)細(xì)胞。用蒸餾水分別制備出1.2％和0.7％兩個(gè)濃度的溶點(diǎn)瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持40℃溫度，以防凝固。

將MUDP-21按照60μM濃度加入培養(yǎng)基中。按1:1比例使1.2％的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基(含有2×抗生素和20％的小牛血清)混合后，取3ml混合液加入六孔板中，冷卻凝固，作底層瓊脂。將培養(yǎng)板置于恒溫37℃、5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱備用。

按1:1比例使0.7％的瓊脂糖和2×DMEM培養(yǎng)基混合后，再加入適量的細(xì)胞懸液，充分混勻，注入鋪有底層瓊脂的培養(yǎng)板中，逐漸形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置于恒溫37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4周。

向六孔板中加入5mg/ml MTT溶液，4℃染色4小時(shí)后，取出觀察照相。計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆形成數(shù)目(每個(gè)克隆至少50個(gè)細(xì)胞)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5和6所示，60μM的MUDP-21能顯著抑制SH-SY5Y細(xì)胞的增殖活性。

6.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MUDP-21對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞遷移的抑制作用

用記號(hào)筆在六孔板背面畫橫線以進(jìn)行標(biāo)記；細(xì)胞消化后，取適量細(xì)胞進(jìn)行接種，將培養(yǎng)板置于恒溫37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

待細(xì)胞長(zhǎng)滿板底后，用100μl槍頭比著直尺，垂直于培養(yǎng)板背后的橫線劃痕；吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗3次，洗去懸浮的細(xì)胞；加入無(wú)血清培養(yǎng)基，拍照記錄。將培養(yǎng)板置于恒溫37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，再次拍照記錄。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，60μM的MUDP-21能顯著抑制SH-SY5Y細(xì)胞的遷移活性。

7.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MUDP-21對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞遷移的抑制作用

在24孔培養(yǎng)板中加入含完全培養(yǎng)基，將Transwell小室放入孔中；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，用0.25％胰酶消化并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，作活細(xì)胞計(jì)數(shù)。每孔加入2.5×10⁵個(gè)細(xì)胞，并向上室加入60μM的多肽；將24孔板置于恒溫37℃、5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24小時(shí)。

取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用PBS洗2遍；甲醇固定20分鐘，將小室風(fēng)干；0.1％結(jié)晶紫染色30分鐘，用棉簽輕輕擦掉上層未穿過(guò)小孔的細(xì)胞；顯微鏡下隨機(jī)五個(gè)視野觀察細(xì)胞，記數(shù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8和9所示：60μM多肽能顯著抑制SH-SY5Y細(xì)胞的遷移活性。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院

<120> 一種抗腫瘤多肽MUDP-21及其應(yīng)用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Glu Thr Arg Trp Gly Thr Asp Gly Val Leu Met Thr Ala Val Ile

1 5 10 15

Gly Ala Gly Ser Cys

20

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Met Glu Thr Arg Trp

1 5 10 15

Gly Thr Asp Gly Val Leu Met Thr Ala Val Ile Gly Ala Gly Ser Cys

20 25 30