本發(fā)明涉及腫瘤靶向治療領域，更特別地，涉及一種靶向腫瘤細胞的多肽及其應用，還涉及一種促進腫瘤細胞增殖和/或遷移的多肽及其應用。
背景技術：
腫瘤是嚴重威脅人類生命的重大疾病，已成為人類死亡的主要原因。隨著醫(yī)療技術和基礎研究的進步，多種腫瘤的治療已經取得了明顯的改善，但常規(guī)腫瘤治療方法(包括手術、化療、放療及免疫療法)給機體正常組織帶來損傷，造成很大的副作用，給腫瘤患者帶來極大的痛苦。
腫瘤靶向治療是指通過干擾調控腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關鍵靶標，針對性地治療腫瘤。與傳統(tǒng)放化療方法比較，腫瘤靶向療法能減少對正常組織的損害，降低治療的副反應，減輕患者痛苦。蛋白質作為生物學功能的執(zhí)行者，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)具有生物學活性的短肽可能成為腫瘤靶向治療的有力工具之一。
生物活性多肽的研究始于內源性分泌肽和神經肽的發(fā)現(xiàn)。除分泌性短肽和神經肽之外，機體內是否還存在未知的其他短肽序列一直困擾著研究者。隨著rna深度測序及核糖體圖譜技術的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)數(shù)以萬計了的小開放閱讀框(sorf)，其中部分編碼產物已經被證實。
細胞穿膜肽(cellpenetratingpeptides,cpps)是一類具有很強穿透細胞膜能力的短肽，帶有正電荷，可以直接穿透細胞膜，進入細胞漿和細胞核，可作為藥物載體進行腫瘤治療。
因此，需要構建一種既能靶向腫瘤細胞，又能高效入胞的新型多肽。
技術實現(xiàn)要素：
肝細胞核因子4a(hnf4a)在多種腫瘤中發(fā)揮重要的生物學作用。發(fā)明人通過rna-seq分析，發(fā)現(xiàn)其上游序列存在多個sorf，通過構建sorf表達載體，發(fā)現(xiàn)sorf編碼產物能明顯調控腫瘤細胞內hnf4a表達水平，且影響多種腫瘤細胞的生物學活性。為進一步明確sorf編碼產物對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的調控作用，發(fā)現(xiàn)靶向活性治療肽，人工合成了基于內源性sorf編碼序列的活性肽。
基于該研究，本發(fā)明提供了一種靶向腫瘤細胞的多肽，其氨基酸序列如seqidno:1所示。
本發(fā)明還提供了上述靶向腫瘤細胞的多肽在抗腫瘤藥物研究中的應用。
本發(fā)明還提供了一種促進腫瘤細胞增殖和/或遷移的多肽，其包括腫瘤細胞靶向結構域和穿膜結構域，所述腫瘤細胞靶向結構域的氨基酸序列如seqidno:1所示。
優(yōu)選地，所述穿膜結構域的氨基酸序列如seqidno:2所示。
優(yōu)選地，所述穿膜結構域連接于所述腫瘤細胞靶向結構域的n端。
本發(fā)明還提供了上述促進腫瘤細胞增殖和/或遷移的多肽在抗腫瘤藥物研究中的應用。
本發(fā)明的優(yōu)點在于，本發(fā)明的多肽的穿膜結構域本身沒有細胞毒性，但連接腫瘤細胞靶向結構域后，有明顯的改變腫瘤增殖、遷移侵襲行為的效應。本發(fā)明的多肽可成為篩選靶向性生物治療腫瘤的活性多肽。
附圖說明
圖1為用本發(fā)明的多肽和對照多肽孵育腫瘤細胞后的熒光顯微鏡照片；
圖2為不同濃度的多肽對sh-n-sh細胞增殖活性影響的統(tǒng)計圖；
圖3為不同濃度的多肽對pc-3細胞增殖活性影響的統(tǒng)計圖；
圖4為含有不同濃度多肽的軟瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)sh-n-sh細胞10-14天后的培養(yǎng)孔的四甲基偶氮唑藍染色照片；
圖5為transwell實驗的結晶紫染色照片。
具體實施方式
以下結合實例對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
1.促進腫瘤細胞增殖的多肽的合成
通過固相合成法合成一種促進腫瘤細胞增殖的多肽，其包括一個腫瘤細胞靶向結構域和一個穿膜結構域，其中腫瘤細胞靶向結構域序列如seqidno:1所示，穿膜結構域序列如seqidno:2所示，連接于腫瘤細胞靶向結構域的n端，所得到的序列為：氨基酸序列為ygrkkrrqrrr-mnrsttrsapcrpmlgvyyryknslwsii(seqidno:3)。為了研究方便，我們還在抗腫瘤多肽的c端標記的異硫氰酸熒光素標記fitc。由百意欣多肽(武漢)有限公司外包合成，最終得到純度為95％以上外源性合成短肽。
2.多肽的細胞定位檢測
采用人前列腺癌細胞株pc-3細胞進行實驗。將對數(shù)期生長的細胞種植在24孔板內的蓋玻片上，每孔約8000-12000個細胞。以10％胎牛血清，高糖dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)，并加入10-50μm的多肽，培養(yǎng)12、24和36小時。以與該多肽相同組成的氨基酸隨機重新排列后的錯序肽作為對照肽。
棄去培養(yǎng)基，加入4％多聚甲醛300μl/孔，室溫固定細胞10-20分鐘，棄去多聚甲醛，1×pbs清洗兩次，每次5分鐘。
加入dapi溶液200μl/孔，室溫染細胞核5-10分鐘，1×pbs充分洗滌5次，每次5分鐘。純甘油封片，將蓋玻片固定于載玻片上。采用激光共聚焦顯微鏡檢測帶有熒光基團的多肽在細胞內的定位，拍照并保存。
實驗結果如圖1所示，該多肽在加入細胞培養(yǎng)體系12小時之后，能有效穿透腫瘤細胞膜進入細胞，顯示強胞漿及胞核染色，并隨著時間的延長穿透入胞量增加，說明該多肽能夠有效進入腫瘤細胞的胞漿和胞核內。
3.mtt比色法分析檢測該多肽對sh-n-sh和pc-3細胞增殖的影響
分別采用人神經母細胞瘤細胞系sh-n-sh、人前列腺癌細胞系pc-3進行了檢測。在96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔種植5000個細胞培養(yǎng)，每個樣品設定10個復孔。過夜后，加入合成活性肽及其對照肽。多肽濃度分別為10、30、50和100μm，觀測12、24、36和48小時。
吸棄培養(yǎng)上清，用1×pbs清洗樣品孔3次，每次5分鐘。再向樣品孔中加入100μl二甲基亞砜(dmso)溶液。將培養(yǎng)板靜置于37℃，10分鐘。取出后輕輕混勻孔內樣品。用酶標儀檢測570nm吸光度。
實驗結果如圖2和3所示：與對照肽比較，該合成活性肽能顯著促進多種腫瘤細胞的增殖活性，以50μm濃度24小時時較為明顯。而對照錯序肽并不體現(xiàn)出明顯的增強或抑制增殖效應。
4.合成肽對腫瘤細胞軟瓊脂集落形成的影響
用蒸餾水分別制備出1.2％和0.7％兩個濃度的低溶點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40℃中不會凝固。
取對數(shù)生長期人神經母細胞瘤細胞系sh-n-sh，用0.25％胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細胞，進行活細胞計數(shù)。六孔板每孔細胞數(shù)控制在300-500個。
將多肽按照50μm濃度加入培養(yǎng)基中，再按1:1比例使1.2％的瓊脂糖和2×1640培養(yǎng)基(含有2×抗生素和20％的小牛血清)混合后，取3ml混合液注入六孔板，冷卻凝固，可作底層瓊脂置co2溫箱中備用。
按1:1比例讓0.7％的瓊脂糖和2×dmem培養(yǎng)基在無菌試管中相混，以后制備2ml上層膠，再向管中加入0.2ml的細胞懸液，充分混勻，注入底層平皿中，逐形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37℃、5％co2溫箱中培養(yǎng)10-14天，待肉眼可見形成細胞集落為止。
向培養(yǎng)完成的六孔板中加入0.5％mtt溶液，4℃染色2-3小時，取出觀察照相。顯微鏡下計數(shù)細胞集落形成數(shù)目。
實驗結果如圖4所示：與對照肽比較，濃度50μm的合成活性肽能顯著促進腫瘤細胞的軟瓊脂集落形成
5.檢測合成肽對腫瘤細胞遷移活性的影響
在24孔培養(yǎng)板中放置transwell小室(購自corning公司，貨號：3422)，向底層加入含15％胎牛血清的完全培養(yǎng)基，并向培養(yǎng)基中加入不同濃度的合成肽以及對照肽。
用無血清培養(yǎng)基制備單細胞懸液，以200μl無血清培養(yǎng)基向transwell上室中加入人神經母細胞瘤細胞系sh-n-sh細胞懸液，約1-2×104個細胞。并向上室內加入與下室相同濃度的合成肽。
37℃、5％co2條件下培養(yǎng)24小時。取出小室放入4％多聚甲醛中固定10-20分鐘，再放入0.5％結晶紫染色液中染色1小時。
用含5％乙醇的雙蒸水清洗小室，用棉簽輕輕去除上室中未穿過多孔膜的細胞，在倒置顯微鏡下對多孔膜進行照相計數(shù)。
實驗結果如圖5所示：與對照肽比較，濃度50μm的合成活性肽能顯著促進腫瘤細胞遷移能力。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
序列表
<120>一種可殺傷腫瘤細胞的多肽及其應用
<130>1
<160>3
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>29
<212>prt
<213>人工序列
<400>1
metasnargserthrthrargseralaprocysargprometleugly
151015
valtyrtyrargtyrlysasnserleutrpserileile
2025
<210>2
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<400>2
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1510
<210>3
<211>40
<212>prt
<213>人工序列
<400>3
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