本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)胞松弛素類化合物aspochalasind的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥是嚴(yán)重威脅人類生命健康的常見病、多發(fā)病，死亡率極高，全世界每年死于癌癥的約有430萬人，我國每年死于癌癥的約有100萬人，而且這種情況還在加劇。因此，研發(fā)具有抗腫瘤活性的藥物具有重要的意義。

海洋生物因其所處的高壓、高鹽、低溫、低營養(yǎng)等特殊的生活環(huán)境而產(chǎn)生和積累了許多結(jié)構(gòu)新穎、生物活性顯著的次級代謝產(chǎn)物，成為研究發(fā)現(xiàn)新型海洋藥物的重要資源。而海洋微生物因其不受生長季節(jié)限制且可人工大規(guī)模培養(yǎng)的特點，相較于其他海洋生物資源而言不致引起生態(tài)破壞，易于解決藥源問題，因此在后續(xù)開發(fā)研究方面具有獨特的優(yōu)勢。

如公開號為cn101591288a的中國專利文獻(xiàn)從球毛殼菌(chaetomiumglobosum)的發(fā)酵物中分離得到一個細(xì)胞松弛素類化合物，該化合物可作為細(xì)胞增殖抑制劑或腫瘤細(xì)胞殺傷劑。

又如公開號為cn105085538a的中國專利文獻(xiàn)公開了通過對黃柄曲霉固體發(fā)酵和對其發(fā)酵產(chǎn)物的甲醇提取物進(jìn)行分離純化，得到18個細(xì)胞松弛素類新化合物，通過抗腫瘤活性評價，發(fā)現(xiàn)化合物1(黃柄曲霉菌素a)對白血病細(xì)胞hl-60，人肝癌細(xì)胞smmc-7721，人肺癌細(xì)胞a-549，人乳腺癌細(xì)胞mcf-7，人結(jié)腸癌細(xì)胞sw480有一定的抑制作用，同時發(fā)現(xiàn)化合物1能夠特異性的將人早幼粒白血病細(xì)胞hl-60、急性早幼粒白血病細(xì)胞株nb4、結(jié)腸癌細(xì)胞株rko、人結(jié)直腸癌細(xì)胞hct116阻滯在g1期，而對兩株正常細(xì)胞無明顯影響。

細(xì)胞松弛素是由真菌產(chǎn)生的一種結(jié)構(gòu)和活性相關(guān)的次級代謝產(chǎn)物，大多具有高度取代的全氫異吲哚酮并大環(huán)內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)的獨特性造就了該類化合物的具有抑制hiv病毒，抗腫瘤等多種活性。rochfortsimone等發(fā)現(xiàn)aspochalasinl對hiv-1整合酶具有抑制活性，其半數(shù)抑制濃度ic50為71.7μm(journalofantibiotics,2005,58(4),279-283)；taijirotomikawa等發(fā)現(xiàn)aspochalasind可使小鼠原b細(xì)胞ba/f3凋亡，其半數(shù)致死濃度為0.49μg/ml(1.22μm)(thejournalofantibiotics,2001,54(4),379-381)；linzhenjian等發(fā)現(xiàn)aspochalasind對人肺癌細(xì)胞a-549有抑制活性，其半數(shù)抑制濃度為6.4μm(europeanjournaloforganicchemistry,2009,18,3045-3051)。然而，至今未見有關(guān)化合物aspochalasind對前列腺癌細(xì)胞有較強(qiáng)抑制活性的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的提供一種細(xì)胞松弛素類化合物aspochalasind的制備方法以及該化合物在制備抗前列腺藥物中的應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種制備細(xì)胞松弛素類化合物aspochalasind方法，包括：將保藏號為cctccno:m2013631的黃柄曲霉z-4接入大米培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，再從發(fā)酵液中分離得到細(xì)胞松弛素類化合物aspochalasind。

所述黃柄曲霉(aspergillusflavipes)z-4是從海蟑螂的腸道中分離得到，該菌株的菌落生長速度較快，質(zhì)地疏松，平坦，絲絨放射狀，邊緣整齊；分生孢子球形，分生孢子頭呈放射狀。該菌株已保藏于位于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctccno:m2013631，保藏日期為2013年12月4日。

本發(fā)明研究證明，黃柄曲霉z-4只有在大米培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵才會產(chǎn)生細(xì)胞松弛素類化合物aspochalasind。所述大米培養(yǎng)基包括大米和人工海水，由于黃柄曲霉z-4為來源于海洋的微生物，培養(yǎng)基中添加人工海水更利于其生長。

作為優(yōu)選，所述大米培養(yǎng)基由大米與3％人工海水以質(zhì)量體積比1:1～1:1.5混合制得。原料混合后，經(jīng)121℃高壓滅菌20min制得大米培養(yǎng)基。

將活化后的菌種液以1:5(v:w)的比例接入大米培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為23～28℃靜置培養(yǎng)25～35天。作為優(yōu)選，發(fā)酵溫度為25℃，時間為28天。

本發(fā)明采用靜態(tài)培養(yǎng)方式。

發(fā)酵制得的發(fā)酵液中成分復(fù)雜，本發(fā)明聯(lián)合使用多種分離方式，從而獲得細(xì)胞松弛素類化合物aspochalasind。所述分離包括依次進(jìn)行的有機(jī)溶劑萃取、正相硅膠色譜純化和高效液相色譜純化。

萃取時，采用的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿或甲醇，作為優(yōu)選，有機(jī)溶劑為乙酸乙酯。萃取時，發(fā)酵液與有機(jī)溶劑的體積比為1:1。收集有機(jī)相，減壓回收有機(jī)溶劑得到提取物。

正相硅膠色譜純化時，以二氯甲烷和甲醇的混合液作為洗脫溶劑，洗脫時，依次采用體積比為100:1、98:2、95:5、90:10、80:20、50:50、0:100的二氯甲烷/甲醇混合液進(jìn)行洗脫。收集體積比為95:5的二氯甲烷和甲醇混合液洗脫的餾分。

高效液相色譜純化時，以80％的甲醇水溶液作為洗脫劑。收集該餾分即得細(xì)胞松弛素類化合物aspochalasind純品。

本發(fā)明提供了由上述方法制備得到的細(xì)胞松弛素類化合物aspochalasind。在體外抗腫瘤活性測試中，本發(fā)明的化合物aspochalasind具有明顯的抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的作用，因此，該化合物可用于制備前列腺癌細(xì)胞抑制劑或者抗前列腺癌藥物或前列腺癌預(yù)防保健品中。

當(dāng)化合物aspochalasind應(yīng)用于制備抗前列腺癌藥物時，以有效劑量的細(xì)胞松弛素類化合物aspochalasind作為活性成分，添加藥學(xué)上可接受的輔料。

所述藥學(xué)上可接受的輔料包括淀粉、蔗糖、微晶纖維素等填充劑，淀粉漿、羥丙纖維素、明膠、聚乙二醇等粘合劑，硬脂酸鎂、微粉硅膠、聚乙二醇類等濕潤劑，聚山梨脂、卵磷脂等吸收促進(jìn)劑，伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦、聚山梨脂等表面活性劑，還可以加入香味劑、甜味劑等其它輔劑。

藥物的劑型可以是片劑、丸劑、粉劑、分散片、小藥囊劑、酏劑、混懸劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑、氣霧劑、膠囊、注射液、搽劑、栓劑等。上述各種劑型可采用常規(guī)方法進(jìn)行制備。

給藥途徑為腸內(nèi)給藥或非腸內(nèi)給藥，包括口服、肌肉注射、皮下注射、靜脈注射等。

當(dāng)化合物aspochalasind應(yīng)用于制備前列腺癌預(yù)防保健品時，以有效劑量的化合物aspochalasind為活性成分，添加食品上可接受的輔料。

本發(fā)明具備的有益效果：

(1)本發(fā)明首次利用海洋真菌黃柄曲霉z-4在大米培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，提取分離得到細(xì)胞松弛素類化合物aspochalasind，為化合物aspochalasind的生產(chǎn)提供新的制備方式，而且該方法簡便易于操作，生產(chǎn)成本低廉，適合規(guī)模化生產(chǎn)。

(2)本發(fā)明從黃柄曲霉z-4發(fā)酵產(chǎn)物中獲得的化合物aspochalasind具有顯著的抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的活性，因此可將其開發(fā)應(yīng)用于抗前列腺癌藥物或前列腺癌預(yù)防保健食品當(dāng)中。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。

下述實施例采用的菌株為黃柄曲霉(aspergillusflavipes)z-4，該菌株已保藏于位于中國武漢武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctccno:m2013631，保藏日期為2013年12月4日。

實施例1

化合物aspochalasind的制備

(1)發(fā)酵：500ml三角錐形瓶中加入40g大米，3％人工海水45ml，121℃高壓滅菌20min得到大米培養(yǎng)基。

將菌株z-4從斜面培養(yǎng)基移入大米培養(yǎng)基中，25℃靜置培養(yǎng)28天。將菌液過濾后用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層，減壓回收有機(jī)溶劑后得到提取物40g。

(2)分離和純化：上述提取物用正相硅膠柱層析(200～300目硅膠，450g)，以二氯甲烷/甲醇(體積比100:1-0:100)進(jìn)行洗脫，具體為：依次以體積比為100:1、98:2、95:5、90:10、80:20、50:50、0:100的二氯甲烷/甲醇進(jìn)行梯度洗脫，每濃度體積1000ml，薄層層析檢測，合并含有目標(biāo)化合物的餾分(即體積比為95:5的二氯甲烷/甲醇洗脫的餾分)；經(jīng)制備型ods-hplc(80％甲醇/水洗脫，流速為10ml/min，保留時間為20min)純化，得到目標(biāo)化合物純品(2mg)。目標(biāo)化合物為白色無定型固體。

(3)經(jīng)鑒定，目標(biāo)化合物為細(xì)胞松弛素類化合物aspochalasind，化學(xué)結(jié)構(gòu)為：

實施例2

采用mtt法對化合物aspochalasind進(jìn)行體外抗腫瘤活性測試

細(xì)胞株：前列腺癌pc3細(xì)胞；

培養(yǎng)基：rpmi1640培養(yǎng)基，含10％胎牛血清；

樣品配制：將實施例1獲得的樣品溶于dmso，并按照一定比率稀釋成5個濃度。

活性測試實驗：將處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，以20000個/ml接種96孔板中，每孔加細(xì)胞懸濁液200μl，培養(yǎng)24h后，分別加入上述配制藥液1μl，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。細(xì)胞在37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育48h后，加入濃度為2.5mg/ml的mtt溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去上清液，加入100μldmso搖勻，用酶標(biāo)儀于570nm波長下測定各孔的吸光度值(od值)，并計算細(xì)胞抑制率。

表1aspochalasind的抗腫瘤活性

表1中可見化合物aspochalasind對前列腺癌pc3細(xì)胞的增殖具有較強(qiáng)的抑制作用，半數(shù)抑制濃度ic50約為11.4μm。

從化合物aspochalasind的物理性質(zhì)可知其可溶于甲醇，也可溶于二甲基亞砜或二甲基亞砜的含水溶液。

因此，化合物aspochalasind可作為抗前列腺癌藥物或前列腺癌預(yù)防保健食品中加以利用。