本發(fā)明屬于植物分子生物學領域，具體涉及一種玉米SILKY1基因突變體silky1-3552及其分子鑒定方法和應用。
背景技術：
：：植物雄性不育突變是自然界中十分普遍的現(xiàn)象，至少己在43個科、162個屬的617個物種中發(fā)現(xiàn)了雄性不育突變體。在遺傳上植物雄性不育分為細胞核雄性不育，細胞質(zhì)雄性不育和細胞核細胞質(zhì)互作雄性不育三大類：1)細胞核雄性不育由細胞核基因突變產(chǎn)生，有顯性突變和隱性突變，有孢子體基因突變和配子體基因突變。顯性突變和配子體基因突變只能通過雌配子遺傳，隱性突變既可通過雌配子也可通過雄配子進行遺傳，而且遵循孟德爾定律。目前已克隆了一些孢子體隱性核不育基因，如擬南芥的MS2，玉米的MS45和水稻的MIL1等(Aarts等，1997，TheArabidopsisMALESTERILITY2proteinsharessimilaritywithreductasesinelongation/condensationcomplexes，PlantJournal，12:615-623；Albertsen，2006，Maletissue-preferredregulatorysequencesofMS45geneandmethodofusingsame，專利號：US7154024B2；Hong等，2012，Somaticandreproductivecelldevelopmentinriceantherisregulatedbyaputativeglutaredoxin，PlantCell，24:577-588)；一些配子體隱性核不育基因也被克隆，如擬南芥的兩個小孢子有絲分裂異常的突變體sidecarpollen和geminipollen(Oh等，2010，TheSIDECARPOLLENgeneencodesamicrospore-specificLOB/AS2domainproteinrequiredforthecorrecttimingandorientationofasymmetriccelldivision，PlantJournal，64:839-50；Park等，1998，TheArabidopsisthalianagametophyticmutationgeminipollen1disruptsmicrosporepolarity,divisionasymmetryandpollencellfate，Development，125:3789-99)；玉米上還克隆了一個孢子體顯性核不育基因MS44(CiganandAlbertsen，1998，Reversiblenucleargeneticsystemformalesterilityintransgenicplants，US5750868)；2)細胞質(zhì)雄性不育則是由細胞質(zhì)基因控制，并沒有相對應的核恢復基因，屬母性遺傳；3)細胞核細胞質(zhì)互作雄性不育由細胞質(zhì)基因和細胞核基因共同控制，其實質(zhì)是細胞質(zhì)與細胞核遺傳物質(zhì)不和的結果。不育細胞質(zhì)是一些由突變線粒體基因引起，但有相對應的核恢復基因，能抑制不育細胞質(zhì)基因。不育細胞質(zhì)基因可產(chǎn)生一種新的蛋白質(zhì)，夠影響線粒體正常功能(ChenandLiu，2014，Malesterilityandfertilityrestorationincrops，AnnuRevPlantBiol，65:5.1-5.28)。在育恢復基因方面，目前水稻中已經(jīng)克隆了Rf-1，Rf-2，Rf-4，Rf-5等基因(Komori等，2004，Map-basedcloningofafertilityrestorergene,Rf-1,inrice(OryzasativaL.)，PlantJournal，37:315-325；Itabashi等，2011，Thefertilityrestorergene,Rf2,forLeadRice-typecytoplasmicmalesterilityofriceencodesamitochondrialglycine-richprotein，PlantJournal，65:359-367；Tang等，2014，ThericerestorerRf4forwild-abortivecytoplasmicmalesterilityencodesaPPRproteinthatfunctionsinreductionofWA352transcripts，MolecularPlant，7:1497-500；Hu等，2012，ThericepentatricopeptiderepeatproteinRF5restorersfertilityinHong-LianCytoplasmicmale-sterilelinesviaacomplexwiththeglycine-richproteinGRP162，PlantCell，24:109-22)。玉米在我國乃至全世界的糧食的糧食生產(chǎn)中有著舉足輕重的地位，到2013年，我國玉米的總產(chǎn)量達到2.15億噸，占據(jù)糧食總產(chǎn)量的35％，首次超過水稻成為第一大糧食作物；玉米是雜種優(yōu)勢利用的典范，其中雜交育種和制種技術的關鍵均在于母本的去雄。人工去雄相對容易，還可以通過機械去雄、化學殺雄等途徑，但是這些策略也存在一些問題：一方面，這些技術大大增加了制種的成本，另一方面，因人工去雄的不徹底或不及時，會降低雜交種的純度，造成生產(chǎn)上大面積減產(chǎn)，最終導致很大的經(jīng)濟損失。因此，提高雜交種種子純度是當前玉米生產(chǎn)上急待解決的問題，而利用雄性不育系制種是提高雜交種質(zhì)量最為有效的途徑之一。玉米核雄性不育材料是一種寶貴的種質(zhì)資源，對玉米雜交種生產(chǎn)具有極其重要的意義，但長期以來，由于純合核雄性不育系無法繁殖保持等問題，這類材料在實際生產(chǎn)上幾乎沒有被有效地利用起來。隨著新的核雄性不育材料的不斷發(fā)現(xiàn)，玉米育種家對其進行了多方面的研究和利用嘗試，如利用標記性狀與不育性的緊密連鎖關系，開發(fā)了粒色標記系統(tǒng)法、黃綠苗連鎖標記法和多花絲連鎖標記體系等，但是由于標記性狀與不育性連鎖不完全、標記性狀鑒定困難、鑒定時期滯后等問題，這些方法和嘗試在玉米生產(chǎn)上并沒有得到推廣應用。隨著現(xiàn)代生物技術的迅速發(fā)展，部分玉米核雄性不育材料的不育機理逐漸明確，為分子設計創(chuàng)制穩(wěn)定的玉米不育系奠定了理論基礎。利用人工誘變比如物理輻射，化學處理，組織培養(yǎng)等方法，人們在玉米上獲得了多種新的不育突變體。silky1突變體是其中之一，其雄小花不產(chǎn)生雄蕊，但形成絲狀物，雌花花絲大量增多。SILKY1基因有7個外顯子，編碼一個227個氨基酸的蛋白；SILKY1在雄花花原基初期的雄蕊原基和漿片原基中特異表達，決定著雄蕊的分化和漿片的形成；SILKY1在雌花中表達量較低，突變引起雄蕊轉(zhuǎn)化成心皮樣器官，在每個雌小花中同時出現(xiàn)4條花絲，其中僅有原雌花的花絲能正常授粉結實(AmbroseBA,LernerDR,CiceriP,PadillaCM,YanofskyMF,SchmidtRJ.MolecularandgeneticanalysesoftheSilky1generevealconservationinfloralorganspecificationbetweeneudicotsandmonocots.Molecularcell，2000；5:569-79)。SILKY1與擬南芥AP3蛋白同源，屬于MIKC類型的MADS家族蛋白，含有M(MADS)、I(intervening)、K(keratin)和C(C-terminal)四個結構域，其中M可與特異DNA序列結合，K結構域是SILKY1中最為保守的結構域，為DNA結合二聚體和蛋白復合體的形成所必需(KaufmannK1,MelzerR,TheissenG.MIKC-typeMADS-domainproteins:structuralmodularity,proteininteractionsandnetworkevolutioninlandplants.Gene.2005Mar14；347(2):183-98.)。然而，上述文獻中報道的4個silky1突變體中，si1-R是自發(fā)突變，具體突變序列不詳，是非完全敲除，仍然有少量基因表達水平；此外，該突變體報道于1933年的美國玉米(FraserAC.Heritablecharactersofmaize.XLIV-silkyears.JournalofHeredity，1933，11:41-46)，可能存在于突變基因連鎖的不適于當代玉米品種或中國生態(tài)環(huán)境的不利基因。其余三個silky1突變體(si1-mum2，si1-mum3，si1-mum4)為人工創(chuàng)制的Mutator轉(zhuǎn)座子插入突變體，這種類型突變體非常有利于分離突變基因，但其中插入的轉(zhuǎn)座子在后代中仍然具有繼續(xù)誘導新的突變的能力，也有一定概率發(fā)生回復突變，因而在遺傳上不夠穩(wěn)定(RobertsonDS.Characterizationofamutatorsysteminmaize.MutationResearch/FundamentalandMolecularMechanismsofMutagenesis.1978，51(1):21-28)，不利于生產(chǎn)應用。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種玉米SILKY1基因突變體silky1-3552及其分子鑒定方法和應用。本發(fā)明首先對雜交種京科糯2000種子(M0代)進行鈷60輻射誘變處理，種植處理的種子獲M1代植株；M1代植株自交產(chǎn)生種子(為M2代)，種植M2代植株，對M2代植株進行形態(tài)學，組織學和遺傳學鑒定，篩選不育植株；然后對不育植株進行基因測序和DNA序列分析，在分子水平上進行驗證。最后獲得純合不育單株，并用于雜交育種和生物技術研究。本發(fā)明提供的玉米SILKY1基因突變體silky1-3552，其為玉米SILKY1基因起始密碼子起基因組序列第373個堿基，即編碼區(qū)第239個堿基之后插入兩個堿基GA，該突變位點位于第二外顯子上。進一步地，玉米SILKY1基因突變體silky1-3552，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本發(fā)明提供了含有本發(fā)明所述玉米SILKY1基因突變體silky1-3552的表達載體。本發(fā)明提供了含有上述表達載體的宿主細胞。本發(fā)明提供了玉米SILKY1基因突變體silky1-3552在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應用。本發(fā)明提供了玉米SILKY1基因突變體silky1-3552在制備隱性雄性核不育的轉(zhuǎn)基因水稻中的應用。本發(fā)明提供了玉米SILKY1基因突變體silky1-3552在玉米改良育種、制種中的應用。本發(fā)明還提供了檢測玉米SILKY1基因突變體silky1-3552的分子標記，該分子標記是由以下引物對擴增得到，所述引物對的核苷酸序列為：上游引物3552_F：CGTGTGTGTTGGTTGGTTGGT(如SEQIDNO.2所示)；下游引物3552_R：GACGGACCTCATACTGCTCGAT(如SEQIDNO.3所示)。本發(fā)明提供了上述分子標記在制備隱性雄性核不育的轉(zhuǎn)基因玉米中的應用。本發(fā)明提供了上述分子標記在玉米種質(zhì)資源改良中的應用。一種玉米SILKY1基因突變體silky1-3552的分子標記的方法，通過下述引物對擴增待檢植物基因組DNA，并檢測酶切產(chǎn)物：所述引物對的核苷酸序列為：上游引物3552_F：CGTGTGTGTTGGTTGGTTGGT(如SEQIDNO.2所示)；下游引物3552_R：GACGGACCTCATACTGCTCGAT(如SEQIDNO.3所示)；如果用上述引物對能夠擴增出比野生型京科糯2000擴增產(chǎn)物長2bp的片段，則標志著該待檢植物存在玉米SILKY1基因突變體silky1-3552。本發(fā)明的有益效果在于：1)本發(fā)明獲得的突變體silky1-3552雄蕊完全消失，不存在雄性敗育不徹底的缺點。2)本發(fā)明使用的被誘變材料是優(yōu)良雜交糯玉米品種京科糯2000，突變體可直接用于普通玉米和糯玉米的不育系選育。3)文獻“AmbroseBA,LernerDR,CiceriP,PadillaCM,YanofskyMF,SchmidtRJ.MolecularandgeneticanalysesoftheSilky1generevealconservationinfloralorganspecificationbetweeneudicotsandmonocots.Molecularcell,2000，5:569-79”中報道了4個silky1突變體，其中1個si1-R為自然突變，其余3個為Mutator轉(zhuǎn)座子插入突變。自發(fā)突變體si1-R并不是完全敲除突變體，仍然有一定的表達水平，因此該突變基因功能可能喪失不完全；其次，si1-R最早報道于1933年(FraserAC.Heritablecharactersofmaize.XLIV-silkyears.JournalofHeredity，1933，11:41-46)，突變品種為老品種，可能攜帶不適于現(xiàn)代品種、或不適于中國特殊生態(tài)環(huán)境的連鎖基因。與si1-R相比，本發(fā)明的突變體基因組背景是國內(nèi)廣泛應用的當代雜交玉米品種，其攜帶不良連鎖基因的概率很?。槐景l(fā)明突變體使SILKY1蛋白完全失去K和C結構域，生理功能完全喪失，不存在表型部分恢復的可能。Ambrose等人創(chuàng)制的其余3個silky1突變體，是利用玉米Mutator轉(zhuǎn)座子插入獲得的，該類型突變，存在體細胞回復突變的情況；Mutator插入突變體的另一個缺陷是該轉(zhuǎn)座子可能仍然具有活性，導致突變體后代頻繁產(chǎn)生新的突變表型。以上特點都使Mutator插入突變體遺傳難以完全穩(wěn)定，不利于生產(chǎn)應用。而本發(fā)明突變基因是兩個堿基的簡單缺失，不存在表型回復的可能，也不會引發(fā)新的突變，遺傳穩(wěn)定，完全適合生產(chǎn)應用。附圖說明圖1是實施例2中野生型京科糯2000和3552突變體的雄穗、雌穗和小花照片。圖2是實施例6中3552突變體SILKY1基因的突變位點及氨基酸殘基改變示意圖。圖3是實施例7中野生型HiIIB、3552突變體、“3552×HiIIB”F2群體中可育株和不育株SILKY1基因突變位點的PCR產(chǎn)物的電泳照片。圖4是實施例8的雜交轉(zhuǎn)育的技術路線圖。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1：鈷60輻射誘變突變體庫2015年秋，于長沙鈷60(Co60)輻射京科糯2000種子(M0代)3公斤，10月種植于海南三亞田間，分單株收獲M1代種子，共收獲約5495份種子。選取M1代種子4678個株系，每個株系種植50棵單株。2016年春季，種植于海南臨高田間。在孕穗期、抽穗期、開花期、灌漿期等經(jīng)過仔細觀察田間性狀，篩查株型、穗型、育性、產(chǎn)量等各種類型突變體，對各類型突變體單株收種保存作為特殊突變體。實施例2：M2代種植與性狀觀察在M2代抽穗、開花期間，在田間對花藥的形態(tài)進行觀察，選取顏色淺白、形態(tài)小、花粉量小等表現(xiàn)異常的花藥在顯微鏡下進行進一步鏡檢。在編號為3552的家系中發(fā)現(xiàn)1株育性異常的植株，該突變體在營養(yǎng)生長、抽穗期、穗型均與野生型沒有明顯區(qū)別，雄花中沒有花藥(圖1E)，部分雄穗小花有絲狀結構長出(圖1A，1F)，與野生型相比，雌穗花絲非常濃密(圖1C，1D)，每個雌穗小花長出多個花絲(圖1G)。開放授粉下，雌穗結實正常。該突變體與已報道silky1突變體表型一致(AmbroseBA,LernerDR,CiceriP,PadillaCM,YanofskyMF,SchmidtRJ.MolecularandgeneticanalysesoftheSilky1generevealconservationinfloralorganspecificationbetweeneudicotsandmonocots.Molecularcell2000；5:569-79)。實施例3：自交和異交開放授粉以及以玉米自交系HiIIB為父本授粉，3552突變體均可正常結實。表明該突變體為雄性不育突變體?！?552×HiIIB”F1代自交得到F2代種子，種植F2代植株314株，將雄小花解剖后觀察，其中232株雄花正常，82株無雄蕊，符合3:1分離，表明該不育性狀由單個隱性基因控制。實施例4：葉片采樣與DNA提取本項研究采用CTAB法提取水稻葉片DNA，具體方法如下：稱取約0.1g葉片，放入離心管，加入600μLCTAB提取緩沖液，5μLRNaseA，震蕩分散，65℃水浴0.5hr，其間輕搖2-3次；加入等體積氯仿/Tris-飽和酚(1:1，v/v)，混勻，輕搖10min；4℃10000rpm離心20min；轉(zhuǎn)移上清至新管，加入1/10體積的3M乙酸鈉(pH值5.2)、0.6-1倍體積的冷異丙醇；輕搖混勻，至絮狀沉淀出現(xiàn)；4℃10000rpm離心10min；棄去上清，用體積百分含量70％乙醇洗沉淀2次；風干，加入50μL1×TE溶解沉淀，-20℃保存。用Nanodrop2000檢測DNA濃度，稀釋至10ng/L用作PCR模板。實施例5：PCR反應與產(chǎn)物回收根據(jù)玉米SILKY1基因序列合成特異引物擴增野生型京科糯2000和突變體DNA。用于擴增SILKY1的引物對序列見表1：表1用于擴增MSP1的引物對序列引物對名稱正向引物反向引物Silky1_1ACGGCACCCACAATACGGGCCTCCAGCGTCTCGATSilky1_2TTGGTTCAATCGCAGCATAATTCATGTAAACTCGCGGATSilky1_3TGGATCCGCGAGTTTACATGAATTAGATGCATTGACACTGGGSilky1_4AAACCCTAATCTCTTGCGCATAAGATACGGTCTCTAGCCSilky1_5TTTTCAGTACCATGTGATCAGCACATAAAACTATGCATTGGCTSilky1_6GGTAAGAAAATCTAGCATTATCGGCACACTACAGAGTCCTTGCSilky1_7ATGCAAAGCGCTAGCTGTTCAGCAACAATGCAAGGTCSilky1_8TTACATACTGATGATAGATCTCCGGGTTAAGTCTCACGAATGTAGSilky1_9AGTAATAACCGAATAAGGCCTCATGTGCATTGCATTGCTTACTTGCTPCR反應體系為：1μL10×反應緩沖液，0.25μLdNTP，0.25μL正向引物和0.25μL反向引物，0.5UTaq酶，1μL10ng/μL模板DNA，加超純水將總體積補至10μL。PCR反應程序為：94-98℃變性1-3min，然后執(zhí)行以下循環(huán)：95℃變性20s，53-58℃復性20s，72℃延伸30s，30-40個循環(huán)。循環(huán)結束后72℃補充延伸3-10min，結束反應。配置1.5％瓊脂糖凝膠，在5V/cm電場下電泳30min；采用市面DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。實施例6：DNA序列分析將回收所得野生型與突變體的PCR產(chǎn)物DNA采用ABI3730測序儀進行測序，測序引物分別使用正向引物與反向引物。使用常見DNA序列分析軟件DNAman6.0對雙向測序結果進行拼接；將3552突變體的SILKY1等位基因記為silky1-3552。對野生型和突變體序列進行比對發(fā)現(xiàn)，在玉米SILKY1基因的編碼區(qū)第239位堿基，即基因組序列中起始密碼子起第373位堿基后插入2個堿基GA(參見圖2三角形號處)；蛋白序列分析比對顯示，該突變引起了SILKY1蛋白從第81位氨基酸殘基起發(fā)生移碼突變，并在第91個氨基酸殘基之后形成終止密碼子而提前終止蛋白翻譯(參見圖2星號位置)。這一移碼和刪除突變，導致SILKY1中的K結構域(第89-154氨基酸，AmbroseBA,LernerDR,CiceriP,PadillaCM,YanofskyMF,SchmidtRJ.MolecularandgeneticanalysesoftheSilky1generevealconservationinfloralorganspecificationbetweeneudicotsandmonocots.Molecularcell,2000，5:569-79)以及之后的序列完全刪除。實施例7：突變位點分子標記設計與基因型-表型共分離鑒定根據(jù)實施例6中得到的突變位點兩側(cè)的序列設計基因特異引物：正向引物3552_F，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；反向引物3552_R，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。在實施例5中所述PCR反應條件下，用上述引物對擴增HiIIB、突變體3552、“3552×HiIIB”F2群體中不育株和可育株的DNA。擴增產(chǎn)物在6％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離。聚丙烯酰胺凝膠電泳方法如下：(1)聚丙烯酰胺膠的配制：6％PA膠80mL，10％過硫酸胺250μL(冬天)/125μL(夏天)，四甲基乙二胺(TEMED)80μL。搖勻后灌膠。用洗滌劑把玻璃板反復擦洗干凈，用酒精擦凈、晾干。在通風櫥中將凹板涂上2％的RepelSilane后，再用酒精擦凈、干燥，將另一塊平板涂上0.5％的BingdingSilane1.5mL(在1.5ml離心管中加入7.5μLBindingSilane和7.5μL冰醋酸，補足95％乙醇至1.5mL)。操作過程中，防止兩塊玻璃板相互污染，徹底干燥后再進行玻璃板組裝、灌膠。(2)預電泳：待膠凝固后，取出梳子，洗掉上邊凝膠尤其注意接縫處定要洗凈。先在電泳槽下槽(陰極)裝入1×TBE的電極緩沖液，將聚合的凝膠板裝在電泳槽內(nèi)，在上槽中注入0.5×TBE的電極緩沖液。恒定功率40W-65W，預電泳約30min。用吸管清除膠面上沉淀的尿素和氣泡，插入梳子。(3)電泳：擴增產(chǎn)物中加入5μl5×LoadingBuffer混合后95℃變性5分鐘，立刻轉(zhuǎn)移到冰上冷卻，吸取1.5-3μl加入上樣孔；恒定功率40W-65W進行電泳，至溴酚藍到達電泳槽底部結束。視SSR擴增產(chǎn)物分子量大小及差異帶型的可辨程度調(diào)整電泳時間。(4)銀染顯色，將帶膠的一塊玻璃板放入10％的冰乙酸固定液中，65r/min振蕩約30min，直至二甲苯腈全部脫色；蒸餾水沖洗2次，每次5min；將沖洗后的膠板放入新配制的染色液(2L水中加入2g硝酸銀、3mL37％甲醛)中65r/min搖動30min；將染色后的膠板放入蒸餾水沖洗5s，立即拿出進行顯影；將膠板快速轉(zhuǎn)移到4℃預冷的顯影液(2L水中加入30g氫氧化鈉，10ml37％甲醛)輕輕搖動至帶紋出現(xiàn)；將膠板置于10％的冰乙酸固定液中至無氣泡產(chǎn)生為止；用蒸餾水沖洗2次，每次2min；室溫下自然干燥后，拍照保存圖像(圖3)。表型為野生型植株擴增產(chǎn)物的電泳帶型全部為野生型京科糯2000或雜合型帶型，突變體擴增產(chǎn)物的電泳帶型全部與3552的帶型相同。這一結果表明實施例6中所述突變位點與隱性核雄性不育基因是共分離的。這一結果結合該突變體的突變表型、突變位點，以及已發(fā)表文獻中的表型描述，可推斷3552突變體的雄性不育表型是由實施例6中所述的突變造成的。我們將3552突變體中SILKY1突變基因命名為silky1-3552。實施例8：突變基因的雜交轉(zhuǎn)育可按圖4的步驟將3552的不育等位基因silky1-3552通過雜交轉(zhuǎn)育到其它玉米遺傳背景中：①雜交：以3552為母本，與受體玉米材料為父本雜交獲得F1種子；②第一輪回交：F1播種后獲得F1植株，將F1植株與輪回親本進行雜交，獲得BC1種子；②BC1不育基因選擇(前景選擇)：播種BC1種子，獲得不少于500株幼苗，在幼苗期采集各單株葉片，以實施例4中所述方法提取DNA，以實施例7中所列的引物對(3552_F和3552_R)進行擴增，選取基因型為雜合的單株繼續(xù)種植，棄去純合野生型的單株；③BC1背景選擇：采用一組(例如100個，或200個等)在3552和輪回親本之間存在多態(tài)的，且在基因組上均勻分布的分子標記(可以是但不限于SSR、SNP、INDEL、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR等類型標記)，對步驟③中選出的單株進行鑒定，選取與輪回親本相似度高(例如大于88％相似度，或2％中選率等)的材料；⑤第二輪回交：用步驟④中選出的單株為父本，為輪回親本授粉，獲得BC2種子；⑥BC2的前景與背景選擇：對選出的材料重復步驟③至步驟④的操作，選出與輪回親本相似度高于選擇標準(如相似度大于98％，或2％中選率等)的BC2代植株；⑦自交獲得BC2F2種子：對步驟⑥中選出的BC2植株進行自交，獲得BC2F2種子；⑧BC2F2的前景選擇：將步驟⑦中獲得的BC2F2種子播種，獲得500株以上幼苗，在幼苗期采集葉片，以實施例4中所述方法提取DNA，以實施例7中所列的引物對(3552_F和3552_R)進行擴增、酶切和電泳，選出帶型為純合突變體和雜合型的單株繼續(xù)栽培，丟棄純合野生型的單株；⑨BC2F2的背景選擇及應用：將步驟⑧中選出的單株按照步驟④的方法進行背景篩選，選出100％背景純合的單株。如果中選單株的3552_F/3552_R引物對擴增后酶切帶型為純合突變體，則該單株為最終目標材料，可進一步與輪回親本雜交保存材料，或與其它玉米材料進行雜交。如果中選單株是雜合帶型，可直接用于保存種質(zhì)，或通過自交獲得不育株用于雜交育種或制種。SEQUENCELISTING<110>海南波蓮水稻基因科技有限公司<120>一種玉米SILKY1基因突變體及其分子鑒定方法和應用<130>KHP171111643.5TQ<160>22<170>PatentInversion3.5<210>1<211>3926<212>DNA<213>玉米<400>1atggggcgcggcaagatcgagatcaagcggatcgagaacgccaccaaccgccaggtgacc60tactccaagcgccggacggggatcatgaagaaggcgcgcgagctcaccgtgctctgcgac120gcccaggtcgccatcatcatgttctcctccaccggcaagtaccacgagttctgcagcccc180ggaaccgagtcagtactctactcagtagtgtactagtgcctgctcttcctcttccatctc240ccctccctcctccctgcctccgctgcttcaactcgctggctgatcgatctgcgtgtgtgt300tggttggttggttcaatcgcagcatcaagaccatctttgaccggtaccagcaggccatcg360ggaccagcctatggagatcgagcagtatgaggtccgtcagtgatattcgtttccccggcc420ccttgcgtctttcctttcctttccttgcttgctgctggccgccgcctcctctcttttgct480tcgctcgctgctttatccacatgtccatgagatgatgagatctaaagttctaaacgattt540tccatgctttattggttttgatctctctgcagaatatgcagcgcacgctgagccatctca600aggacatcaatcgtggtctgcgcacagagattaggtcaacacagcacggacgaacaaccg660ccactttcctcttcctgtgattattcctcatatgcatgtggattttctgagcgagatgtc720cccgtatactacgagggatggatccgcgagtttacatgaattagctccgacctccgagca780cacaggcttgctgatttgtgtgctgctgtgctcatcaatcaggcaaaggatgggcgagga840tctggacagtctggacttcgacgagctgcgtggcctcgagcaaaacgtcgacgcggctct900caaggaggttcgccataggaaggcacgtacaaaccctaatctcttgcgttttttttctga960ctcccctagtcctagctggctaggtagatctgtcatatctcttctgcgggctgatgatgc1020gctcttcagatctgttcatatttcatgctccttgctgctggtagatctttgctcatgcct1080tctgattcggctttgaatcttgtttttgaagccatcattagatagatctctctggcgtgt1140tgttcgcagttaaaaaaaaaggagatttaggattctttactgggagagagatatatattc1200atctcttgtacacaaattcagtcccagacttcccagtgtccatgcatctaattaagtcct1260gtcaaataaaagtttctttctttctttacctacctcaaacaaaaacatttagccctgatt1320caatatttttctattggtttactagaattggatggatcttgttctcaaaagaaaaggtgg1380ggtaaaagaaaattgttgcttgtaattttttttagaatcttgaataatttcatctcatca1440tgtccatgttttagtcttacctacctcttttgctgatcccttctctcgtttgatttttca1500gtaccatgtgatcagcacgcagactgatacctacaagaaaaaggtaagaaaatctagcat1560tatcggctaagtacatagattttcttatacgtcaattgggcaagagtttgagagctagct1620tagctgcccccaatttggtacagaacagaaatttatttacctgcatatcgatctatatat1680aataatgggtttaataatactatacctagttcctcctttagttctttacctttcacatgt1740gaccagtttcttgatttgatatgttggtcatagaaacgtttccaaaacagctctcacaac1800actagccaatgcatagttttatgttcatcatccttttctctctctttttaagctactaca1860tccagcttttcttatgtcttatttaagcatggattcttttaaataagatagaaacagctg1920ataatttgcttacaaataaataaatatcccctgccaacacttgtcttaacacaatatata1980ccaacagaaccgagcagacacttgaaaatttgtccttgcacgtttgttgactcttcaagt2040agtgatgaaagcaaatatccgacaggcaccaccacgcctcaaaccgaaaatcagcaacct2100atctagctgttgtccagtgtacattaccatgcatgtctgtgcatttccacactcaactac2160tcctttcccccatgtcaatcagcatctgaggcgctctactgaaggtagctccacgttgta2220gtagagaaccggccgctagatctcttggcccatctcatgtgctcgatcgcactcgtccac2280acatgtatatatgcaaagcgctagctgtatccaatcagtaggcgcattggcctctgtctt2340ttagaagctaggatgaattgagcacgagcaaggactctgtagtgtgttggagcatccatg2400catacgacgcatgcgtcgtcgtctgcatgcgtgtctctctcgtcaagcctgtggtggcta2460gctagctagctaaggctgcatgccgcctacagatcatgacatgctagctagcttatttgg2520tccccgtgctactagctatcagctgggagtagcatgttaagcgctgatttttatggtgtt2580gcaccgtggcatgatatgcacccacagatgaggaccgagggtgtaggctttatgatttgc2640agaggtatggaaatgggactcattagtgtggaagtacttttgcttgattgtcattactga2700atgtatgtagtctgtcaatacgtacacagcgccatgtactgtgtatattgactgaaacgt2760acgttgcatcatatccagctcatctccaaatcagccaaatatttctttctctctctatat2820atatatcactgaaatgttgtccatgagatacatgcaaatagctagcttaccctttctttt2880gagctatcagtttcatagtatgcatgcctgttcttccactcccgcaatcataaatagtat2940gtaatatacattgcagctatatatgtttgttcaaaaacaaaatgcggtaagaatgactga3000gttattttcgttggcggaaagaaagcatttatgtttcttaacttcgtacagaaactccaa3060tggggtatcagactatatatttaccaaacgttagtgtacagaaactatcttaggccttgt3120ttggatactctcaaattcacctcaatctatgtgtactgatgtggattagagtgtaaatta3180gtttaagttatatctcaatacacgtcgattggggtgaacatgaaagtatctaaataaggc3240cttagtggcagtaggacgtaggttctgagcaaacgaagaagaccttttttaatctatttc3300tcatgaattgaaccacttcagtgc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