本發(fā)明涉及一種螺環(huán)化合物及其制備方法和應(yīng)用，屬于甾族化合物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

甾體類藥物廣泛用于醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域，具有多種藥理活性。雄烯二酮類衍生物屬于芳香酶抑制劑中的甾體類藥物，該類藥物與芳香化酶內(nèi)源性作用底物雄烯二酮和睪酮結(jié)構(gòu)相似，通過共價鍵形式與其不可逆結(jié)合，引起酶永久性的失活，從而抑制雌激素的合成，依西美坦、阿那曲唑等是目前主要的臨床用藥。依西美坦(ⅵ，exemestane)化學(xué)名為6-亞甲基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮，是由意大利公司pharmacia&upjoin研究開發(fā)的一種不可逆的芳香酶抑制劑，1999年首次在英國上市。其分子式為c20h24o2，結(jié)構(gòu)式如式ⅵ所示：

其依靠與甾體芳香酶自然底物—雄烯二酮的相似結(jié)構(gòu)，不可逆的結(jié)合其活性部位，使之永久滅活，從而使體內(nèi)激素水平迅速、持續(xù)地降低，以達(dá)到治療目的。us4808616報道了6-亞烷基-雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮衍生物的制備方法及其在藥物化學(xué)方面的應(yīng)用。cn101312743a公開了(s)-6-甲基氧雜烷基依西美坦化合物用于抑制癌細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞生長的方法。

可以預(yù)見，具有雄烯二酮類似結(jié)構(gòu)的化合物很可能具有藥理活性，進(jìn)一步研發(fā)新型有效的治療藥物具有重大的意義。

基于此，做出本申請。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有抗腫瘤技術(shù)中所存在的上述缺陷，本申請首先提供一種新的螺環(huán)化合物，該化合物作為雄烯二酮類的衍生物，具有抗腫瘤活性。

為實現(xiàn)上述目的，本申請采取的技術(shù)方案如下：

一種螺環(huán)化合物，該螺環(huán)化合物為雄烯二酮衍生物及其水合物、前藥以及藥學(xué)上可接受的鹽，其結(jié)構(gòu)式為：

為方便下文描述，將其記作ⅰ。

體外抗腫瘤試驗表明：該螺環(huán)化合物具有明顯的抑制腫瘤的效果。試驗所用的細(xì)胞株為國際通用的腫瘤細(xì)胞株—人肝癌細(xì)胞hepg2，人卵巢癌細(xì)胞sk-ov-3。

同時，本申請還提供了一種前述螺環(huán)化合物的制備方法，將6-(n-甲基-n-苯基)-胺甲基-4-烯-3,17-雄甾二酮(iv)溶解后，滴加到濃鹽酸中，在低于15℃下反應(yīng)2小時，然后過濾得到粗品，粗品可通過柱層析等方法提純得到精品螺環(huán)化合物(ⅰ)。

上述反應(yīng)過程可表示為：

進(jìn)一步的，作為優(yōu)選：

所述的溶劑為乙醇，反應(yīng)中所用的乙醇量為1500-2000毫升/mol6-(n-甲基-n-苯基)-胺甲基-4-烯-3,17-雄甾二酮。更優(yōu)選的，所述的乙醇量為1600-1800毫升/mol6-(n-甲基-n-苯基)-胺甲基-4-烯-3,17-雄甾二酮。

所述的濃鹽酸濃度≥20％，優(yōu)選的，所述的濃鹽酸濃度為36％，工業(yè)品。

所述的濃鹽酸用量為500-1000ml/mol6-(n-甲基-n-苯基)-胺甲基-4-烯-3,17-雄甾二酮，優(yōu)選的，所述的濃鹽酸用量為600-700毫升/mol6-(n-甲基-n-苯基)-胺甲基-4-烯-3,17-雄甾二酮。

所述的滴加時溫度為0-20℃，反應(yīng)溫度為0-20℃，更優(yōu)選的，所述的滴加溫度為5-15℃，反應(yīng)溫度為5-15℃；滴完后反應(yīng)時間為1-3小時，更優(yōu)選的，所述的滴加后反應(yīng)時間為2-3h。

本申請所提供的螺環(huán)化合物具有明顯的抑制腫瘤的效果，實驗方法采用國際通用的mtt法進(jìn)行。

本申請還提供了一種藥物組合物，包括作為活性成分的螺環(huán)化合物和/或其水合物、前藥以及藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。上述螺環(huán)化合物配以藥用輔料以及藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的載體，以常規(guī)的制備工藝制備成藥劑學(xué)上的任何一種劑型。

本發(fā)明化合物具有較強(qiáng)的抑制癌細(xì)胞的能力，為研制新的抗腫瘤藥物提供了先導(dǎo)化合物，具有重要意義。

附圖說明

圖1為本申請的實施例1制備條件下的產(chǎn)物液質(zhì)聯(lián)用圖；

圖2為本申請實施例1制備條件下產(chǎn)物的核磁圖(氫譜)；

圖3為本申請實施例1制備條件下產(chǎn)物的核磁圖(碳譜)；

圖4為本申請實施例1制備條件下產(chǎn)物的核磁圖(碳譜，局部放大)；

圖5為本申請實施例1制備條件下產(chǎn)物的核磁圖(dept135)；

圖6為本申請實施例1制備條件下產(chǎn)物的核磁圖(dept135，局部放大)。

具體實施方式

實施例中使用的分析儀器與設(shè)備：液質(zhì)聯(lián)用，thermolcq-fleet，柱子：hypersilgold150*2.1，電噴霧電離源(esi)；核磁共振儀，avancedmxⅱⅰ400m(tms內(nèi)標(biāo)，bruker公司)；高效液相色譜儀：agilenttechnologies1200series；紅外光譜儀，nicolet360ft-ir(美國尼高力儀器公司)。

本實施例中，原料6-(n-甲基-n-苯基)-胺甲基-4-烯-3,17-雄甾二酮(iv)的制備方法可以參照曹瑞偉等人的專利(cn105017370)，其反應(yīng)合成過程可描述如下：

實施例1：螺環(huán)化合物ⅰ的制備

將40.7克化合物iv(0.1摩爾)溶解在170毫升乙醇中，于0-5℃下滴加到80毫升36％濃鹽酸中，滴完后在5-10℃反應(yīng)2小時，過濾得到土黃色固體，烘干后23.5克，收率78.9％。粗品可通過柱層析(流動相：乙酸乙酯：石油醚＝1：3)等方法提純得到精品，提純后為黃色固體，熔點180-183℃。

產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征：

ms：596

¹³cnmr(δ,ppm,100mhz,cdcl3)：

220.66，220.26(c17，c17’)；199.86，196.15(c1’，c1)；182.12，166.60(c3’，c3)；137.41，122.68(c2，c2’)；

55.25(ch，c10’)；50.98(ch，c10)；50.41(ch，c14’)；48.47(ch，c14)；47.50，47.33(ch0，c13,13’)。

42.74(ch0，c7’，螺環(huán)碳)：

40.22(ch0，c4)；38.59(ch0，c4’)；38.31(ch2)；37.48(ch2)；36.22(ch2)；35.78(兩個ch2，c5,5’)；35.34(ch)；34.75(ch2)；34.32，34.27(兩個ch2，c16,16’)；33.65(一個ch和一個ch2疊加，c6’)；31.23(ch2，c12’)；31.10(ch2，c12)；30.27(ch)；24.82(ch2)；22.25(ch3，c18’)；21.73，21.66(兩個ch2，c15,15’)；20.40，20.33(兩個ch2，c11,11’)；18.22(ch3，c18)；13.71(兩個ch3，c19,19’)。

實施例2：不同條件下的反應(yīng)制備式(i)所示螺環(huán)化合物

將40.7克化合物iv(0.1摩爾)溶解在一定量乙醇中，于一定溫度下滴加到一定量的36％濃鹽酸中，滴完后一定溫度范圍內(nèi)反應(yīng)一定時間，過濾得到產(chǎn)物，烘干后稱重，計算產(chǎn)率，結(jié)果如表1。

表1不同制備條件下的產(chǎn)物收率

上述實施例2中各序號所對應(yīng)條件下所得到的產(chǎn)品核磁數(shù)據(jù)與實施例1相同。

對上述表1的收率、物料比、合成條件進(jìn)行綜合考量，結(jié)論如下：

(1)乙醇添加量的影響：本申請中，乙醇作為溶劑，將直接影響產(chǎn)品的反應(yīng)效率和反應(yīng)速率。相同條件下，對乙醇添加量進(jìn)行測試，結(jié)果表明，當(dāng)乙醇添加量低于1500ml/mol原料(化合物iv，即：6-(n-甲基-n-苯基)-胺甲基-4-烯-3,17-雄甾二酮，下同)，由于有機(jī)溶劑量過低，導(dǎo)致反應(yīng)體系中有機(jī)物的溶解不充分，無法滿足反應(yīng)的需求，因而收率低于30％(具體參見表1中序號1-2)；隨著乙醇添加量的增加，當(dāng)其添加量超過1500ml/mol原料時，反應(yīng)逐漸趨于充分，尤其是當(dāng)乙醇添加量介于1500-2000ml/mol原料，特別是在1600-1800ml/mol原料時，由于原料可以實現(xiàn)充分溶解，因此反應(yīng)得以充分進(jìn)行，產(chǎn)物的穩(wěn)定性也逐漸增加，產(chǎn)品品質(zhì)良好，收率可到達(dá)56％以上(具體參見表1中序號3-14)；繼續(xù)增加乙醇的添加量，雖然確保了原料的完全溶解，但當(dāng)乙醇添加量大于2000ml/mol原料時，由于體系濃度較低，導(dǎo)致收率反而下降(具體參見表1中序號15-16)。因此，乙醇添加量適宜控制在1500-2000ml/mol原料，尤其是當(dāng)乙醇添加量控制在1600-1800ml/mol原料時，反應(yīng)效率最佳。

(2)濃鹽酸添加量的影響：反應(yīng)過程中，濃鹽酸是反應(yīng)原料之一，相同條件下，對濃鹽酸添加量進(jìn)行測試，結(jié)果表明，當(dāng)濃鹽酸添加量低于500ml/mol原料(化合物iv，即：6-(n-甲基-n-苯基)-胺甲基-4-烯-3,17-雄甾二酮，下同)，由于酸量不夠，導(dǎo)致反應(yīng)不充分，因而收率低于40％(具體參見表1中序號17)；隨著濃鹽酸添加量的增加，當(dāng)其添加量超過500ml/mol原料時，反應(yīng)逐漸趨于充分，尤其是當(dāng)濃鹽酸添加量介于600-800ml/mol原料時，收率較好％(具體參見表1中序號18-22)；繼續(xù)增加濃鹽酸的添加量，雖然酸量得到滿足，但由于體系總體積增大，原料濃度降低，導(dǎo)致收率下降(具體參見表1中序號23-24)。因此，濃鹽酸添加量適宜控制在500-1000ml/mol原料，尤其是當(dāng)濃鹽酸添加量控制在600-800ml/mol原料時，反應(yīng)效率最佳。

(3)滴定溫度和反應(yīng)溫度的影響：反應(yīng)過程中，滴定溫度影響了選擇性，反應(yīng)溫度則會對反應(yīng)活性造成影響。相同條件下，對滴定溫度和反應(yīng)溫度進(jìn)行測試，結(jié)果表明，當(dāng)?shù)味囟鹊陀?℃時，由于溫度過低，導(dǎo)致反應(yīng)緩慢，因而收率低于40％(具體參見表1中序號25-28)；隨著滴定溫度的增加，當(dāng)其超過0℃時，反應(yīng)逐漸趨于穩(wěn)定，尤其是當(dāng)?shù)味囟冉橛?-15℃時，收率較穩(wěn)定(具體參見表1中序號29-35)；繼續(xù)提高滴定溫度，高于20℃時雜質(zhì)增多，收率降低(具體參見表1中序號36-39)。

同時通過表1中的平行實驗還可以看出，為方便實驗條件的控制，適宜將反應(yīng)溫度與滴定溫度相同，滴定溫度適宜控制在0-20℃，反應(yīng)溫度適宜控制在0-20℃，尤其是當(dāng)?shù)味囟冗m宜控制在5-15℃、反應(yīng)溫度適宜控制在5-15℃時，反應(yīng)效果最佳。

(4)反應(yīng)時間的影響：反應(yīng)時間是反應(yīng)充分與否的一個關(guān)鍵因素。相同條件下，對反應(yīng)時間進(jìn)行測試，結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)時間低于1h時，反應(yīng)不完全，收率較低(具體參見表1中序號40)；隨著反應(yīng)時間的增加，當(dāng)其超過1h時，反應(yīng)逐漸趨于充分，尤其是當(dāng)反應(yīng)時間介于1.5-3h時，收率較穩(wěn)定(具體參見表1中序號41-44)；繼續(xù)延長反應(yīng)時間，收率并不增加，結(jié)果并不理想(具體參見表1中序號45-46)

實施例3：鹽酸濃度對成品的影響

將40.7克化合物iv(0.1摩爾)溶解在170ml乙醇中，于10℃下滴加到60ml不同質(zhì)量濃度的濃鹽酸中，滴完后在10℃內(nèi)反應(yīng)2h，過濾得到產(chǎn)物，烘干后稱重，對成品進(jìn)行測試，結(jié)果如表2。

表2不同濃度濃鹽酸對產(chǎn)物的影響

從表2可以看出，相同制備條件下，濃度≥20％時，制備得到成品螺環(huán)化合物，然而，對于濃度低于35％，尤其是當(dāng)濃度在20-35％之間時，由于酸度不足，酸量不夠的原因，導(dǎo)致收率較低；濃度高于37℃時，雖然收率較好，但考慮到來源困難，較難實現(xiàn)；而工業(yè)品鹽酸濃度為36％左右，來源方便，價廉，且鹽酸濃度介于35-37％時，尤其是當(dāng)鹽酸濃度為36％時，產(chǎn)品的各項指標(biāo)達(dá)到最佳。

實施例4：螺環(huán)化合物的應(yīng)用

體外抗腫瘤活性測定實驗：

實驗采用國際通用的mtt法進(jìn)行，對螺環(huán)化合物ⅰ進(jìn)行體外腫瘤細(xì)胞抑制活性實驗：首先，在96孔細(xì)胞板上接種2×10⁴個對數(shù)生長期的人肝癌細(xì)胞hepg2或人卵巢癌細(xì)胞sk-ov-3，5個復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后，再加入不同濃度待測樣品，共設(shè)置7個藥物濃度梯度(單位ug/ml)，濃度分別為：1.0，5.0，10，20，30，40和50的化合物ⅰ樣品組；72小時后，于96孔板對應(yīng)孔中加入5mg/ml的mtt溶液20ul，繼續(xù)培養(yǎng)3小時，棄去孔板中上清液，加入150ul的dmso溶解，使用酶標(biāo)儀檢測490nm波長下的吸光值并計算待測樣品對細(xì)胞生長的半數(shù)抑制濃度ic50。實驗結(jié)果表明，該化合物對兩種腫瘤細(xì)胞株均有明顯的抑制作用，為研制新的抗腫瘤藥物提供了先導(dǎo)化合物，具有重要意義。

人肝癌細(xì)胞hepg2的ic50為11.45ug/ml；人卵巢癌細(xì)胞sk-ov-3的ic50為18.65ug/ml。

上述結(jié)果表明：螺環(huán)化合物ⅰ對這兩種人腫瘤細(xì)胞株具有抑制作用。

以上內(nèi)容是結(jié)合本發(fā)明創(chuàng)造的優(yōu)選實施方式對所提供技術(shù)方案所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明創(chuàng)造具體實施只局限于上述這些說明，對于本發(fā)明創(chuàng)造所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍。