本申請是pct申請?zhí)枮閜ct/ep2009/004112，中國國家階段申請?zhí)枮?00980159755.3的發(fā)明專利申請的分案申請。原申請的發(fā)明名稱為“hmo合成”，申請日為2009年6月8日。本發(fā)明涉及穩(wěn)定地培養(yǎng)于培養(yǎng)基中的適應(yīng)于制備寡糖的細(xì)胞，轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞使其包含至少一個編碼參與寡糖合成的酶的核酸序列。例如從dumon等(2001)已知這種細(xì)胞。長時間來已知人母乳，除乳糖外，還包含被稱為人乳寡糖(hmo)的寡糖的復(fù)雜混合物。就組成和量而言此人母乳的寡糖部分是獨(dú)特的。與其他哺乳動物形成對比，人母乳包含7～12g/l的寡糖濃度，其比在大多數(shù)其他哺乳動物中高10～100倍(boehm和stahl，2007，kunz等，2000，newburg和neubauer，1995)?，F(xiàn)在，屬于hmo的超過80種化合物已經(jīng)在結(jié)構(gòu)上被表征。通常，與在人體中發(fā)現(xiàn)的其他寡糖不同，hmo的特征在于，在還原末端的乳糖結(jié)構(gòu)部分，和在非還原末端的巖藻糖和/或唾液酸。區(qū)分有兩種基本類型：i型結(jié)構(gòu)的寡糖具有與glcnac進(jìn)行α1，4-連接的巖藻糖，而ii型結(jié)構(gòu)的寡糖顯示glcnac或葡萄糖的α1，3位巖藻糖基化；任何一種類型可以包含與半乳糖進(jìn)行α1，2-連接的巖藻糖。最重要的寡糖是2′-巖藻糖基乳糖和3-巖藻糖基乳糖。這些結(jié)構(gòu)與上皮細(xì)胞表面復(fù)合糖的表位、lewis組織-血型抗原諸如lewisx(lex)(gal(β1-4)[fuc-(α1-3)]glcnac(β1))密切相關(guān)(newburg，2001)。hmo與上皮表位的結(jié)構(gòu)同源性解釋了防御細(xì)菌性病原體的性質(zhì)。例如，通過使病原體與hmo而非與人黏膜表面聚糖結(jié)合能夠顯著減小致病大腸桿菌(escherichiacoli)(cravioto等，1991)、霍亂弧菌(vibriocholerae)(coppa等，2006)、肺炎鏈球菌(streptococcuspneumoniae)(andersson等，1986)或空腸彎曲桿菌(campylobacterjejuni)(ruiz-palacios等，2003)的毒力，并且與毒素如大腸桿菌(e.coli)的熱穩(wěn)定腸毒素的結(jié)合也是如此(crane等，1994)。除了所提及的在腸道中的局部作用，hmo通過進(jìn)入全身循環(huán)，還能夠在嬰兒中誘發(fā)全身作用(gnoth等，2001)。hmo對蛋白-碳水化合物相互作用，例如選擇蛋白-白細(xì)胞結(jié)合的影響能夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)并且減小炎性反應(yīng)(bode，2006，kunz和rudloff，2006)。為降低新生兒獲得感染的頻率并且，因此，以及嬰兒死亡率，當(dāng)然非常需要廣泛地給嬰兒提供包括hmo的營養(yǎng)物。這在其中普遍并且廣泛實(shí)行母乳喂養(yǎng)的社會中可能是容易實(shí)現(xiàn)的。但是一般都不是這樣。存在若干醫(yī)學(xué)原因，比如可能的傳染性疾病的母嬰傳播，所述原因在特定情況下反對母乳喂養(yǎng)。在很多非洲國家，例如，母乳喂養(yǎng)可能是在嬰兒期期間感染hiv的主要原因。同樣地，文化情況可能導(dǎo)致拒絕母乳喂養(yǎng)，如在主要工業(yè)國家像，例如，美國就是這樣。由于hmo在天然源諸如其他哺乳動物的乳汁中只能以低濃度存在，所以從天然源提取寡糖不適于滿足對hmo的需要。寡糖的化學(xué)合成是費(fèi)力的并且需要多個保護(hù)和脫保護(hù)步驟(kretzschmar和stahl，1998)，因此通常相對昂貴并且具有低的回收率。因此，利用生物技術(shù)工程生物體發(fā)酵制備寡糖對于大規(guī)模的hmo合成是有前途的可選解決方案。在過去的十年中，若干合成hmo的成功嘗試已被發(fā)表，所述嘗試使用重組大腸桿菌發(fā)酵或使用體外酶轉(zhuǎn)化。這些嘗試主要集中在合成屬于hmo或與hmo十分相似的巖藻糖基化的化合物。例如，若干出版物描述了以下各項(xiàng)的合成：lewis結(jié)構(gòu)乳-n-新巖藻戊糖(lacto-n-neofucopentaose)、乳-n-新二巖藻己糖(lacto-n-neodifucohexaose)和乳-n-新二巖藻辛糖(lacto-n-neodifucooctaose)，以及2′-和3-巖藻糖基乳糖(fucosyllactose)(albermann等，2001，dumon等，2006，dumon等，2001，dumon等，2004，koizumi等，2000)。在這些情況中，離析物像例如乳糖的酶巖藻糖基化通過巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(fucts)來進(jìn)行。報(bào)道巖藻糖基化的化合物制備的多數(shù)出版物就此描述了源自幽門螺桿菌(helicobacterpylori)的fucts的使用。一般，人fucts也能夠用于此目的。然而，當(dāng)在細(xì)菌細(xì)胞中超表達(dá)時，來源于細(xì)菌的fucts一般較少地傾向于產(chǎn)生諸如錯折疊和不溶性的問題。此外，多數(shù)公布的用于合成巖藻糖基化的化合物的系統(tǒng)依賴大腸桿菌的內(nèi)源gdp-巖藻糖庫，所述庫通常用于合成包含巖藻糖的外泌多糖可拉酸(colonicacid)(grant等，1970)。在這些情況中，gdp-巖藻糖的可用性當(dāng)然是瓶頸，其限制了合成效率。最近，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)描述了利用fkp酶的新的整細(xì)胞制備方法(parkot等，2008)，此專利申請的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合于此。fkp(coyne等，2005)，來源自脆弱擬桿菌(bacteroidesfragilis)，是具有雙重功能的酶，其擁有巖藻糖激酶和l-巖藻糖-1-p-鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶兩種活性。因此，外源供給的巖藻糖首先被磷酸化然后被核苷酸激活從而形成重要的前體分子gdp-巖藻糖?；趂kp的l-巖藻糖補(bǔ)救途徑已經(jīng)被成功地用于合成巖藻糖基化的寡糖(parkot等，2008)。雖然，在如此的生化合成的水平上，已經(jīng)發(fā)展出重要策略，但是已知的用于體內(nèi)寡糖合成的方法都具有一定的不足，其抑制，至多，寡糖的大規(guī)模制備。在細(xì)胞中高速制備寡糖的實(shí)際難點(diǎn)一方面是細(xì)胞內(nèi)大量富集制備的寡糖和核苷酸副產(chǎn)品，而另一方面是制備的寡糖的提取。由于細(xì)胞內(nèi)富集，所述合成反應(yīng)的產(chǎn)物會逐漸形成對合成酶的產(chǎn)物抑制作用。因此在某一點(diǎn)，所述合成變得無效率的慢。此外，所述產(chǎn)物可能達(dá)到細(xì)胞毒性濃度以驅(qū)使細(xì)胞裂解或至少代謝受阻。在任何情況中，寡糖的連續(xù)細(xì)胞內(nèi)制備是不可能的。此外，能夠預(yù)期過量的寡糖累積將最終導(dǎo)致細(xì)胞裂解和細(xì)胞死亡。此細(xì)胞裂解或之后進(jìn)行的用于從所述細(xì)胞提取合成的寡糖的細(xì)胞裂解將產(chǎn)生目標(biāo)寡糖和細(xì)胞組分(代謝產(chǎn)物、碎片)的復(fù)雜混合物。從此復(fù)雜混合物中純化目標(biāo)寡糖成本昂貴并且因此對于大多數(shù)寡糖來說是不經(jīng)濟(jì)的。在這些條件下，生物技術(shù)寡糖制備是低效并且難以控制的，尤其因?yàn)橐阎纳锛夹g(shù)寡糖制備使用分批培養(yǎng)來進(jìn)行，從經(jīng)濟(jì)角度，這種分批培養(yǎng)是很不令人滿意的?？紤]到以上，本發(fā)明的目標(biāo)是以這樣的方式改進(jìn)生物技術(shù)制備寡糖的方法以致所述制備變得容易和更可控，并且寡糖的產(chǎn)量總的來說得到提高。根據(jù)本發(fā)明，此目標(biāo)和其他目標(biāo)通過提供最初提到的類型的細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)，此外轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞使其包含至少一個編碼糖流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(sugareffluxtransporterfamily)蛋白、其功能同系物或衍生物的核酸序列。本發(fā)明的目標(biāo)因此完全實(shí)現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明，理解寡糖是單糖的短的聚合物，其包含至少2個糖亞基。所述寡糖可以是亞基的支鏈或形成亞基的直鏈。此外，所述寡糖的糖亞基的特征可以是許多化學(xué)修飾。因此，根據(jù)本發(fā)明的寡糖可以包含一個或多個非糖結(jié)構(gòu)部分。根據(jù)本發(fā)明，核酸序列描述遺傳密碼，其由核酸聚合物像例如脫氧核糖核酸聚合物或核糖核酸聚合物代表。遺傳密碼因此可以包括包含蛋白形成信息的編碼序列，或非編碼區(qū)域，所述非編碼區(qū)域包括例如啟動子區(qū)域、用于結(jié)合調(diào)節(jié)或輔助化合物的區(qū)域、間隔區(qū)和影響所述核酸聚合物自身的二級或三級結(jié)構(gòu)和/或參與其加工的結(jié)構(gòu)序列。根據(jù)本發(fā)明，“轉(zhuǎn)化...以使其包含”涉及向細(xì)胞中插入至少一個另外的核酸序列的任何方法，其后所述核酸序列作為質(zhì)粒出現(xiàn)在所述細(xì)胞中或被整合到所述細(xì)胞的染色體中。已知的轉(zhuǎn)化方法包括例如化學(xué)轉(zhuǎn)化或電穿孔。通過將至少一個另外的核酸序列的染色體整合，即使在沒有選擇劑的情況下，通常能夠獲得穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)移。為了該目的，可以用病毒或噬菌體感染所述細(xì)胞。備選地，可以應(yīng)用使用例如基于病毒或轉(zhuǎn)座子的系統(tǒng)的同源和非同源重組的其他方式。對于生物技術(shù)應(yīng)用，從細(xì)胞輸出較大的寡糖是復(fù)雜的問題。這是主要的情況，因?yàn)橹昏b定出了很少的涉及這種運(yùn)輸?shù)募?xì)胞機(jī)制。從細(xì)胞輸出寡糖很少發(fā)生的原因在于寡糖合成消耗大量的細(xì)胞資源。因此這些化合物的損失對于細(xì)胞來說通常是不利的。此外，寡糖輸出的大部分已知機(jī)制涉及寡糖的化學(xué)修飾，例如通過使它們與脂質(zhì)-結(jié)構(gòu)部分相連(alaimo等，2006)。從而，寡糖不僅以膜運(yùn)載，這抑制它們釋放到培養(yǎng)基中，而且與脂質(zhì)-結(jié)構(gòu)部分化學(xué)連接，這降低了它們在水性介質(zhì)中的溶解度。因此，這樣的機(jī)制幾乎不適于在大規(guī)模制備寡糖中使用。由liu和同事首先描述(liu等，1999a)的大腸桿菌的糖流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(set)家族包括蛋白seta、setb和setc。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的同源物(氨基酸同一性>50％)主要在腸桿菌科(enterobacteriaceae)中被發(fā)現(xiàn)(liu等，1999a)。除葡萄糖和乳糖外，set輸出蛋白(exporterprotein)顯示出對以下物質(zhì)的底物特異性：特定單糖和二糖以及，例如，誘導(dǎo)物分子異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)和有毒的糖類似物o-硝基苯基-β-d-硫代半乳糖苷(onpg)(liu等，1999b)。然而生化研究顯示，例如，seta對較大的或較龐大的分子諸如庚糖或三糖顯示非常低至零轉(zhuǎn)運(yùn)活性。由于以上原因，不能預(yù)期set家族的輸出蛋白將絲毫適于轉(zhuǎn)運(yùn)寡糖。然而，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，令人驚奇地，set輸出蛋白的超表達(dá)導(dǎo)致非常有效的寡糖輸出。此外，set蛋白已經(jīng)顯示輸出乳糖(所述合成反應(yīng)的離析物之一)。因此預(yù)期，在經(jīng)修飾的細(xì)胞中獲得的寡糖的合成將非常低效并且緩慢地進(jìn)行，這歸因于離析物持續(xù)地從所述細(xì)胞中排出。相反，本發(fā)明人已經(jīng)能夠首次顯示，縱使set輸出蛋白超表達(dá)，在經(jīng)修飾的細(xì)胞中獲得的寡糖的合成也具有高的生產(chǎn)率。通常，優(yōu)選地，所述細(xì)胞選自由以下各項(xiàng)組成的組：細(xì)菌、真菌、動物和植物細(xì)胞。因此特別優(yōu)選地，所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。由此優(yōu)勢是大腸桿菌細(xì)胞提供高的代謝活性和高的繁殖率。此外，大腸桿菌是一種得到最好表征的用于分子生物學(xué)和生物技術(shù)用途的生物體。本領(lǐng)域中已知的用于轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)細(xì)菌的眾多技術(shù)尤其適用于大腸桿菌。此外，在市場上可以買到具有多種遺傳背景的大腸桿菌菌株。此外，優(yōu)選地，所述酶選自包含以下各項(xiàng)的組：糖基轉(zhuǎn)移酶、leloir類糖基轉(zhuǎn)移酶、非leloir糖基轉(zhuǎn)移酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶。根據(jù)一個實(shí)施方案，所述酶是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。此外，優(yōu)選地，所述糖流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是seta或其衍生物。在此情況中的優(yōu)勢是，在輸出蛋白的set家族的經(jīng)生化表征的成員中，seta以具有最廣的底物特異性為特征。因此，使用seta能夠至少潛在地輸出并因此制備最廣泛多樣的寡糖。同樣優(yōu)選地，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞使其包含至少一個編碼推動或促進(jìn)寡糖合成所需離析物的輸入的蛋白的核酸序列。因此，有優(yōu)勢的是，細(xì)胞內(nèi)的離析物濃度增加。在正常條件下，離析物諸如巖藻糖或乳糖的輸入受限于相應(yīng)輸入蛋白(importerprotein)的可用性。然而，在適應(yīng)于大規(guī)模合成寡糖的細(xì)胞的情況中，離析物的輸入，其依賴于輸入蛋白的內(nèi)源水平，可能不足以連續(xù)地給所述合成反應(yīng)提供離析物。可以通過超表達(dá)各自的輸入蛋白來解決此問題。在此情況中相關(guān)的輸入蛋白主要是單糖或二糖的輸入蛋白諸如乳糖輸入蛋白，例如大腸桿菌β-半乳糖苷通透酶(lacy)或巖藻糖輸入蛋白，例如大腸桿菌巖藻糖通透酶(fucp)，但是也可以包括核苷酸和其他離析物的輸入蛋白。尤其優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞使其包含至少一個編碼選自由以下各項(xiàng)組成的組的蛋白的核酸序列：乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、唾液酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、n-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、n-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、abc轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、核苷酸激活糖的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及核堿基(nucleobase)、核苷或核苷酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。就此而論，核苷酸激活糖可以是，但不限于：gdp-巖藻糖、cmp-唾液酸、udp-半乳糖、udp-葡萄糖、gdp-甘露糖、udp-葡糖胺或udp-半乳糖胺。此外，術(shù)語核堿基是指鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核苷是指鳥苷、胞苷、腺苷、胸苷和尿苷，而核苷酸可以是鳥苷、胞苷、腺苷、胸苷或尿苷的單磷酸、二磷酸或三磷酸酯。此外，優(yōu)選地，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞使其包含至少一個核酸序列，所述核酸序列編碼選自由以下各項(xiàng)組成的組的蛋白：核苷酸基轉(zhuǎn)移酶、鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶、尿苷?；D(zhuǎn)移酶(uridylyltransferase)、fkp、l-巖藻糖激酶、巖藻糖-1-磷酸鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶、cmp-唾液酸合成酶、半乳糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷?；D(zhuǎn)移酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷?；D(zhuǎn)移酶、甘露糖激酶、甘露糖-1-磷酸鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶、gdp-4-酮-6-脫氧-d-甘露糖還原酶、葡糖胺激酶、葡糖胺-磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶、n-乙酰-葡糖胺-磷酸尿苷?；D(zhuǎn)移酶、udp-n-乙酰葡糖胺4-差向異構(gòu)酶、udp-n-乙酰葡糖胺2-差向異構(gòu)酶。就此而論，術(shù)語核苷酸基轉(zhuǎn)移酶通常涉及能夠?qū)⒑塑账徂D(zhuǎn)移到糖磷酸(phosphosugar)上的酶，不管它是天然存在的糖還是非天然的糖。由此優(yōu)勢是，如在通過引用包含于此的parkot等，2008中所同樣描述的，細(xì)胞內(nèi)核苷酸激活糖像gdp-巖藻糖的庫可以得到補(bǔ)充。因此，使寡糖合成更有效。此外，通常優(yōu)選地，合成寡糖所涉及和/或需要的所選擇的單糖、二糖或寡糖的細(xì)胞分解代謝通路至少部分失活。此處，優(yōu)勢在于總的合成效率能夠增加的事實(shí)。這是因?yàn)楦俚闹付ㄓ糜诠烟呛铣傻碾x析物被細(xì)胞的內(nèi)源代謝所消耗的情形。在以下描述的實(shí)施方案中，例如，使用乳糖降解缺陷型細(xì)胞。這能夠通過使由lacz基因編碼的β-半乳糖苷酶失活來獲得。此遺傳修飾防止細(xì)胞內(nèi)的乳糖裂解為可快速代謝的單糖葡萄糖和半乳糖。因此，作為隨后的糖基化/巖藻糖基化反應(yīng)的受體分子，乳糖以較高的濃度存在。在備選實(shí)施方案中，用于寡糖合成的細(xì)胞是，只是或除上述lacz缺陷型外還是，l-巖藻糖降解缺陷型的。這可以通過使fuca基因失活來獲得，所述fuca基因編碼巖藻糖降解通路的關(guān)鍵的分解代謝酶巖藻糖(fuculose)-1-磷酸醛縮酶(fuca)。當(dāng)然，還有從酶抑制劑到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的rnai構(gòu)建體的其他可用技術(shù)，可以使用所述技術(shù)以使分解代謝通路至少部分失活。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，通常優(yōu)選地，所述寡糖包含至少三個亞基和/或以具有至少大約480g/mol的分子量為特征。所有主要的重要的hmo的分子量在此閾值之上。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于制備寡糖的方法，所述方法包括以下步驟：a)提供根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞，b)在允許制備所述寡糖的條件下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞，c)從所述培養(yǎng)基中提取所述寡糖。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，允許的條件被理解為是涉及物理或化學(xué)參數(shù)包括但不限于溫度、ph、壓力、滲透壓和產(chǎn)物/離析物濃度的條件。在具體的實(shí)施方案中，所述允許的條件可以包括30+/-20℃的溫度范圍、7+/-3的ph范圍。上述方法具有的優(yōu)勢是：寡糖能夠直接從所述培養(yǎng)基中提取，而已知方法需要裂解所述細(xì)胞以及隨后從得到的裂解液中提取寡糖。就此而論，優(yōu)選地，使用連續(xù)流式生物反應(yīng)器來進(jìn)行步驟b)。優(yōu)勢在于，使用連續(xù)流式生物反應(yīng)器，能夠容易地提高制備的寡糖量。這是因?yàn)樗龊铣梢韵鄬Ω叩乃竭B續(xù)發(fā)生的情形。同樣優(yōu)選地，步驟b)中的培養(yǎng)基包含一種或多種選自由以下各項(xiàng)組成的組的物質(zhì)：支持細(xì)胞生長和繁殖的基礎(chǔ)補(bǔ)充劑、選擇劑、基因活性的效應(yīng)物以及合成寡糖所需要的離析物。支持細(xì)胞生長和繁殖的典型補(bǔ)充劑是從現(xiàn)有技術(shù)廣為人知的并且在例如sambrook和russel，2001中得到描述。這種基礎(chǔ)補(bǔ)充劑解決培養(yǎng)的細(xì)胞的一般營養(yǎng)需要，其包含例如蛋白、碳水化合物、脂質(zhì)和礦物質(zhì)。同樣地，選擇劑像抗生素是從現(xiàn)有技術(shù)例如sambrook和russel，2001廣為人知的?？梢允褂眠@樣的藥劑以便使遺傳修飾的細(xì)胞的培養(yǎng)免受競爭性生物體諸如真菌或細(xì)菌的持續(xù)污染。此外，例如在細(xì)菌群落中，可以使用選擇劑以便穩(wěn)定包含在質(zhì)粒上的遺傳信息?？梢允褂没蚧钚缘男?yīng)物以在細(xì)胞內(nèi)選擇性地誘導(dǎo)或抑制某些基因或基因的組的活性。這樣的效應(yīng)物在從簡單的化學(xué)化合物諸如異丙基-1-硫代-β-d-吡喃半乳糖苷(iptg)到更復(fù)雜的化合物像激素的范圍內(nèi)。這樣的基因活性的效應(yīng)物是從現(xiàn)有技術(shù)例如從sambrook和russel，2001廣為人知。此外，優(yōu)選地，所述離析物選自由以下各項(xiàng)組成的組：阿拉伯糖、蘇糖、赤蘚糖、核糖、核酮糖、木糖、葡萄糖、d-2-脫氧-2-氨基-葡萄糖、n-乙酰葡糖胺、葡糖胺、果糖、甘露糖、半乳糖、n-乙酰半乳糖胺、半乳糖胺、山梨糖、巖藻糖、n-乙酰神經(jīng)氨酸、糖苷、非天然糖、核堿基、核苷、核苷酸和其任何可能的二聚體或聚合物。通常優(yōu)選地，所述寡糖包含至少三個亞基和/或以具有至少大約480g/mol的分子量為特征。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，由上述方法制備的寡糖是巖藻糖基乳糖，在此情況中優(yōu)勢在于巖藻糖基乳糖是存在于hmo中的最主要的化合物中的一種。進(jìn)一步的優(yōu)勢從對實(shí)施方案和附圖的描述得出。不言而喻地，以上提及的特征和仍要在以下說明的特征不僅能夠用于分別指定的組合，還能夠用于其他組合或其自身，而不離開本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的若干實(shí)施方案圖示于附圖中并且在隨后的描述中得到更詳細(xì)說明。在附圖中：圖1顯示在根據(jù)本發(fā)明修飾的革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞中寡糖合成和轉(zhuǎn)運(yùn)的綜述示意圖；圖2顯示在細(xì)菌培養(yǎng)物的細(xì)胞潮濕團(tuán)塊和上清液中3-巖藻糖基乳糖的測量結(jié)果，其比較不同的基因型；以及圖3顯示在關(guān)于不同基因型的細(xì)菌培養(yǎng)物中合成的3-巖藻糖基乳糖的量之間的比較。實(shí)施例1：在革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的寡糖合成和轉(zhuǎn)運(yùn)圖1顯示革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞10的截面。根據(jù)本發(fā)明的革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞10包括外膜11、質(zhì)膜12、定位于所述外膜11和所述質(zhì)膜12之間的周質(zhì)間隙13、以及被所述質(zhì)膜12包圍在內(nèi)的細(xì)胞溶膠14。所述外膜包括孔蛋白，通過所述孔蛋白水溶性化合物能夠從培養(yǎng)基16進(jìn)入周質(zhì)間隙13并且反之亦然。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，所述質(zhì)膜包括起第一離析物-轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白17作用的fucp、起第二離析物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白18作用的lacy、和起產(chǎn)物輸出蛋白作用的seta。此外，起核苷酸基轉(zhuǎn)移酶20作用的fkp和起糖基轉(zhuǎn)移酶21作用的futaco包含在細(xì)胞溶膠14中。根據(jù)此實(shí)施方案，當(dāng)將作為第一離析物22的巖藻糖和作為第二離析物23的乳糖提供給培養(yǎng)基16時，他們通過孔蛋白15進(jìn)入周質(zhì)間隙13。然后，第一離析物22由第一離析物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白17轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞溶膠14中。在細(xì)胞溶膠中，第一離析物22由核苷酸基轉(zhuǎn)移酶20修飾，產(chǎn)生核苷酸基化的第一離析物24，即gdp-巖藻糖。第二離析物23由第二離析物輸入蛋白15輸入到細(xì)胞溶膠14中。然后糖基轉(zhuǎn)移酶21催化核苷酸基化的第一離析物，即gdp-巖藻糖和第二離析物，即乳糖之間的反應(yīng)，產(chǎn)生寡糖25，3-巖藻糖基乳糖，和gdp(未顯示)。之后，寡糖25由產(chǎn)物輸出蛋白19(seta)從細(xì)胞溶膠14輸出到周質(zhì)間隙13中并且能夠經(jīng)由孔蛋白15離開周質(zhì)間隙13，并進(jìn)入培養(yǎng)基16。實(shí)施例2：材料和方法2.1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和大腸桿菌菌株的開發(fā)使用大腸桿菌jm109(de3)(promega；www.promega.com)作為用于開發(fā)大腸桿菌生產(chǎn)菌株的初始宿主菌株。用于克隆步驟的所有寡核苷酸引物列表于表1中。構(gòu)建質(zhì)粒pacyc-lαcy和pacyc-lαcf-seta如下：使用引物lacyncoi正向/lacyecori反向和setandei正向/setaxhoi反向從大腸桿菌top10(invitrogen；www.invitrogen.com)的基因組dna擴(kuò)增基因lacy(相應(yīng)于genbank登錄號acb02461)(genbank；www.ncbi.nlm.nih.gov)和seta(相應(yīng)于genbank登錄號yp_025293)(genbank)。使pcr產(chǎn)物進(jìn)行使用指定的酶的限制性消化，并與相應(yīng)消化的表達(dá)載體pacycduet-1(novagen；www.merckbiosciences.co.uk)連接。通過限制性消化、瓊脂糖凝膠電泳以及使用引物pacycduetup1、duetdown-1-引物、duetup2-引物和t7-終止子-引物的測序來檢驗(yàn)所得的質(zhì)粒的基因的正確插入(數(shù)據(jù)未顯示)。所用的質(zhì)粒pcola-fkp-fucp和pet-futaco以前已經(jīng)被構(gòu)建(parkot等，2008)。為獲得菌株jm00、jm01和jm02，通過電穿孔將質(zhì)粒的不同組合引入大腸桿菌jm109(de3)(dower等，1988)。所有的質(zhì)粒和細(xì)菌菌株列表于表2中。2.2大腸桿菌中巖藻糖-分解代謝的失活：為防止外部提供的巖藻糖的降解，使編碼關(guān)鍵分解代謝酶l-巖藻糖-1-磷酸醛縮酶的fuca基因從大腸桿菌jm109(de3)的染色體中缺失。用于誘變過程的所有寡核苷酸引物列表于表1。為構(gòu)建fuca缺失型突變體，應(yīng)用datsenko和wanner的方法(datsenko和wanner，2000)，其使用引物fuca-敲除-f和fuca-敲除-r。通過pcr，使用位于染色體插入位點(diǎn)旁側(cè)的引物fuca-對照-f和fuca-對照-r來確認(rèn)fuca的正確缺失，并且通過將所述細(xì)菌涂板于m9基本瓊脂(minimalagar)上來證實(shí)巖藻糖-陰性表型(sambrook和russell，2001)，所述m9基本瓊脂補(bǔ)充巖藻糖作為唯一碳源(數(shù)據(jù)未顯示)。表1此研究中使用的引物*下劃線的是限制性核酸內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)。表2此研究中使用的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒apr，抗氨芐青霉素的；kmr，抗卡那霉素的；cmr，抗氯霉素的。2.3培養(yǎng)條件和細(xì)胞提取物的制備從過夜培養(yǎng)物中按1∶100將大腸桿菌菌株接種到100ml礦物培養(yǎng)基中(samain等，1999)，所述礦物培養(yǎng)基包含7.0gl-1nh4h2po4、7.0gl-1k2hpo4、1.0gl-1mgso4x7h2o、0.5gl-1檸檬酸、2.0gl-1koh、0.0045gl-1硫胺·hcl和7.5mll-1痕量礦物溶液。痕量礦物儲液包含70mm次氮基三乙酸酯(ph6.5)、7.5gl-1檸檬酸鐵、1.3gl-1mncl2x4h2o、0.21gl-1cocl2x6h2o、0.13gl-1cucl2x2h2o、0.25gl-1h3bo3、1.2gl-1znso4x7h2o和0.15gl-1na2moo4x2h2o。所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有0.1％葡萄糖和1％甘油作為碳源，并且補(bǔ)充有100μgml-1氨芐青霉素、50μgml-1卡那霉素和/或20μgml-1氯霉素，隨后在提供優(yōu)質(zhì)通風(fēng)的37℃旋轉(zhuǎn)搖床中溫育。當(dāng)所述培養(yǎng)物達(dá)到約1.0的光密度值(od600mn)時，以0.5mm的濃度添加誘導(dǎo)物異丙基-1-硫代-β-d-吡喃半乳糖苷(iptg)，并且在28℃在連續(xù)振蕩下過夜溫育所述培養(yǎng)物。在大約16個小時后，添加40mml-巖藻糖和20mm乳糖。然后繼續(xù)在28℃在連續(xù)振蕩下溫育所述培養(yǎng)物。在若干時間點(diǎn)，收集20ml所述培養(yǎng)物的樣品，并且通過離心捕獲細(xì)胞。分離培養(yǎng)物上清液并且立即通過高效陰離子交換層析(hpaec)分析或存儲于-20℃。用pbs洗滌細(xì)胞沉淀(pellet)(sambrook和russell，2001)，并將其重懸在5倍所述沉淀重量的蒸餾水中，并且通過煮沸10min來將其裂解。為獲得細(xì)胞內(nèi)級分，通過離心分離細(xì)胞碎片并且將清澈的細(xì)胞裂解液存儲于-20℃或立即通過hpaec分析。2.4sds-page通過sds-page來檢驗(yàn)異源蛋白的表達(dá)(sambrook和russell，2001)(數(shù)據(jù)未顯示)。在1xsds凝膠上樣緩沖液中制備蛋白提取物，并且用考馬斯亮藍(lán)來給聚丙烯酰胺凝膠染色。2.5通過高效陰離子交換層析-脈沖安培檢測法(hpaec-pad)檢測寡糖通過使用decadeii脈沖安培檢測器(pad)(antecleyden；www.antec-leyden.nl)和連接到hplc系統(tǒng)(shimadzu；www.shimadzu.eu)的carbopacpa20柱(dionex；www.dionex.com)的高效陰離子交換層析(hpaec)來分析樣品。所述檢測器靈敏度設(shè)為50μa，且應(yīng)用脈沖電壓是0.05-v。用10mm氫氧化鈉以0.4mlmin-1的流速洗脫單糖、二糖和寡糖。在用10mmnaoh等度洗脫30min后，用200mmnaoh洗滌柱20min以獲得恒定的保留時間，此后用10mmnaoh重建20min。對所有分析的樣品，將20μl1∶2dh2o稀釋的溶液用于hpaec分析。經(jīng)由hpaec-pad的分析顯示在所用的hplc柱上的保留時間關(guān)于l-巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)物是大約3.5min，關(guān)于乳糖標(biāo)準(zhǔn)物是大約15min，而關(guān)于3-巖藻糖基乳糖標(biāo)準(zhǔn)物是大約11-12min(數(shù)據(jù)未顯示)。作為碳源添加到所述培養(yǎng)基中的物質(zhì)甘油和葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)物被記錄為分別具有大約1.5min和7-8min的保留時間。實(shí)施例3：3-巖藻糖基乳糖的制備以及由重組大腸桿菌依賴于seta分泌到培養(yǎng)基中本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是研究seta介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)3-巖藻糖基乳糖的輸出。將大腸桿菌菌株jm01和jm02(見表2)用于發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。都表達(dá)酶fkp和futaco(1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白fucp和lacy的菌株jm01和jm02，區(qū)別僅在于seta轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。jm01不過度產(chǎn)生seta，而jm02過度產(chǎn)生seta。圖2顯示由hpaec-pad分析確定的在大腸桿菌培養(yǎng)物jm01和jm02的潮濕細(xì)胞團(tuán)塊和上清液中3-巖藻糖基乳糖的量。為確定seta超表達(dá)的效果，在誘導(dǎo)fkp、fucp、lacy、futaco和seta表達(dá)后7、24和32小時進(jìn)行測量。在所述圖中，在大腸桿菌jm01(不超表達(dá)seta)中測量的3-巖藻糖基乳糖的細(xì)胞外級分由柱i表示，而細(xì)胞內(nèi)級分由柱ii表示。在大腸桿菌jm02(超表達(dá)seta)的情況中，3-巖藻糖基乳糖的細(xì)胞外級分由柱iii表示而細(xì)胞內(nèi)級分由柱iv表示。所有的值表示來自兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，誤差柱表明各自的標(biāo)準(zhǔn)偏差。這些測量顯示不超表達(dá)seta的菌株jm01在細(xì)胞溶膠級分中累積3-巖藻糖基乳糖。相反，在超表達(dá)seta的菌株jm002的情形中的3-巖藻糖基乳糖的細(xì)胞內(nèi)濃度低于檢測水平。此外，來自jm01-和jm02-培養(yǎng)物的上清液展示一定含量的3-巖藻糖基乳糖。因此，然而，在jm02培養(yǎng)物的上清液中發(fā)現(xiàn)的3-巖藻糖基乳糖的含量比在jm01培養(yǎng)物的上清液中發(fā)現(xiàn)的3-巖藻糖基乳糖的含量極大地增加。而在32h后，3-巖藻糖基乳糖在jm01的上清液中的濃度是大約21mgl-1，而在jm02的情況中的3-巖藻糖基乳糖的濃度高于51mgl-1。在大腸桿菌jm01和jm02的培養(yǎng)物中的3-巖藻糖基乳糖的總量的比較繪制在圖3中。此處，在大腸桿菌jm01培養(yǎng)物中的3-巖藻糖基乳糖的總量由柱i表示而在大腸桿菌jm02培養(yǎng)物中的3-巖藻糖基乳糖的總量由柱ii表示。再次，顯示來自兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。在32h的溫育后，菌株jm02總共產(chǎn)生51.68mgl-1的3-巖藻糖基乳糖，這比菌株jm01(32.99mgl-1)多大約57％。實(shí)施例4：討論hpaec-pad分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不超表達(dá)seta的菌株jm01和超表達(dá)seta的菌株jm02之間存在合成和轉(zhuǎn)運(yùn)3-巖藻糖基乳糖的巨大差異。首先，在jm02培養(yǎng)物的細(xì)胞潮濕團(tuán)塊中探測不到3-巖藻糖基乳糖，而在上清液中可以測量到高濃度的3-巖藻糖基乳糖。這清楚地表明在大腸桿菌中超表達(dá)seta引起3-巖藻糖基乳糖從細(xì)胞中十分有效地輸出。因此，本發(fā)明人已經(jīng)表明，與從現(xiàn)有技術(shù)預(yù)期的相反，seta能夠有效地輸出較大的寡糖，在本情況中，所述較大的寡糖以具有三個亞基和488g/mol的分子質(zhì)量為特征。相反，在jm01的潮濕細(xì)胞團(tuán)塊中，探測到相當(dāng)大量的3-巖藻糖基乳糖，而在上清液中只存在相對很少的3-巖藻糖基乳糖。此結(jié)果表明在不存在超表達(dá)的seta時，3-巖藻糖基乳糖在細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞溶膠內(nèi)大量累積。在這些情況下在上清液中也探測到3-巖藻糖基乳糖的事實(shí)能夠，根據(jù)現(xiàn)有知識，歸因于由高的細(xì)胞內(nèi)3-巖藻糖基乳糖濃度引起的增加的細(xì)菌細(xì)胞的溶解。當(dāng)比較在jm01-和jm02-培養(yǎng)物中的3-巖藻糖基乳糖的總量時，明顯的是seta的超表達(dá)不僅導(dǎo)致上清液中3-巖藻糖基乳糖濃度的增加，而且還提高了合成的3-巖藻糖基乳糖的總量(見圖3)。此總合成效率的增加可以歸因于超表達(dá)seta的細(xì)胞的更高的細(xì)胞生存能力，該生存能力將歸因于產(chǎn)物細(xì)胞毒性的避免。備選地或此外，總合成效率的增加也可以歸因于對合成酶的產(chǎn)物抑制作用的避免，而所述避免則歸因于由超表達(dá)的seta介導(dǎo)的產(chǎn)物輸出。因此，本發(fā)明人已經(jīng)表明，seta轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的超表達(dá)是提高寡糖合成產(chǎn)量的有效方式，其通過采用可培養(yǎng)的細(xì)胞的生物技術(shù)方法實(shí)現(xiàn)。此外，由于能夠大部分避免對相關(guān)合成酶的產(chǎn)物抑制作用和合成產(chǎn)物的細(xì)胞毒性，所述制備變得容易并且更加可控。參考文獻(xiàn)列表alaimo，c，catrein，i.，morf，l.，marolda，c.l.，callewaert，n.，valvano，m.a.，feldman，m.f.&m.aebi，(2006)twodistinctbutinterchangeablemechanismsforflippingoflipid-linkedoligosaccharides(翻轉(zhuǎn)連接有脂質(zhì)的寡糖的兩個不同但可交換的機(jī)制).emboj(歐洲分子生物學(xué)組織雜志)25(5)：967-976.albermann，c.，w.piepersberg&u.f.wehmeier，(2001)synthesisofthemilkoligosaccharide2′-fucosyllactoseusingrecombinantbacterialenzymes(使用重組細(xì)菌酶合成乳寡糖2′-巖藻糖基乳糖).carbohydrres(碳水化合物研究)334：97-103.andersson，b.，o.porras，l.a.hanson，t.lagergard&c.svanborg-eden，(1986)inhibitionofattachmentofstreptococcuspneumoniaeandhaemophilusinfluenzaebyhumanmilkandreceptoroligosaccharides(人乳和受體寡糖抑制肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的附著).jinfectdis(傳染病雜志)153：232-237.bode，l.，(2006)recentadvancesonstructure，metabolism，andfunctionofhumanmilkoligosaccharides(有關(guān)人乳寡糖的結(jié)構(gòu)、代謝和功能的最新進(jìn)展).jnutr(營養(yǎng)學(xué)雜志)136：2127-2130.boehm，g.&b.stahl，(2007)oligosaccharidesfrommilk(來自乳汁的寡糖).jnutr(營養(yǎng)學(xué)雜志)137：847s-849s.coppa，g.v.，l.zampini，t.galeazzi，b.facinelli，l.ferrante，r.capretti&g.orazio，(2006)humanmilkoligosaccharidesinhibittheadhesiontocaco-2cellsofdiarreapathogens：escherichiacoli，vibriocholerae，andsalmonellafyris(人乳寡糖抑制痢疾病原體：大腸桿菌、霍亂弧菌和法里斯沙門氏菌粘附到caco-2細(xì)胞).pediatrres(兒科研究)59：377-382.coyne，m.j.，b.reinap，m.m.lee&l.e.comstock，(2005)humansymbiontsuseahost-likepathwayforsurfacefucosylation(人共生生物使用與宿主相似的通路用于表面巖藻糖基化).science(科學(xué))307：1778-1781.crane，j.k.，s.s.azar，a.stam&d.s.newburg，(1994)oligosaccharidesfromhumanmilkblockbindingandactivityoftheescherichiacoliheat-stableenterotoxin(sta)int84intestinalcells(來自人乳的寡糖阻斷t84腸細(xì)胞中的大腸桿菌熱穩(wěn)定腸毒素(sta)的結(jié)合和活性).jnutr(營養(yǎng)學(xué)雜志)124：2358-2364.cravioto，a.，a.tello，h.villafan，j.ruiz，s.delvedovo&j.r.neeser，(1991)inhibitionoflocalizedadhesionofenteropathogenicescherichiacolitohep-2cellsbyimmunoglobulinandoligosaccharidefractionsofhumancolostrumandbreastmilk(人初乳和母乳的免疫球蛋白和寡糖級分抑制致腸病的大腸桿菌局部粘附到hep-2細(xì)胞).jinfectdis(傳染病雜志)163：1247-1255.datsenko，k.a.，和b.l.wanner.2000.one-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpcrproducts(使用pcr產(chǎn)物一步法失活大腸桿菌k-12中的染色體基因).procnatlacadsciusa(美國國家科學(xué)院院報(bào))97：6640-5.dower，w.j.，j.f.miller，和c.w.ragsdale.1988.highefficiencytransformationofe.colibyhighvoltageelectroporation(通過高壓電穿孔高效轉(zhuǎn)化大腸桿菌).nucleicacidsres(核酸研究)16：6127-45.dumon，c，c.bosso，j.p.utille，a.heyraud&e.samain，(2006)productionoflewisxtetrasaccharidesbymetabolicallyengineeredescherichiacoli(通過代謝工程大腸桿菌制備lewisx四糖).chembiochem(化學(xué)生物化學(xué))7：359-365.dumon，c，b.priem，s.l.martin，a.heyraud，c.bosso&e.samain，(2001)invivofucosylationoflacto-n-neotetraoseandlacto-n-neohexaosebyheterologousexpressionofhelicobacterpylorialpha-1，3fucosyltransferaseinengineeredescherichiacoli(通過在工程大腸桿菌中異源表達(dá)幽門螺桿菌α-1，3巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行乳糖-n-新四糖和乳糖-n-新己糖的體內(nèi)巖藻糖基化).glycoconjj(復(fù)合糖雜志)18：465-474.dumon，c，e.samain&b.priem，(2004)assessmentofthetwohelicobacterpylorialpha-1，3-fucosyltransferaseorthologgenesforthelarge-scalesynthesisoflewisxhumanmilkoligosaccharidesbymetabolicallyengineeredescherichiacoli(評估用于通過代謝工程大腸桿菌大規(guī)模合成lewisx人乳寡糖的兩個幽門螺桿菌α-1，3巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶直向同源基因).biotechnolprog(生物技術(shù)進(jìn)展)20：412-419.gnoth，m.j.，s.rudloff，c.kunz&r.k.kinne，(2001)investigationsoftheinvitrotransportofhumanmilkoligosaccharidesbyacaco-2monolayerusinganovelhighperformanceliquidchromatography-massspectrometrytechnique(使用新型高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)研究由caco-2單層進(jìn)行的人乳寡糖的體外轉(zhuǎn)運(yùn)).jbiolchem(生物化學(xué)雜志)276：34363-34370.grant，w.d.，i.w.sutherland&j.f.wilkimson，(1970)controlofcolanicacidsynthesis(可拉酸合成的控制).jbacteriol(細(xì)菌學(xué)雜志)103：89-96.koizumi，s.，t.endo，k.tabata，h.nagano，j.ohnishi&a.ozaki，(2000)large-scaleproductionofgdp-fucoseandlewisxbybacterialcoupling(通過細(xì)菌偶聯(lián)大規(guī)模制備gdp-巖藻糖和lewisx).jindmicrobiolbiotechnol(工業(yè)微生物和生物技術(shù)雜志)25：213-217.kretzschmar，g.&w.stahl，(1998)largescalesynthesisoflinker-modifiedsialyl-lewis(x)，lewis(x)andn-acetyllactosamine(大規(guī)模合成連接體修飾的唾液酸基-lewis(x)、lewis(x)和n-乙?；樘前?.tetrahedron(四面體)54：6341-6358.kunz，c.&s.rudloff，(2006)healthpromotin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