本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

樹(shù)突狀細(xì)胞是一類(lèi)存在于外周血、皮膚、淋巴器官及胸腺中的抗原提呈細(xì)胞(antigenpresentingcells,apc)，因其細(xì)胞膜向外伸出，形成樹(shù)突狀或偽足樣突起，故而命名為樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriticcells，dcs)。它能高效地?cái)z取、加工處理和遞呈抗原，并可刺激成熟后活化初始t細(xì)胞。未成熟dc細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移、攝取和加工抗原的能力，而成熟dc細(xì)胞刺激初始t細(xì)胞增殖、分化的能力強(qiáng)，處于啟動(dòng)、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。imdc成熟過(guò)程的深入研究有助于進(jìn)一步闡明免疫耐受機(jī)制，對(duì)于抗腫瘤、風(fēng)濕免疫免疫、抗排斥等臨床和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域有極為重要的意義。

目前實(shí)驗(yàn)室imdcs的獲取和培養(yǎng)多由研究者采用人外周血或臍血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)抗體磁珠包被分離、ficoll梯度離心純化后誘導(dǎo)分化而成，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基、動(dòng)物血清及相關(guān)細(xì)胞因子自行配置培養(yǎng)。但由于臨床血標(biāo)本的限制、dc自身增殖能力不強(qiáng)，加之不同品牌培養(yǎng)基及血清等試劑之間差異較大、成分復(fù)雜，導(dǎo)致不能獲取足量imdcs、培養(yǎng)效率低下、細(xì)胞活性差、每次獲取imdcs的量及成熟度均不穩(wěn)定，嚴(yán)重影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。因此，在實(shí)驗(yàn)室中如何穩(wěn)定高效的獲取大量imdcs，是解決問(wèn)題的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞穩(wěn)定分化為未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)基。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供利用所述培養(yǎng)基進(jìn)行imdcs體外誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)方法。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一種誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞穩(wěn)定分化為未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由x-vivo2090～95v/v%，lps1μg/ml，gm-csf20～40ng/ml、il-410～40ng/ml、青霉素-鏈霉素10⁶u/ml組成，余量為無(wú)菌注射用水；其中g(shù)m-csf與il-4的質(zhì)量比為4：1時(shí)dc產(chǎn)量及純度最高。

本發(fā)明所述培養(yǎng)基包括按照比例混合而成的無(wú)血清培養(yǎng)基、lps、gm-csf、il-4、青霉素-鏈霉素。

其中，無(wú)血清培養(yǎng)基為x-vivo20，其配方完全并且包含藥物級(jí)別的人白蛋白、重組人胰島素及巴氏消毒轉(zhuǎn)鐵蛋白，可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供基本物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、激素及各種生長(zhǎng)因子，所含結(jié)合蛋白、促接觸和伸展因子能在細(xì)胞代謝過(guò)程中起重要作用，同時(shí)由于不添加血清成分、不含不明確成分，增加確定性，性能更加一致，容易進(jìn)行純化和下游加工，細(xì)胞功能的精確評(píng)估，增強(qiáng)生長(zhǎng)和/或產(chǎn)量，生理反應(yīng)性的較好對(duì)照，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)中介物的檢測(cè)。

lps是格蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的主要成分，lps在dc分化發(fā)育的晚期促使其成熟，但在dc分化發(fā)育的早期或其全過(guò)程中持續(xù)予以一定劑量的lps刺激，dc的成熟明顯受到抑制。

gm-csf為粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子，能定向刺激骨髓細(xì)胞向粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞方向分化，亦誘導(dǎo)單核擴(kuò)增向dc方向分化。

il-4為白細(xì)胞介素-4，能抑制骨髓細(xì)胞向巨噬細(xì)胞方向分化。兩者結(jié)合，使得骨髓細(xì)胞更高比例的向dc方向分化。

青霉素-鏈霉素為兩聯(lián)抗生素，青霉素主要抑制革蘭氏陽(yáng)性菌，鏈霉素主要抑制革蘭氏陰性菌，兩者互補(bǔ)，可抑制大部分常見(jiàn)的細(xì)菌，保證細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境。青霉素作用于細(xì)胞壁，鏈霉素只影響細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，不影響真核細(xì)胞生長(zhǎng)。

本發(fā)明在復(fù)配細(xì)胞培養(yǎng)基的過(guò)程及預(yù)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)gm-csf與il-4的配比對(duì)dc細(xì)胞純度影響顯著，持續(xù)低劑量lps誘導(dǎo)所得imdcs比例最高。在無(wú)血清培養(yǎng)基體系中，只有g(shù)m-csf與il-4的質(zhì)量用量比為4：1，lps劑量為1μg/ml時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最好，且純度最高。

優(yōu)選地，所述的誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞穩(wěn)定分化為未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基由x-vivo2095v/v%，lps1μg/ml，gm-csf40ng/ml、il-410ng/ml、青霉素-鏈霉素10⁶u/ml組成，余量為無(wú)菌注射用水。

本發(fā)明還提供利用所述培養(yǎng)基進(jìn)行imdcs體外誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)方法。

具體地，該方法包括以下步驟：

s1.冰浴上收集小鼠骨髓細(xì)胞并制成懸液，離心后棄上清；

s2.向s1離心得到的細(xì)胞沉淀加入3～5ml紅細(xì)胞裂解液，混勻后靜置2min，離心后棄上清；

s3.將步驟s2離心得到的細(xì)胞重懸于rpmi1640中，離心后棄上清；

s4.重復(fù)步驟s3兩次；

s5.將步驟s4離心得到的細(xì)胞重懸于權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)基中，然后置于培養(yǎng)箱中孵育；之后隔天換液一次；

s6.培養(yǎng)第1、第3天，每次換液為全量換液，培養(yǎng)至第5天后重新鋪板；培養(yǎng)至7天后獲得imdcs。

優(yōu)選地，s1所述骨髓細(xì)胞取自小鼠脛骨、股骨。

優(yōu)選地，s1，s2，s3所述離心的條件均為4℃，1000rpm，2～5min。

優(yōu)選地，s5細(xì)胞重懸后細(xì)胞密度為0.5×10⁶/ml～1×10⁶/ml。

作為一種具體的實(shí)施方式，本發(fā)明所述培養(yǎng)方法包括以下步驟：

s1.冰浴環(huán)境通過(guò)rpmi1640收集取自6～8周齡小鼠脛骨、股骨的骨髓細(xì)胞并制成懸液，4℃，1000rpm離心5min后棄上清；

s2.將步驟s1離心得到的細(xì)胞沉淀加入3～5ml紅細(xì)胞裂解液，混勻后靜置2min，4℃，1000rpm離心2min后棄上清；

s3.將步驟s2離心得到的細(xì)胞重懸于rpmi1640中，4℃，1000rpm離心2min后棄上清；重復(fù)此步驟2次；

s4.將步驟s3離心得到的細(xì)胞重懸于本發(fā)明所述培養(yǎng)基中，鋪至6孔板內(nèi)（細(xì)胞密度0.5～1×10⁶），然后置于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中孵育；之后隔天換液一次；

s5.培養(yǎng)至1～4天，此時(shí)dc細(xì)胞前體貼壁生長(zhǎng)，丟棄原培養(yǎng)基懸液，應(yīng)用本發(fā)明所述培養(yǎng)基全量換液；

s6.培養(yǎng)到第5天后，dc細(xì)胞懸浮或半懸浮生長(zhǎng)，收集全部培養(yǎng)基，4℃，1000rpm離心2min后棄上清，用dc培養(yǎng)基重懸沉淀，重新鋪板；

s7.培養(yǎng)到第7天，dc細(xì)胞誘導(dǎo)完全，可收集所培養(yǎng)細(xì)胞用于未成熟dc細(xì)胞的相關(guān)研究，亦可繼續(xù)培養(yǎng)或刺激成熟以研究成熟dc相關(guān)問(wèn)題。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

（1）本發(fā)明提供的一種誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞穩(wěn)定分化為未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的專(zhuān)用細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法，顯著提高dc細(xì)胞分化數(shù)量及細(xì)胞活性。使用本發(fā)明dc培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法，每只6～8周齡spf級(jí)小鼠可獲得80～100×10⁶個(gè)dc細(xì)胞，顯著高于利用現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的細(xì)胞數(shù)；其中無(wú)血清培養(yǎng)基不僅極大的提高了培養(yǎng)出的dc的純度，而且持續(xù)低劑量lps刺激使得dc的成熟度最大限度地統(tǒng)一在未成熟狀態(tài)。使用本發(fā)明dc細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法，所獲得的細(xì)胞中cd11c⁺比例超過(guò)94%，明顯高于傳統(tǒng)培養(yǎng)基及傳統(tǒng)方法所得細(xì)胞含量，imdcs的比例也維持在最高水平。

利用本發(fā)明所述方法培養(yǎng)dc細(xì)胞，不受臨床標(biāo)本限制，可無(wú)限獲取imdcs；無(wú)需研究者自行配制，細(xì)胞培養(yǎng)基成分相對(duì)固定簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性好，培養(yǎng)成本相對(duì)較低；培養(yǎng)方法操作簡(jiǎn)單，dc獲取純度高，成熟度均一，大大節(jié)省以往為純化dc所花費(fèi)的成本以及最大限度統(tǒng)一細(xì)胞成熟度均一性，以優(yōu)化后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的同一性。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1所述方法培養(yǎng)的光鏡下典型的imdcs形態(tài)。

圖2為實(shí)施例1所述方法培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)cd11c熒光標(biāo)記imdcs的流式圖。

圖3為實(shí)施例1所述方法培養(yǎng)的的imdcs經(jīng)tnf-α刺激成熟后表型變化的流式圖。

圖4為本發(fā)明效果實(shí)施例及各對(duì)比例所培養(yǎng)dc細(xì)胞功能的相關(guān)檢測(cè)；圖4a為實(shí)施例1的dc細(xì)胞抗原吞噬能力；圖4b為各組dc在tnf-α刺激前后il-12分泌水平；圖4c為各組dc在tnf-α刺激前后il-10分泌水平；圖4d為各組dc抗原提呈能力；圖4e為各組dc在tnf-α刺激前mlr細(xì)胞增殖的變化；圖4f為各組dc在tnf-α刺激后mlr細(xì)胞增殖的變化。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的簡(jiǎn)單修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍；若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實(shí)施例1

本實(shí)施例dc培養(yǎng)基包括下述的各組分：x-vivo2095v/v%、lps1μg/ml、gm-csf40ng/ml、il-410ng/ml、青霉素-鏈霉素10⁶u/ml，余量為無(wú)菌注射用水。

使用本實(shí)施例所述dc培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞分化為imdcs的方法，包括以下步驟：

s1.冰浴環(huán)境通過(guò)rpmi1640收集取自6～8周齡小鼠脛骨、股骨的骨髓細(xì)胞并制成懸液，4℃，1000rpm離心5min后棄上清；

s2.將步驟s1離心得到的細(xì)胞沉淀加入3～5ml紅細(xì)胞裂解液，混勻后靜置2min，4℃，1000rpm離心2min后棄上清；

s3.將步驟s2離心得到的細(xì)胞重懸于rpmi1640中，4℃，1000rpm離心2min后棄上清；重復(fù)此步驟2次；

s4.將步驟s3離心得到的細(xì)胞重懸于本實(shí)施例所述dc培養(yǎng)基中，鋪至6孔板內(nèi)（細(xì)胞密度0.5～1×10⁶），然后置于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中孵育；之后隔天換液一次；

s5.培養(yǎng)1～4天，此時(shí)dc前體貼壁生長(zhǎng)，丟棄培養(yǎng)基懸液，全量換液；

s6.培養(yǎng)到第5天后，dc懸浮或半懸浮生長(zhǎng)，收集全部培養(yǎng)基，4℃，1000rpm離心2min后棄上清，用dc培養(yǎng)基重懸沉淀，重新鋪板；

s7.培養(yǎng)到第7天，dc誘導(dǎo)完全，可收集所培養(yǎng)細(xì)胞。

收集培養(yǎng)獲得的dc細(xì)胞，光鏡下觀察imdc形態(tài)，結(jié)果如圖1所示：imdcs形態(tài)不固定，明顯樹(shù)突樣或偽足樣突起為其特征。

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和elisa檢測(cè)本實(shí)施例所述dc培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法所得dc細(xì)胞功能活性，檢測(cè)項(xiàng)目為dc細(xì)胞純度及其刺激成熟前后表型變化、dc細(xì)胞分泌細(xì)胞因子、吞噬功能、抗原提呈功能。

圖2所示，cd11c為dc細(xì)胞表面特征性標(biāo)志，其比例間接反應(yīng)dc細(xì)胞比例，圖中所示實(shí)施例1中cd11c⁺dc細(xì)胞比例為94.2%，即是說(shuō)，實(shí)施例1中dc細(xì)胞比例為94.2%。

圖3所示，cd40、cd80、cd86、mhc-ii均為dc細(xì)胞成熟標(biāo)志，經(jīng)腫瘤壞死因子-α（tumornecrosisfactor-α，tnf-α）刺激后，imdcs的以上表型均有不同程度升高。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)實(shí)施例1中imdc經(jīng)tnf-α刺激后，各表型均有明顯上調(diào)，說(shuō)明本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)的imdcs仍有刺激成熟的潛能，與生理狀態(tài)下及傳統(tǒng)方法所得imdcs特性相似，可用于imdcs成熟變化的相關(guān)后續(xù)研究。

實(shí)施例2

本實(shí)施例dc培養(yǎng)基包括下述的各組分：x-vivo2095v/v%、lps1μg/ml、gm-csf10ng/ml、il-440ng/ml、青霉素-鏈霉素10⁶u/ml，余量為無(wú)菌注射用水。

使用本實(shí)施例的dc培養(yǎng)基培養(yǎng)dc細(xì)胞的方法與實(shí)施例1的方法類(lèi)似。

對(duì)比例1

本對(duì)比例dc培養(yǎng)基包括下述的各組分：x-vivo2095v/v%、gm-csf40ng/ml、il-410ng/ml、青霉素-鏈霉素10⁶u/ml，余量為無(wú)菌注射用水。

本對(duì)比例的dc細(xì)胞培養(yǎng)方法同實(shí)施例1，唯一不同的是所用的dc培養(yǎng)基是本對(duì)比例的dc培養(yǎng)基。

對(duì)比例2

本對(duì)比例dc培養(yǎng)基包括下述的各組分：rpmi164090v/v%、胎牛血清10v/v%、lps1μg/ml、gm-csf40ng/ml、il-410ng/ml、青霉素-鏈霉素10⁶u/ml，余量為無(wú)菌注射用水。

本對(duì)比例的dc細(xì)胞培養(yǎng)方法同實(shí)施例1，唯一不同的是所用的dc培養(yǎng)基是本對(duì)比例的dc培養(yǎng)基。

對(duì)比例3

本對(duì)比例dc培養(yǎng)基包括下述的各組分：rpmi164090v/v%、胎牛血清10v/v%、lps1μg/ml、gm-csf10ng/ml、il-440ng/ml、青霉素-鏈霉素10⁶u/ml，余量為無(wú)菌注射用水。

本對(duì)比例的dc細(xì)胞培養(yǎng)方法同實(shí)施例1，唯一不同的是所用的dc培養(yǎng)基是本對(duì)比例的dc培養(yǎng)基。

分別收集實(shí)施例1～2，對(duì)比例1～3的方法培養(yǎng)獲得的dc細(xì)胞，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板、臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力計(jì)算，流式細(xì)胞數(shù)計(jì)數(shù)imdc比例。結(jié)果如表1所示。

如表1所示，應(yīng)用本發(fā)明培養(yǎng)基后，每只小鼠的dcs產(chǎn)量更多，活率更高，同時(shí)imdc比例更高；對(duì)比傳統(tǒng)培養(yǎng)基，本發(fā)明培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法能有效棄去貼壁細(xì)胞，提高dc細(xì)胞比例，使得懸浮生長(zhǎng)的dc細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)更集中，同樣使細(xì)胞產(chǎn)量更多、活率更高。

同時(shí)檢測(cè)各個(gè)實(shí)施例和對(duì)比例獲得的dc細(xì)胞的功能，其結(jié)果如圖4所示。圖4a為采用fitc-dextran吞噬實(shí)驗(yàn)來(lái)分析實(shí)施例1中imdcs的抗原吞噬情況，流式結(jié)果顯示實(shí)施例1中imdcs具有很強(qiáng)的吞噬能力。

圖4b、4c為各組imdcs在tnf-α刺激前后il-12、il-10分泌水平變化。imdcs在成熟過(guò)程中分泌大量的il10、il-12，前者抑制th1型反應(yīng)促進(jìn)th2型反應(yīng)，參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，而后者可以驅(qū)動(dòng)th1型反應(yīng)，參與缺血再灌注、排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病的病理過(guò)程，故該兩種細(xì)胞因子是dc研究中的重點(diǎn)。結(jié)果如圖所示，應(yīng)用各個(gè)實(shí)施例和對(duì)比例所培養(yǎng)的dc分泌的細(xì)胞因子水平相近（p＞0.05），同時(shí)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明培養(yǎng)基組內(nèi)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果比傳統(tǒng)培養(yǎng)基差異更小，水平更穩(wěn)定。運(yùn)用本發(fā)明培養(yǎng)基比傳統(tǒng)培養(yǎng)基（實(shí)施例1vs對(duì)比例1、對(duì)比例2；實(shí)施例2vs對(duì)比例3）所培養(yǎng)的dc分泌的細(xì)胞因子水平相近（p＞0.05），但各次實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性更好。

圖4d為各組imdcs抗原提呈能力的比較。dc細(xì)胞遞呈ova抗原給mf2.2d9細(xì)胞，后者特異性增殖時(shí)分泌的il-2，因此，il-2水平反映imdcs的抗原遞呈能力。將各組imdcs與mf2.2d9腫瘤細(xì)胞按1：10混合后加入可溶性抗原ova孵育24小時(shí)，收集上清，檢測(cè)il12水平。結(jié)果顯示：各個(gè)實(shí)施例和對(duì)比例所培養(yǎng)的imdcs抗原提呈能力相近（p＞0.05），但實(shí)施例1的dc培養(yǎng)基各重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果比對(duì)比例的各個(gè)dc培養(yǎng)基差異更小，水平更穩(wěn)定；運(yùn)用本發(fā)明培養(yǎng)基（實(shí)施例1、實(shí)施例2）比傳統(tǒng)培養(yǎng)基所培養(yǎng)的imdcs抗原提呈能力也相近（p＞0.05），但各次實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性更好。

圖4e、4f為各組imdcs經(jīng)tnf-α刺激前后mlr細(xì)胞增殖的變化。將各組tnf-α刺激前后的dcs與同種小鼠來(lái)源的脾臟cd4+t細(xì)胞按一定比例（1：40、1：10、1：2）做混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，觀察dc刺激同種t細(xì)胞增殖的能力。結(jié)果如圖所示，應(yīng)用各個(gè)實(shí)施例和對(duì)比例所培養(yǎng)的dc細(xì)胞刺激同種淋巴細(xì)胞增殖的能力相近（p＞0.05），但實(shí)施例的dc培養(yǎng)基組內(nèi)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果比對(duì)比例的各個(gè)培養(yǎng)基差異更小，水平更穩(wěn)定；運(yùn)用本發(fā)明培養(yǎng)基（實(shí)施例1、實(shí)施例2）比傳統(tǒng)培養(yǎng)基所培養(yǎng)的dc抗原提呈能力相近（p＞0.05），但各次實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性更好。