本發(fā)明涉及一種提取羅漢果甜苷的方法，具體涉及一種同時提取羅漢果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v的方法。

背景技術(shù)：

羅漢果是我國傳統(tǒng)的藥食同源植物，羅漢果甜苷是其主要的功能成分，是一類高甜度、低卡路里的理想天然甜味劑，因其具有多種生物活性而備受人們的關(guān)注。羅漢果甜苷分為多種，研究表明羅漢果甜苷是一種三萜烯葡萄糖苷，其配糖苷元是三萜烯醇，有兩條由四個以下葡萄糖單位組成的葡萄糖苷側(cè)鏈，以β-糖苷鍵與苷元相連，側(cè)鏈葡糖糖之間的連接鍵為β-1,6和β-1,2糖苷鍵。其中，羅漢果甜苷v的含量最高，其次是11-o基苷v和苷ⅵ，三種甜苷的分子式如下：

羅漢果甜苷v

羅漢果11-o基苷v羅漢果甜苷ⅵ

羅漢果甜苷的提取在國內(nèi)已有多年的產(chǎn)業(yè)化經(jīng)驗，對于羅漢果甜苷v的分離和提純的研究比較廣泛。

cn101029071a公開了一種從羅漢果中制備高純度羅漢果苷v的方法，是以羅漢果鮮果為原料，通過乙醇回流提取，乙酸乙酯和正丁醇萃取，聚酰胺和硅膠層析，得到羅漢果苷v。但是，該方法過于復雜，生產(chǎn)成本極高，且只能獲得羅漢果苷v一種成分。

cn106074669a公開了一種羅漢果多酚的提取方法，是以羅漢果果皮為原料，通過干燥，粉碎，乙醇超聲提取，聚酰胺吸附，洗脫，濃縮等步驟得到羅漢果多酚提取物。但是，該方法未涉及羅漢果甜苷的分離方法。

cn1375499a公開了一種從羅漢果中提取分離多種成份的方法，是以羅漢果為原料，通過堿水提取，脂肪醇沉淀，離子交換樹脂、大孔樹脂、聚酰胺樹脂等處理，得到羅漢果甜苷、羅漢果多糖和羅漢果黃酮。但是，該方法獲得的羅漢果甜苷為多種甜苷的混合物，并未得到各甜苷的高純產(chǎn)品。

cn101851265a公開了一種從干羅漢果中提取多種活性成分的方法，是先將干羅漢果去核，再通過加水閃提，離心，多次聚酰胺層析，d213脫色，醇沉，酶解等步驟，分別得到甜苷、多酚、多糖、低聚糖和氨基酸等成分。但是，該方法獲得的羅漢果甜苷同樣是多種甜苷的混合物，并未得到各甜苷的高純產(chǎn)品。

由上可知，現(xiàn)有關(guān)于羅漢果11-o基苷v和苷ⅵ分離和提純的報道很少。實際生產(chǎn)中得到的羅漢果提取物通常是羅漢果總苷的混合物，因此，迫切需要找到一種方法，實現(xiàn)單一成分的分離，并實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種所得產(chǎn)品純度、收率高，成本低，工藝條件溫和，安全環(huán)保，適于工業(yè)化生產(chǎn)的同時提取羅漢果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v的方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：一種同時提取羅漢果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v的方法，包括以下步驟：

（1）正丁醇萃?。簩⒘_漢果甜苷v精制母液用水溶解，加入正丁醇進行萃取，分離水層，得正丁醇層；

（2）濃縮析晶：將步驟（1）所得正丁醇層減壓濃縮，冷卻，攪拌析晶，過濾，得晶體和正丁醇析晶母液，將晶體干燥，得羅漢果甜苷ⅵ；

（3）聚酰胺層析：將步驟（2）所得正丁醇析晶母液減壓濃縮至無醇，將所得濃縮物用水溶解，通過聚酰胺層析柱，收集上柱流出液，減壓濃縮，干燥，得羅漢果甜苷v；

（4）梯度洗脫：先后用低度醇溶液和高度醇溶液對步驟（3）過柱后的聚酰胺層析柱進行洗脫，收集高度醇洗脫液，濃縮，冷卻，析晶，過濾，干燥，得羅漢果11-o基苷v。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述羅漢果甜苷v精制母液中，羅漢果甜苷ⅵ的質(zhì)量含量為10～30%，羅漢果甜苷v的質(zhì)量含量為10～15%，11-o基苷v的質(zhì)量含量為5～20%。本發(fā)明所述羅漢果甜苷v精制母液來源于以羅漢果提取物為原料，用有機溶劑結(jié)晶制備高純度羅漢果甜苷v時所產(chǎn)生的母液。

優(yōu)選地，步驟（1）中，所述羅漢果甜苷v精制母液、水和正丁醇的質(zhì)量比為1:5～10:4～30（更優(yōu)選1:5～10:5～15）。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，加入的水可溶解水溶性的雜質(zhì)、色素以及無機鹽等，通過保留在水層中以除去，而加入的正丁醇對總苷的溶解度適中，且可與水分層，實現(xiàn)雜質(zhì)與總苷的分離，這是其它溶劑無法替代的。若正丁醇的用量過少，則總苷的萃取不徹底；若正丁醇的用量過多，將加大濃縮的任務量，并增加物料損耗。

優(yōu)選地，步驟（2）、（3）中，所述減壓濃縮的溫度為70～90℃，減壓濃縮的真空度為-0.06～-0.09mpa，濃縮至濃縮液的質(zhì)量濃度為20～35%（更優(yōu)選25～30%）。若濃縮后的濃縮液濃度過低，則達不到羅漢果苷ⅵ結(jié)晶的濃度，羅漢果苷ⅵ無法充分析出；若濃縮后的濃縮液濃度過高，則雜質(zhì)也將析出，降低產(chǎn)品的純度。

優(yōu)選地，步驟（2）中，所述攪拌析晶的溫度為15～30℃，轉(zhuǎn)速為60～120r/min，時間為12～36h。在所述析晶條件下，使得析出的晶體為高純的羅漢果甜苷ⅵ，而不會析出其它的甜苷或雜質(zhì)。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述水的用量為濃縮物質(zhì)量的18～50倍（更優(yōu)選20～30倍）。用水溶解的目的是使?jié)饪s物以水溶液的狀態(tài)通過聚酰胺層析柱層析，更有利于吸附。聚酰胺的吸附是“氫鍵原理”，只有與聚酰胺樹脂形成氫鍵的物質(zhì)才可吸附于其上，且樹脂吸附有一個最佳的濃度，高于或低于此濃度都將導致吸附率下降，所以，若水的用量過少，水溶液中的總物質(zhì)的濃度過高，則聚酰胺無法吸附11-o基苷v及黃酮、多酚等雜質(zhì)，導致羅漢果甜苷v與11-o基苷v和雜質(zhì)無法分離；若水的用量過多，則將延長上柱的時間，造成人力、物力的浪費。

優(yōu)選地，步驟（3）中，所述聚酰胺的目數(shù)為50～200目，用量為濃縮物質(zhì)量的4～20倍（更優(yōu)選5～10倍），聚酰胺層析柱的高徑比為1～20:1（更優(yōu)選5～15:1）。使用聚酰胺的目的是吸附11-o基苷v，從而使11-o基苷v和羅漢果甜苷v分離。若聚酰胺的用量過少，或?qū)游鲋母邚奖冗^小，都將導致11-o基苷v無法充分的被吸附；若聚酰胺的用量過多，或?qū)游鲋母邚奖冗^大，都將增加洗脫的難度和時間。

優(yōu)選地，步驟（3）中，上柱的流速為0.5～2.0bv/h。本發(fā)明方法所述1bv=1個柱床體積。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述低度醇溶液和高度醇溶液中的醇均為甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇等中的一種或幾種；所述低度醇溶液的體積濃度為10～40%（更優(yōu)選15～30%），所述高度醇溶液的體積濃度為50～85%（更優(yōu)選70～80%）。利用低度醇和高度醇的極性不同，進行梯度洗脫，梯度洗脫先用低度醇洗脫除去黃酮、多酚等雜質(zhì)，再用高度醇將目標產(chǎn)品11-o基苷v洗脫并收集。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述低度醇溶液的用量為2～5bv，高度醇溶液的用量為2～5bv；所述洗脫的流速均為0.5～2.0bv/h。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述濃縮的溫度為60～80℃，濃縮至濃縮液的質(zhì)量濃度為25～45%。

優(yōu)選地，步驟（4）中，所述析晶的溫度為15～30℃，時間為12～36h。

本發(fā)明方法的原理為：羅漢果甜苷v精制母液的成分除了含有少量羅漢果甜苷v之外，主要的成分是11-o基苷v和羅漢果甜苷ⅵ。在同時提取羅漢果甜苷ⅵ、羅漢果苷v和11-o基苷v時，由于羅漢果甜苷ⅵ在母液中所占比例高，且其極性比其它兩種甜苷都小，可在正丁醇中結(jié)晶析出，所以首先提取出羅漢果甜苷ⅵ；11-o基苷v因其特有的結(jié)構(gòu)可與聚酰胺形成氫鍵，因此可以吸附于聚酰胺層析柱，而羅漢果甜苷v不能與聚酰胺形成氫鍵，所以聚酰胺對羅漢果甜苷v不吸附，因而得以分離。

本發(fā)明方法的有益效果如下：

（1）本發(fā)明方法所得羅漢果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v均為白色粉末，經(jīng)高效液相色譜法檢測，羅漢果甜苷ⅵ的純度≥97%，收率≥83%，羅漢果甜苷v的純度≥89%，收率≥89%，11-o基苷v的純度≥96%，收率≥85%；實現(xiàn)了同時從羅漢果甜苷v精制母液中提取羅漢果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v，提高了羅漢果資源的利用率，增加了產(chǎn)品的附加值；

（2）本發(fā)明方法采用的分離和提純方式條件溫和，安全環(huán)保，對設(shè)備無特殊要求，適宜產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。

本發(fā)明實施例所使用的羅漢果甜苷v精制母液來源于湖南華誠生物資源股份有限公司以羅漢果提取物為原料，用有機溶劑結(jié)晶制備高純度羅漢果甜苷v時所產(chǎn)生的母液，經(jīng)高效液相色譜外標法檢測，其中，羅漢果甜苷ⅵ的質(zhì)量含量為20.1%，羅漢果甜苷v的質(zhì)量含量為10.9%，羅漢果11-o基苷v的質(zhì)量含量為15.5%；本發(fā)明實施例所使用的聚酰胺樹脂（目數(shù)為50～100目）購于中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司；本發(fā)明實施例所使用的原料和化學試劑，如無特殊說明，均通過常規(guī)商業(yè)途徑獲得。

實施例1

（1）正丁醇萃?。簩?00g羅漢果甜苷v精制母液用500g水溶解，加入500g正丁醇進行萃取，分離水層，得正丁醇層；

（2）濃縮析晶：將步驟（1）所得正丁醇層在80℃、真空度為-0.07mpa下，減壓濃縮至濃縮液的質(zhì)量濃度為25%，冷卻，在15℃，轉(zhuǎn)速120r/min下，攪拌析晶12h，過濾，得晶體和正丁醇析晶母液，將晶體干燥，得18.2g羅漢果甜苷ⅵ；

（3）聚酰胺層析：將步驟（2）所得正丁醇析晶母液在80℃、真空度為-0.07mpa下，減壓濃縮至無醇，將所得70g濃縮物用1750g水溶解，以1bv/h的流速通過聚酰胺層析柱（其中，聚酰胺的用量為420g，層析柱的高徑比為10:1），收集上柱流出液，在80℃、真空度為-0.07mpa下，減壓濃縮，干燥，得10.8g羅漢果甜苷v；

（4）梯度洗脫：先用2bv體積濃度為20%的乙醇溶液，以0.5bv/h的流速對步驟（3）過柱后的聚酰胺層析柱進行洗脫，再用4bv體積濃度為80%的乙醇溶液，以0.5bv/h的流速進行洗脫，收集體積濃度為80%的乙醇溶液的洗脫液，在65℃下，濃縮至濃縮液的質(zhì)量濃度為30%，冷卻，在25℃下，析晶24h，過濾，干燥，得13.8g羅漢果11-o基苷v。

本實施例所得羅漢果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v均為白色粉末，經(jīng)高效液相色譜外標法檢測，所得羅漢果甜苷ⅵ的純度為97.5%，收率為88.28%；羅漢果甜苷v的純度為91.9%，收率為91.06%；羅漢果11-o基苷v的純度為98.2%，收率為87.43%。

實施例2

（1）正丁醇萃?。簩?00g羅漢果甜苷v精制母液用1600g水溶解，加入2400g正丁醇進行萃取，分離水層，得正丁醇層；

（2）濃縮析晶：將步驟（1）所得正丁醇層在85℃、真空度為-0.08mpa下，減壓濃縮至濃縮液的質(zhì)量濃度為30%，冷卻，在30℃，轉(zhuǎn)速80r/min下，攪拌析晶36h，過濾，得晶體和正丁醇析晶母液，將晶體干燥，得34.3g羅漢果甜苷ⅵ；

（3）聚酰胺層析：將步驟（2）所得正丁醇析晶母液在85℃、真空度為-0.08mpa下，減壓濃縮至無醇，將所得135g濃縮物用2700g水溶解，以0.5bv/h的流速通過聚酰胺層析柱（其中，聚酰胺的用量為1350g，層析柱的高徑比為8:1），收集上柱流出液，在85℃、真空度為-0.08mpa下，減壓濃縮，干燥，得20.8g羅漢果甜苷v；

（4）梯度洗脫：先用3bv體積濃度為15%的甲醇溶液，以1bv/h的流速對步驟（3）過柱后的聚酰胺層析柱進行洗脫，再用5bv體積濃度為75%的甲醇溶液，以1bv/h的流速進行洗脫，收集體積濃度為75%的甲醇溶液的洗脫液，在60℃下，濃縮至濃縮液的質(zhì)量濃度為35%，冷卻，在15℃下，析晶18h，過濾，干燥，得27.3g羅漢果11-o基苷v。

本實施例所得羅漢果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v均為白色粉末，經(jīng)高效液相色譜外標法檢測，所得羅漢果甜苷ⅵ的純度為98%，收率為83.62%；羅漢果甜苷v的純度為93.5%，收率為89.21%；羅漢果11-o基苷v的純度為96.9%，收率為85.33%。

實施例3

（1）正丁醇萃?。簩?50g羅漢果甜苷v精制母液用900g水溶解，加入900g正丁醇進行萃取，分離水層，得正丁醇層；

（2）濃縮析晶：將步驟（1）所得正丁醇層在75℃、真空度為-0.06mpa下，減壓濃縮至濃縮液的質(zhì)量濃度為30%，冷卻，在25℃，轉(zhuǎn)速60r/min下，攪拌析晶24h，過濾，得晶體和正丁醇析晶母液，將晶體干燥，得25.8g羅漢果甜苷ⅵ；

（3）聚酰胺層析：將步驟（2）所得正丁醇析晶母液在75℃、真空度為-0.06mpa下，減壓濃縮至無醇，將所得100g濃縮物用2000g水溶解，以1.5bv/h的流速通過聚酰胺層析柱（其中，聚酰胺的用量為500g，層析柱的高徑比為15:1），收集上柱流出液，在75℃、真空度為-0.06mpa下，減壓濃縮，干燥，得16.9g羅漢果甜苷v；

（4）梯度洗脫：先用3bv體積濃度為30%的異丙醇溶液，以1.5bv/h的流速對步驟（3）過柱后的聚酰胺層析柱進行洗脫；再加入5bv體積濃度為70%的異丙醇溶液，以1.5bv/h的流速進行洗脫，收集體積濃度為70%的異丙醇溶液的洗脫液，在75℃下，濃縮至濃縮液的質(zhì)量濃度為40%，冷卻，在30℃下，析晶36h，過濾，干燥，得20.2g羅漢果11-o基苷v。

本實施例所得羅漢果甜苷v、ⅵ和11-o基苷v均為白色粉末，經(jīng)高效液相色譜外標法檢測，所得羅漢果甜苷ⅵ的純度為97.1wt%，收率為83.09%；羅漢果甜苷v的純度為89.6%，收率為92.61%；羅漢果11-o基苷v的純度為97.9wt%，收率為85.06%。