本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

啟動(dòng)子是基因的一個(gè)組成部分，啟動(dòng)子可以被rna聚合酶辨認(rèn)，并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。組成型啟動(dòng)子廣泛應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因，如常用于轉(zhuǎn)bt基因抗蟲(chóng)水稻的camv35s啟動(dòng)子，ubiquitin啟動(dòng)子和actin啟動(dòng)子，它能高效、持續(xù)和非特異的啟動(dòng)外源基因表達(dá)，但外源蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中組成型表達(dá)也會(huì)帶來(lái)很多負(fù)面影響。例如，增加植物的代謝負(fù)擔(dān)，影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)延滯、植株矮小、產(chǎn)量降低等；另外，利用組成型啟動(dòng)子可能誘發(fā)基因沉默，影響轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用；并且，隨著人們對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物食品安全問(wèn)題的越來(lái)越多的關(guān)注，組成型啟動(dòng)子亦不能滿足現(xiàn)代基因工程育種的要求。

誘導(dǎo)型啟動(dòng)子只在某些物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下或者植物發(fā)育到特定的階段，才啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄。它不僅能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定時(shí)空積累，增加區(qū)域表達(dá)量，提高植株的抗逆性，同時(shí)可避免由組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)外源基因超量表達(dá)引起對(duì)植株發(fā)育的負(fù)面影響，也可以在一定程度上解決轉(zhuǎn)基因應(yīng)用中的基因沉默和食品安全性問(wèn)題，是應(yīng)用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行基因工程育種的理想啟動(dòng)子。

核酮糖二磷酸羧化酶小亞基(rbcs)基因的啟動(dòng)子同時(shí)具有光誘導(dǎo)性和組織特異性。目前，rbcs的啟動(dòng)子在水稻上的應(yīng)用非常廣泛。最早kyozukaj等從番茄中發(fā)現(xiàn)rbcs基因的啟動(dòng)子可以在轉(zhuǎn)基因水稻中驅(qū)動(dòng)gus基因的表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)gus活性發(fā)現(xiàn)其只在綠色組織中表達(dá)，具有組織特異性。劉巧泉等克隆番茄rubisco小亞基rbcs3a基因的5′上游啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)rbcs基因的啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)gus基因在轉(zhuǎn)基因水稻綠色組織中特異表達(dá)，而在種子和根等組織中幾乎不表達(dá)。黃海群等克隆水稻日本晴rbcs基因5′上游序列的啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)gus報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因水稻的胚及胚乳中不表達(dá)，在葉片葉鞘、莖及穎殼中特異表達(dá)。盧碧霞等進(jìn)行了相類似的實(shí)驗(yàn)，對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的gus定量測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)rbcs啟動(dòng)子的表達(dá)水平高于camv35s組成型啟動(dòng)子。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

意外地，本申請(qǐng)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，水稻rbcs基因中的部分序列也具有啟動(dòng)子的特性；例如，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)水稻日本晴rbcs基因及內(nèi)含子序列(非rbcs基因的啟動(dòng)子序列)，可經(jīng)過(guò)光誘導(dǎo)僅在水稻的綠色組織中表達(dá)外源基因，根、籽實(shí)(胚及胚乳)中不表達(dá)，并伴隨植物生理狀態(tài)(新葉中高效表達(dá)，老葉中低效表達(dá))進(jìn)行適度表達(dá)。這種來(lái)源于水稻rbcs基因及內(nèi)含子序列來(lái)源的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有利于解決轉(zhuǎn)基因水稻中籽實(shí)的食品安全性問(wèn)題，且不影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育。

有鑒于此，本發(fā)明的第一目的在于提供一種光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子基因，其為下列核苷酸序列之一:

1)具有如seqidno.1所示的核苷酸序列；

2)或與如seqidno.1所示的核苷酸序列同源性至少70％、80％、90％或95％的核苷酸序列；

3)或經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸形成的編碼同等功能蛋白質(zhì)、由seqidno.1所示核苷酸序列衍生的核苷酸序列。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子基因中，所述光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子基因包括來(lái)自水稻rbcs基因及內(nèi)含子序列。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子基因中，所述光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子基因包括來(lái)自水稻nipponbareofssp.japonicaoforyzasativa(rice)的rbcs基因及內(nèi)含子序列。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種含植物光誘導(dǎo)啟動(dòng)子基因的載體，所述載體包含所述任意一種光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子基因。

優(yōu)選地，本發(fā)明所述的含植物光誘導(dǎo)啟動(dòng)子基因的載體中，所述載體為質(zhì)粒p-osrbcs-727；更優(yōu)選地，所述載體為質(zhì)粒p-osrbcs-727:gusplus。

本發(fā)明的再一目的為提供一種功能蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列由如seqidno.1所示的核苷酸序列所編碼，或由如seqidno.1所示的核苷酸序列所編碼的氨基酸殘基序列，經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且編碼與seqid№：1所示的核苷酸序列所編碼相同活性的蛋白質(zhì)；或與如seqidno.1所示的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列具有至少70％、80％、90％或95％的氨基酸序列，且編碼與seqidno.1所示的核苷酸序列所編碼相同活性的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明還提供了一種外源基因在植物中誘導(dǎo)表達(dá)的方法，包括以下步驟：

a.將上述載體引入植物愈傷組織細(xì)胞；

b.將該植物愈傷組織細(xì)胞生長(zhǎng)成植物；并且

c.選擇具有光誘導(dǎo)型表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物。

優(yōu)選地，在本發(fā)明外源基因在植物中誘導(dǎo)表達(dá)的方法中，所述植物為水稻；更優(yōu)選地，所述水稻為nipponbareofssp.japonicaoforyzasativa(rice)。

優(yōu)選地，在本發(fā)明外源基因在植物中誘導(dǎo)表達(dá)的方法中，所述光誘導(dǎo)表達(dá)的組織為水稻的綠色組織。

本發(fā)明的外源基因在植物中誘導(dǎo)表達(dá)的方法，所述主要含水稻rbcs基因及內(nèi)含子序列的啟動(dòng)子之表達(dá)載體，外源基因僅在水稻的綠色組織中表達(dá)在根、籽實(shí)(胚及胚乳)中不表達(dá)，并伴隨植物生理狀態(tài)(新葉中高效表達(dá)，老葉中低效表達(dá))進(jìn)行適度表達(dá)。這種新型光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有利于解決轉(zhuǎn)基因水稻中籽實(shí)的食品安全性問(wèn)題，且不影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育。

本發(fā)明還提供上述啟動(dòng)子在培育轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用。

本發(fā)明利用光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子代替組成型啟動(dòng)子，獲得含光誘導(dǎo)啟動(dòng)子的雙元表達(dá)載體；利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將其導(dǎo)入到植物基因組中，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的定向操作，獲得光誘導(dǎo)表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植株。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的含有水稻光誘導(dǎo)啟動(dòng)子載體質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)圖；

圖2本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的啟動(dòng)子p727片段序列示例圖；

圖3本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的重組雙元表達(dá)載體的酶切位點(diǎn)示意圖；

圖4本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的轉(zhuǎn)基因植株的pcr鑒定圖；

圖5本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的轉(zhuǎn)基因水稻的葉片southernblot的鑒定圖；

圖6本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的轉(zhuǎn)基因水稻的葉片光處理后gus染色分析結(jié)果圖；

圖7本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的轉(zhuǎn)基因水稻的葉片、根、種子的gus染色分析結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中選擇并構(gòu)建的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子基因，來(lái)源于水稻rbcs基因及內(nèi)含子序列。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述構(gòu)建的光誘導(dǎo)啟動(dòng)子具有tatabox、caatbox等啟動(dòng)子必需元件、與光應(yīng)答有關(guān)的特異元件g-box(ctttatca)、iboxcore(gataa)、sorlip2at(gggcc)、sorlip1at(gccac)、gt1core(ggttaa)、gt1consensus(grwaaw)等特異元件；并已通過(guò)后續(xù)實(shí)施例驗(yàn)證此啟動(dòng)子具有光誘導(dǎo)特異性及葉片組織特異性，可驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因gusplus在轉(zhuǎn)基因水稻葉片中特異表達(dá)，根、籽實(shí)(胚及胚乳)中不表達(dá)。

所述光誘導(dǎo)啟動(dòng)子的核苷酸序列如seqidno.1所示，全長(zhǎng)序列為417bp；該序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)核苷酸形成的編碼同等功能氨基酸序列的由seqidno.1衍生的核苷酸序列也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

優(yōu)選地，所述水稻為nipponbareofssp.japonicaoforyzasativa(rice)。

本發(fā)明還提供了含上述光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體，優(yōu)選為p-osrbcs-727:gusplus。

以下通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行說(shuō)明，應(yīng)理解以下僅為本發(fā)明的示例性說(shuō)明，并不用于限制本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1水稻光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子p727片段的合成及序列分析

1.啟動(dòng)子克隆

意外地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在水稻日本晴(nipponbareofssp.japonicaoforyzasativa(rice)包含osrbcs基因及內(nèi)含子序列的啟動(dòng)子p727(seqidno.1)，含有多個(gè)光應(yīng)答的順式作用元件以及啟動(dòng)子必需元件，通過(guò)后續(xù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，意外地，啟動(dòng)子p727還具有光誘導(dǎo)、葉片組織特異性，外源基因可在轉(zhuǎn)基因水稻葉片中特異性、適度表達(dá)，根、籽實(shí)(胚及胚乳)中不表達(dá)。

分別在兩端引入hindiii及xbai酶切位點(diǎn)，從水稻基因組中擴(kuò)增出相應(yīng)序列后，人工合成了p727片段。啟動(dòng)子的p727片段為417bp的酶切產(chǎn)物(圖1)，圖中1：雙酶切后的p-osrbcs-727質(zhì)粒，2：p-osrbcs-727質(zhì)粒；m：dnamarker；箭頭指示500bp。

p727片段的序列如seqidno.1所示。合成的片段連接在peasy-bluntsimple載體(購(gòu)自全式金公司)上，獲得p-osrbcs-727質(zhì)粒，并利用此載體上的通用引物對(duì)基因進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示克隆正確。

2.啟動(dòng)子序列分析

利用place數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.dna.affrc.go.jp/place/)進(jìn)行啟動(dòng)子調(diào)控元件分析，啟動(dòng)子p727序列(見(jiàn)圖2)含有tatabox、caatbox等啟動(dòng)子必需元件，與光應(yīng)答有關(guān)的特異元件g-box(ctttatca)、iboxcore(gataa)、sorlip2at(gggcc)、sorlip1at(gccac)、gt1core(ggttaa)、gt1consensus(grwaaw)等特異元件。

實(shí)施例2構(gòu)建轉(zhuǎn)化重組雙元表達(dá)質(zhì)粒(如圖3所示)；

1.提取p1300-gusplusnos和p-osrbcs-727的質(zhì)粒(axygen質(zhì)粒小提試劑盒)。p1300-gusplusnos由pcambia1300雙元表達(dá)載體(購(gòu)自cambia公司)改造所得，在kpni和ecori酶切位點(diǎn)間加入gusplus-nos基因，上游無(wú)啟動(dòng)子序列。

2.限制性內(nèi)切酶hindiii、xbai(購(gòu)自neb公司)雙酶切p1300-gusplusnos質(zhì)粒與p-osrbcs-727質(zhì)粒。

3.膠回收(axygen膠回收試劑盒)p1300-gusplusnos酶切質(zhì)粒、啟動(dòng)子p727片段，16℃連接30分鐘(t4連接酶，購(gòu)自neb公司)，轉(zhuǎn)化至全式金公司生產(chǎn)的trans10感受態(tài)細(xì)胞中，涂板挑陽(yáng)性克隆，利用啟動(dòng)子擴(kuò)增引物測(cè)序驗(yàn)證，獲得含植物表達(dá)載體p-osrbcs-727:gusplus的陽(yáng)性克隆。

實(shí)施例3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的陽(yáng)性檢測(cè)

將實(shí)施例2中構(gòu)建好的植物表達(dá)載體p-osrbcs-727:gusplus利用冷激法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株eha105(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)慧贈(zèng)),然后侵染粳稻品種日本晴(nipponbareofssp.japonicaoforyzasativa(rice))成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織。

共培養(yǎng)后用50mg/l潮霉素篩選。

水稻組織培養(yǎng)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化以及抗性愈傷組織的篩選與植株再生等操作參照本領(lǐng)域通用方法。

陽(yáng)性植株用pcr法進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè),引物均為gusplus基因內(nèi)部引物(見(jiàn)下)。產(chǎn)物大小為400bp。

gusplus-f:5'-tagtttttctccttcattttct-3'seqidno2；

gusplus-r:5'-gcttgttacgaatgacttttccgag-3'seqidno3。

pcr反應(yīng)條件:94℃10min；94℃30s,55℃30s,72℃1min30s,45個(gè)循環(huán)；72℃10min。pcr檢測(cè)陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株，如圖4所示，圖中1：p-osrbcs-727:gusplus質(zhì)粒；m：dnamarker；2-9：p-osrbcs-727:gusplus潮霉素抗性轉(zhuǎn)基因植株；10-17，p1300-gusplusnos潮霉素抗性轉(zhuǎn)基因植株；18-21：未轉(zhuǎn)化植株。箭頭指示500bp。

利用southernblot進(jìn)行外源基因?qū)肟截悢?shù)檢測(cè)，檢測(cè)基因?yàn)間usplus26-621。鑒定結(jié)果如圖5所示，圖中1：dnamarker；2：非轉(zhuǎn)基因水稻(日本晴)；3：陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p1305(陽(yáng)性對(duì)照，僅含pcambia1305雙元表達(dá)載體(購(gòu)自cambia公司)，其中含gusplus–nos基因，上游含camv35s啟動(dòng)子)；4：陽(yáng)性質(zhì)粒p1300-gusplusnos；5：陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p-osrbcs-727:gusplus；6-7：陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p1300-gusplusnos轉(zhuǎn)基因水稻；8-9：非轉(zhuǎn)基因水稻(日本晴，nipponbareofssp.japonicaoforyzasativa(rice))。

實(shí)施例4gus組織化學(xué)分析

1.陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻不同組織gus組織化學(xué)分析

每種構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因水稻植株中分別取10株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻植株，取葉片、根和種子,切成適當(dāng)大小或進(jìn)行組織切片,浸入適量的gus染液(1.0mmx-gluc,50mmol/lpbs(ph7.0),2mmedta,0.12％tritonx-100,20％甲醇，0.4mm亞鐵氰化鉀，0.4mm鐵氰化鉀)中,37℃放置過(guò)夜至顯色；然后用75％酒精脫色后,觀察拍照。

2.暗培養(yǎng)及光誘導(dǎo)下葉片組織gus組織化學(xué)分析

1)暗培養(yǎng)：每種構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因水稻植株中分別取10株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻，暗培養(yǎng)5天，取黃化的葉片,切成適當(dāng)大小,浸入適量的gus染液(1.0mmx-gluc,50mmol/lpbs(ph7.0),2mmedta,0.12％tritonx-100,20％甲醇，0.4mm亞鐵氰化鉀，0.4mm鐵氰化鉀)中,37℃放置過(guò)夜至顯色；然后用75％酒精脫色后,觀察拍照。

2)光誘導(dǎo)：光培養(yǎng)(30度12h，25度12h,光照強(qiáng)度為600umol/(m²·s))1、3、5天，取同一葉片的其余部分，切成適當(dāng)大小,浸入適量的gus染液(1.0mmx-gluc,50mmol/lpbs(ph7.0),2mmedta,0.12％tritonx-100,20％甲醇，0.4mm亞鐵氰化鉀，0.4mm鐵氰化鉀)中,37℃放置過(guò)夜至顯色；然后用75％酒精脫色后,觀察拍照

結(jié)果如下：

如圖6所示，圖6a為正常光照下的葉片，1-4是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p1300-gusplusnos的葉片，染色后沒(méi)有變藍(lán)；5-8是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p-osrbcs-727:gusplus的葉片，染色后變藍(lán)；9-12是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p1305的葉片，染色后變藍(lán)。圖6b為暗培養(yǎng)5d后的葉片，1-3是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p1300-gusplusnos的葉片(黃化葉)，染色后沒(méi)有變藍(lán)；4-6是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p-osrbcs-727:gusplus的葉片(黃化葉)，染色后沒(méi)有變藍(lán)；9-12是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p1305的葉片(黃化葉)，染色后變藍(lán)。圖6c為光誘導(dǎo)14小時(shí)后的葉片，a行1-5是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p1300-gusplusnos的葉片(暗處理同片葉片，綠色部分)，染色后未變藍(lán)；b行1-2是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p1300-gusplusnos的葉片(暗處理同片葉片，綠色部分)，b行3是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p1300-gusplusnos的葉片(暗處理同片葉片，黃色部分)，染色后未變藍(lán)；c行1-2是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p-osrbcs-727的葉片(暗處理同片葉片，綠色部分)，染色后變藍(lán)，c行3-5是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p-osrbcs-727:gusplus的葉片(暗處理同片葉片，黃色部分)，染色后未變藍(lán)；d行1-5是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p1305的葉片(暗處理同片葉片，綠色部分)，染色后變藍(lán)。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例4中陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因水稻的葉片、根、種子的gus染色分析結(jié)果。圖中a行是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p1300-gusplusnos的葉片，1-4為新生葉片，5-7為外側(cè)未黃老葉，染色后均沒(méi)有變藍(lán)；b行是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p-osrbcs-727:gusplus的葉片，1-4為新生葉片，5-7為外側(cè)未黃老葉，染色后新生葉片變藍(lán)明顯，老葉中僅維管束部位有變藍(lán)；c行是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p-osrbcs-727:gusplus的根，染色后均沒(méi)有變藍(lán)；d行是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p-osrbcs-727:gusplus的種子(無(wú)外殼，縱切)，染色后胚乳、胚芽均沒(méi)有變藍(lán)；e行是陰性對(duì)照非轉(zhuǎn)基因水稻的葉片，1-4為新生葉片，5-7為外側(cè)未黃老葉，染色后均沒(méi)有變藍(lán)；f行是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p1305的葉片，1-4為新生葉片，5-7為外側(cè)未黃老葉，染色后均變藍(lán)；g行是轉(zhuǎn)基因植株p1305的根，染色后有輕微變藍(lán)；h行為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株p1305的種子(無(wú)外殼，縱切)，染色后部分胚乳及胚芽均變藍(lán)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

sequencelisting

<110>江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>一種光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子基因及其應(yīng)用

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>417

<212>dna

<213>水稻nipponbareofssp.japonicaoforyzasativa(rice)

<400>1

cggtggcaggtaggagagggtctcgaacttcttgatgccctcaatcggccacacctaaat60

aaacgataattgaattattggttaatgttgaagaagaagaagaagaagaagaagaagaag120

aagaagaataatgtgtgttgggtcagtaggttattacctgcatgcacctgatcctgccgc180

cattgctgacgttgccgaagctggagttgccggagcggcgggcgacgggcatgccggcgg240

tggacttgagcccctggaagggagcgacggtggtggccgacgacgccatcacggaggggg300

ccatctctgcagctcaccaagctctctccttctttgctcgagtacttcttgagatgcact360

gctctgcacacaggctcccgcggtacgtataaatagccaaaactcagcggatcggat417

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tagtttttctccttcattttct22

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gcttgttacgaatgacttttccgag25